Nous exprimons notre gratitude à Woo-Jin Chang pour fournir des canaux pour le DEP trifurcating actionnement et à Mitchell Collens pour son aide dans l&#39;installation des équipements. Le travail a été soutenu par la NSF américaine par le biais de subvention OISE-0951647 et par Taiwan NSC travers Grant 99-2911-1-002-007.

Un schéma général de la configuration de l&#39;équipement est montré dans la figure 1A. L&#39;assemblage PCB-échantillon est détaillée dans un schéma en coupe de la figure 1B. 1. Préparation des électrodes PCB: <ol><li> PCB Design électrodes à la géométrie désirée pour générer un champ électrique non uniforme. Personnalisé puces électrode PCB peuvent être commandés par des installations de fabrication commerciale (figure 1C). </li><li> Préparer préfabriqués électrodes PCB par soudage de calibre 16 fil à la fin de chaque électrode métallique imprimé (figure 1D). <ol><li> Placez le fil à l&#39;extrémité de l&#39;électrode. Tenez le fil en place sur la partie métallique du PCB avec le fer à souder chaud pour chauffer le fil. </li><li> Nourrir un peu de soudure sur le fil chauffé à remplir le fil avec de la soudure. </li><li> Après le fil est rempli avec de la soudure, enlever le fer à souder, maintient le fil en place pendant la soudure se refroidit. </li></ol></li><li> Répétez le processus de soudage pour chaque raccordement électrique sur le PCB (figure 1D). </li></ol> 2. Préparer canaux microfluidiques: <ol><li> Polydiméthylsiloxane (PDMS) basé canaux microfluidiques sont préparés en utilisant l&#39;élastomère PDMS, Sylgard 184 de Dow Corning. Un moule maître qui définit les canaux sont généralement créées par des procédés de microfabrication standard en utilisant une plaquette de silicium et de résine photosensible SU-8. </li><li> Mélanger composé de base à l&#39;agent de durcissement à un ratio de 10:1 pour 5 minutes. </li><li> Verser le liquide PDMS sur le moule préfabriqué SU-8 maîtriser et éliminer les bulles d&#39;air en exposant liquide PDMS au vide pendant quelques minutes. Répétez le processus si nécessaire sous vide pour éliminer complètement toutes les bulles. </li><li> Guérissez les PDMS à 70 ° C pendant 2 heures. </li><li> Retirez la dalle avec des canaux microfluidiques en PDMS de la plaquette avec une lame de rasoir, attention à ne pas casser la plaquette. </li><li> Percez des trous pour l&#39;introduction de liquides et de cellules dans le dispositif microfluidique. (Remarque: Seringue de pompage, gravité ou la tension superficielle de débit basée peuvent tous être utilisés avec DEP). </li><li> Inspectez le dispositif microfluidique afin de s&#39;assurer qu&#39;elle est exempte de poussière et de débris. Nettoyage du PDMS peuvent facilement être réalisé en utilisant ruban 3M Scotch Magic. </li><li> Plasma coller les canaux microfluidiques en PDMS à un nettoyage No.0 épaisseur (80 à 130 um) lamelle. Chauffer l&#39;assemblage lamelle-microfluidique à 100 ° C pendant un minimum de 15 min. </li></ol> 3. Préparer les médias à faible conductivité-: <ol><li> Faible conductivité des médias est préparée en mélangeant 8,5% de saccharose glucose + 0,3% (p / v) dans déminéralisée (DI) d&#39;eau 1. Remarque:. Nous avons déjà démontré que les cellules peuvent être cultivées pendant des jours dans les milieux de culture conventionnels cellule après avoir été exposés à une faible conductivité pour de courtes périodes (environ 30 min) 11 </li></ol> 4. Assemblez canaux microfluidiques sur des électrodes du circuit imprimé: <ol><li> Placer une petite quantité (environ 10 pi) de l&#39;huile minérale sur le PCB pour assurer un contact étroit entre le PCB et la lamelle. Remarque: Une étape facultative pour diminuer la visualisation de l&#39;électrode est de recouvrir la surface PCB avec une très fine couche de feutre indélébile noir ou peinture. </li><li> Placez l&#39;ensemble de canal lamelle-microfluidique sur le PCB huilé, avec contact lamelle formant avec l&#39;huile (lamelle vers le bas). Appuyez doucement sur l&#39;assemblage lamelle-microfluidique vers le bas pour assurer un bon contact et de minimiser les bulles d&#39;air qui peuvent nuire à la cellule et la visualisation de perles. Un exemple de dispositif complété est montré dans la figure 1D. </li></ol> 5. Trier et concentré Perles et Cellules utilisant DEP: <ol><li> Remplissez les canaux microfluidiques avec de l&#39;eau DI ou à faible conductivité des médias, le processus de collage de plasma facilite le chargement facile des solutions aqueuses dans les canaux microfluidiques par temporairement rendant la surface hydrophobe normalement PDMS hydrophile. </li><li> Introduire des cellules et / ou des billes de polystyrène dans le réservoir de canal (figure 1C). Ici, nous utilisons un adénocarcinome du côlon humain (HT-29) cellules. </li><li> Connectez la sortie d&#39;un générateur de fonctions à l&#39;entrée d&#39;un amplificateur d&#39;alimentation, puis branchez la sortie de l&#39;amplificateur aux fils de l&#39;électrode. Couvrir tous les fils électriques et des surfaces de l&#39;installation avec du ruban électrique pour protéger les utilisateurs de l&#39;exposition potentielle à un choc. Un diagramme schématique de la configuration du matériel est montré dans la figure 1A. </li><li> Régler le générateur de fonctions pour produire une sortie d&#39;onde sinusoïdale de 1,0-1,5 MHz. L&#39;amplitude de la sortie doit être ajustée pour l&#39;amplificateur de puissance RF pour produire une puissance de 80-100V à la carte. L&#39;amplificateur de puissance RF dans ce travail nécessite une tension d&#39;entrée autour de 220 à 330 mV. Pour séparer les cellules et les perles, le taux d&#39;écoulement laminaire doit être conforme à la force DEP pour passer des cellules et des perles dans le canal principal (largeur w = 100 um, la hauteur h = 27 um) dans les canaux de cible (largeur w = 100 um , hauteur h = 27 m). Attention: consulter le fabricant de PCB pour déterminer les mtensions de fonctionnement MAXIMALE pour éviter des problèmes tels que la surchauffe des PCB ou de fusion. Vérifiez les spécifications du fabricant de l&#39;équipement pour le générateur de fonctions et de fabricants d&#39;amplificateurs de puissance pour déterminer les paramètres d&#39;exploitation sûre. </li><li> Initier DEP pour trier les cellules et les perles. Cellules expérience positive-DEP alors des billes de polystyrène expérience d&#39;un négatif-DEP dans un domaine non-électrique uniforme dans les fréquences spécifiées. Cela permet DEP-force-activé bioactuation et de séparation des cellules et d&#39;autres particules dans des dispositifs microfluidiques en utilisant les PCB abordable et réutilisables comme électrodes. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Lorsque DEP est efficace à des cellules d&#39;actionnement ou de particules, un alignement robustes au sein non uniforme des champs électriques est observée pour les bains statiques ou vitesses de fluide lent. Dans des conditions de vitesses de fluide plus élevée, le comportement des cellules ou des particules dépend de l&#39;orientation relative de l&#39;écoulement axial du champ électrique et la vitesse d&#39;écoulement. En outre, les comportements de cellules et de particules sont également tributaires de l&#39;intensité du champ électrique et le degré de non-uniformité dans le domaine électrique. Les comportements typiques des cellules ou des particules comprennent des chaînes de perles, le cyclisme, décrochage, ou de tourner. Affections qui compromettent ou abolir DEP comprennent la présence de sels ou d&#39;autres molécules dans le liquide ionique, faible intensité de champ électrique, les vitesses d&#39;écoulement excessif, des lamelles qui sont trop épais, ou des solutions conducteur entre la lamelle et les électrodes PCB (par exemple une lamelle craqué peut induire le mélange d&#39;eau et d&#39;huile minérale). Ici, lorsque vous utilisez No.0 lamelles d&#39;épaisseur (80 à 130 um) et une distance entre les électrodes d&#39;(231 um), le gradient du carré de l&#39;intensité du champ électrique appliqué à la-29 cellules HT et des perles est estimé à entre 2 -8 à 6 -8 V 2 / um 3 1. La force DEP peut être estimée en mesurant la vitesse de la particule, manipulés par des DEP dans un fluide statique (Figure 2A-B). En raison de la faible inertie de la particule et de l&#39;environnement très visqueux du canal microfluidique, la force de traînée hydrodynamique sera égal à, mais en sens inverse avec la force DEP. La vitesse moyenne de billes dans la faible conductivité des médias est de 34,5 um / s avec une tension de 93 Vcc DEP et de 1,5 MHz. La force de traînée hydrodynamique peut être calculée avec l&#39;équation suivante 1. F = glisser 6πηRv La viscosité moyenne η des médias faible conductivité à 20 ° C est de 1,27 mPa • s et le rayon R est de 7,5 um perles. La force de traînée hydrodynamique pour la microbille en polystyrène est estimé à 6,19 pN. Afin de démontrer la capacité d&#39;actionner des perles dans les canaux microfluidiques (figure 2C-F), nous avons lancé le débit de la faible conductivité des médias-en employant des flux médiation tension de surface. La vitesse moyenne de billes dans le canal d&#39;entrée unique a été 1540 um / sec, tandis que la vitesse moyenne dans les canaux individuels a été réduit à 565 um / sec (figure 2C). En initiant DEP, les billes ont été retenus dans le canal central, plutôt que d&#39;être rejetées dans le canal latéral. Ainsi, dans ces conditions, les forces de DEP ont été suffisantes pour surmonter la force de traînée du fluide dans les deux canaux latéraux. Le même principe a également été utilisé pour détourner les perles de la Cannel au centre d&#39;un canal latéral simple en changeant simplement l&#39;orientation des canaux et les flux de talon à celle des électrodes PED (Figure 2E-F). En inclinant le électrode métallique sur le côté du canal d&#39;entrée unique, quand DEP a été lancé, les billes ont été guidés vers le côté de la chaîne comme les perles approché le point de bifurcation. Là, les forces de DEP ont été suffisantes pour tirer les billes dans l&#39;un des canaux secondaires, où le flux laminaire continué à les propulser vers le canal (figure 2F). Parce que les cellules et les billes de polystyrène ont de nettes différences dans leur capacité à être polarisée et actionné au non-uniforme des champs électriques, nous utilisons DEP afin de démontrer la capacité d&#39;effectuer la séparation sur-puce de cellules et de perles, simultanément. Nous avons utilisé la structure même canal microfluidique et les électrodes PCB tel que configuré dans la figure 2E-F, mais introduit une suspension de cellules HT-29 et des perles de faible conductivité des médias dans le canal d&#39;entrée unique (figure 3). Lorsque le DEP est introduit, et dans ces conditions, le HT-29 cellules ont été conservées dans les deux canaux de sortie gauche, alors les billes ont été retenus dans le canal de sortie individuelle sur la droite. Ici, les cellules ont un comportement caractéristique «perle de chaînage» comme elles sont collectées dans le canal de sortie gauche. Parfois un bourrelet et la cellule sont attachés ensemble dans lequel ils sont rassemblés, souvent dans les canaux de sortie de la cellule. De cette expérienceal de données, nous déterminons le taux de tri à 713 particules (cellules et des perles) par minute, soit l&#39;équivalent de 14 260 cellules et des perles en 20 minutes. Le nombre de cellules et de perles trouvés utiles et pertinentes pour la biologie moléculaire, l&#39;imagerie, biochimiques et de laboratoire-sur-une-puce applications. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. PCB-DEP, des cellules et des particules dans les canaux microfluidiques. (A) La configuration de l&#39;équipement pour le DEP basé actionnement commence par un générateur de fonctions pour définir la fréquence et l&#39;amplitude du signal électrique, puis un amplificateur de puissance pour augmenter la puissance du signal du champ électrique généré sur le PCB. (B) L&#39;Assemblée dispositif microfluidique pour l&#39;actionnement de l&#39;échantillon se compose de canaux microfluidiques en PDMS irréversiblement lié à un pas. 0 épaisseur (80 à 130 um) lamelle grâce à un plasma d&#39;oxygène, non conducteurs de se baigner les cellules et / ou des perles. (C) Les électrodes PCB utilisé ici se composent de deux régions où les électrodes sont interdigitées pour générer une forte non-uniforme du champ électrique. (D) Le dispositif complété: un PCB avec un dispositif microfluidique trifurqué sur une lamelle unique encart montre l&#39;ensemble du dispositif avec des fils de l&#39;électrode. (CD) Pour l&#39;échelle, les mesures de PCB sont de 8,4 cm (l), 2,1 cm (W), avec 5 mm de large électrodes. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Images représentant des cellules et des perles dans les canaux avant et pendant DEP actionnement. (A) 15 perles um polystyrène fluorescentes dans une solution à faible conductivité des médias dans un canal microfluidique en PDMS, sans flux laminaire (temps écoulé, de 1,23 sec.) (B) Dès l&#39;initiation du DEP, les billes migrer vers les modèles d&#39;électrodes PCB (bandes noires) plutôt que entre les électrodes (temps écoulé, 8,18 sec.) (C) Perles dans les mêmes canaux sous flux laminaire sont répartis entre les trois canaux séparés (le temps écoulé, 5,3 sec), lorsque le DEP est lancé (D), les billes sont actionnés seulement la circulation dans le canal central (temps écoulé, 4.3 sec). (E) En changeant l&#39;orientation des chaînes aux électrodes PCB, les perles peuvent être différemment dirigée vers les canaux latéraux (F) en utilisant DEP plutôt que le canal central, comme indiqué dans (D). (EF) Le temps écoulé est 8.23 ​​sec et 5.16 sec, respectivement. Toutes les barres d&#39;échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Images représentant des cellules et des perles dans les canaux avant et pendant DEP actionnement. (AB) Avant d&#39;entreprendre DEP, une solution mixte d&#39;adénocarcinome du côlon humain (HT-29) et le flux des cellules perles d&#39;un canal à trois canaux de sortie séparés. La flèche ouverte identifie le sens d&#39;écoulement laminaire et les canaux sont décrits avec des lignes pointillées pour l&#39;orientation et des éclaircissements. (CD) par DEP induisant, de perles et les cellules sont sélectivement actionné en canaux séparés identifiés. Cellules HT-29 de sortie du canal central et gauche, tandis que la sortie des perles sur le canal droit. Chaînage perle des perles et des caractéristiques des cellules est observée au cours du DEP actionnement. (A, C) d&#39;imagerie de contraste interférentiel différentiel des cellules et des perles dans des microcanaux rend les perles facilement visibles. Glow Images échelle d&#39;intensité (B, D) des mêmes images DIC (A, C) d&#39;améliorer la visualisation des cellules dans les canaux. Les électrodes en métal réfléchissant ((A, C) à bande légère et (B, D) jaune et vert) fournissent un point de repère important pour l&#39;alignement des microcanaux aux électrodes pour les PED efficaces à base d&#39;actionnement. Barres d&#39;échelle = 100 pm.

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La manipulation des cellules dans des dispositifs microfluidiques est souhaitable pour le tri ou le placement sélectif de cellules individuelles ou pour les études de population. 2 à flux laminaire est utilisée en conjonction avec des vannes et des pompes pour manipuler des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. Cependant, ces méthodes seules sont difficiles et nécessitent des procédés de fabrication détaillées et les compétences 3 centrifugation permet de simplifier les exigences pour le placement des cellules, mais l&#39;imagerie simultanée constitue un défi;. Par ailleurs, l&#39;architecture de canal pour la centrifugation doit être considérer attentivement lors de la conception des manipulations souhaitées et compte tenu des effets des forces centripètes. 4 pinces laser peut être utilisé pour le placement des cellules, mais la méthode est coûteuse et ne se prêtent pas au tri cellulaire à haut débit. 5 Pourtant, la DEP a été démontré comme un système efficace de «pinces électriques&quot; pour le placement de cellule effective, la caractérisation et la manipulation 6,7. Plus précisément, la DEP a été utilisé pour la capture sélective et le tri des cellules sur puce pour le traitement des cellules vivantes et mortes, 7-10 et pour recueillir des cellules sur des capteurs de résonance pour la mesure de la masse cellulaire. 11 Nous avons déjà démontré que, en augmentant le DEP vigueur sur les bactéries ou les perles dessus de la force de traînée fluidique, la concentration sur la puce et le piégeage des billes de polystyrène et de Listeria monocytogenes V7 peut être accompli. 12 populations mixtes de E. coli et L. bactéries monocytogenes peut également être réalisé et publié grâce à des impulsions DEP. Par ailleurs, les grosses particules peuvent être capturées différemment et concentrée sur les électrodes sur la base des particules de grande taille, alors que les petites particules ne sont pas la capture mais ils sont retirés avec l&#39;écoulement fluidique. 13 Quand les forces DEP ne surmontent pas les forces fluidiques traînant sur ​​les particules, les perles ou de la cellule n&#39;est pas capturé, mais plutôt déplacée dans le courant fluidique. Comme le montre la figure 2C, perles peuvent être concentré dans la région centrale du courant de fluide suffisante pour retenir les perles dans le canal central. Cela pourrait être dû à l&#39;effet combiné de la particule-particule au sein de l&#39;influence du champ électrique, vitesses de fluide plus grande que les forces DEP traînant, la combinaison de ces derniers, ou quelque autre effet indéfini. Les nouvelles avancées dans DEP contact permettent de maximiser la capture et la manipulation de cellules avec le champ minimum requis, protégeant ainsi les types de cellules, la plus grande mesure, lors de la manipulation du DEP. DEP 1,9 Contactless promets offre à la communauté de la microfluidique pour le tri, la collecte et le positionnement des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. Nous prévoyons que la demande accrue pour, et l&#39;application de la DEP pour la manipulation au sein de dispositifs microfluidiques, de nouvelles découvertes et innovations élargira la compréhension et l&#39;influence des forces de DEP. Les PCB peuvent être fabriqués par des procédés à haut volume à un prix abordable avec un délai de fabrication rapide, ce qui les rend bonnes plateformes pour la commercialisation. En outre, les PCB sont faciles à utiliser et accessible pour les scientifiques dans un éventail de disciplines pour des manipulations de cellules sur puce et de tri. Lors de l&#39;aménagement des électrodes contenant des BPC, il faut tenir compte de la désirée de particules / cellule trajectoire. Les facteurs clés à considérer sont la taille des particules et le type (perles et / ou cellulaire), le type de cellules, la taille de microcanaux, vitesse d&#39;écoulement, l&#39;espacement des électrodes (qui détermine l&#39;intensité du champ électrique), l&#39;épaisseur de la lamelle, et la conductivité du fluide. Ces facteurs influencent la force nécessaire et disponible pour manipuler la particule ou cellule, et, finalement, l&#39;efficacité de séparation. Notre protocole présenté ici démontre une configuration efficace pour initier DEP pour microsphères et de séparation des cellules. Pour les applications potentielles, les utilisateurs doivent correspondre à l&#39;architecture de la conception canal microfluidique avec les chemins de débit souhaité pour les cellules et les perles, ainsi que les motifs d&#39;électrodes afin d&#39;optimiser l&#39;efficacité de chaque application. Distance entre les électrodes et l&#39;épaisseur de la lamelle peut être utilisé selon les directives précédemment rapportés lors de la conception de l&#39;aménagement canal microfluidique 1. La conductivité et la permittivité de la cellule / de particules et le milieu environnant doit être suffisamment différentes pour faciliter le DEP positive ou négative, tout en gardant les cellules intactes. La polarité du DEP pour une particule sphérique peut être déterminée à partir de la partie réelle d&#39;une valeur complexe des éléments suivants de Clausius-Mosotti facteur à l&#39;ω la fréquence de la tension de la DEP. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> L&#39;équation 1 Dans cette équation ε est la permittivité, σ est la conductivité, et ε * est permittivité complexe. Les indices p et mdésignent les particules et les médias, respectivement. Quand une cellule a une plus forte permittivité que les médias, ou la partie réelle du facteur de Clausius-Mosotti devient positive, la particule devient plus polarisé que le milieu environnant. Grâce à un champ électrique non uniforme, la polarisation de la particule devient non uniforme et cela crée un DEP positive (+ DEP) la force qui attire la cellule vers la région avec une intensité plus élevée du champ électrique. Si une cellule a une faible permittivité que le milieu environnant, ou la partie réelle du facteur de Clausius-Mosotti devient négative, il va subir DEP négatif (-DEP), et la cellule est forcée vers la région du champ minime. Si la cellule et les médias ont à peu près la même permittivité complexe, aucune force ne peut être généré à manipuler la cellule. Pour cette raison, l&#39;eau pure est un support privilégié pour la manipulation de particules DEP. Cependant, pour éviter le stress osmotique sur la cellule de l&#39;eau pure, des médias à faible conductivité a été formulé pour maintenir la conductivité inchangé, mais d&#39;augmenter l&#39;osmolarité pour diminuer le stress osmotique vers les cellules. Conventionnel milieux de culture cellulaire ou des tampons physiologiques, tels que DMEM ou PBS, ont une conductivité élevée, ce qui n&#39;est pas adapté pour la manipulation du DEP. Nous avons aussi précédemment démontré que les cellules peuvent être capturées sur des capteurs avec DEP en utilisant les médias faible conductivité. Après une brève période pour la fixation des cellules, des médias à faible conductivité peut être remplacé pour les médias nécessaires culture cellulaire pour soutenir la croissance de cellules pour les jours de 11. De notre expérience, des perles fluorescentes sont très lumineuses à l&#39;égard de la fluorescence de cellules vivantes, donc il peut être un défi pour correspondre à l&#39;intensité bourrelet à l&#39;intensité d&#39;une cellule vivante et fluorescentes. Pour améliorer la visualisation à la fois des cellules et les perles, nous avons utilisé la microscopie DIC sur un microscope droit pour l&#39;imagerie à la fois. Pour afficher les cellules et les perles, nous avons présenté les données à une intensité d&#39;éclat-échelle de l&#39;image, qui conserve les données dans un large spectre de couleurs pour faciliter la visualisation. Ainsi, lors de la conception de l&#39;étude d&#39;intérêt, les paramètres d&#39;imagerie et les ressources doivent être considérés. En résumé, nous démontrons la capacité d&#39;actionner sélectivement les perles et les cellules en canaux séparés à l&#39;aide du DEP. Avec l&#39;utilitaire croissant de canaux microfluidiques pour la biologie cellulaire, la biochimie et les applications de bio-ingénierie, DEP est une option souhaitable pour la collecte de cellules, de placement et de tri. La fabrication des PCB électrodes est peu coûteux et pratique, les électrodes sont faciles à utiliser, et le temps de fabrication rapides sont idéales pour l&#39;application de la DEP.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard 184 kit (PDMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elsworth Adhesives</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>Dow Corning Sylgard</td>
</tr>
<tr>
<td>16 awg hook-up wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Belden</td>
<td>8521</td>
<td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold seal Cover Glass </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>260320</td>
<td>No. 0 thick, 24 x 60 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Miltex Biopsy Punch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>95039-104</td>
<td>Miltex, assorted sizes</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom PCB electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bay Area Circuits </td>
<td>Custom parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>O121-1 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>House DI water supply</td>
<td>None</td>
<td>Use filtered DI water</td>
</tr>
<tr>
<td>D-Glucose Anhydrous Granular AR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals </td>
<td>4912-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose, Crystal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>8360-06 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent polymer microspheres </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Bangs Laboratories</td>
<td> FS07F/9277</td>
<td>15&mu;m Dragon green microspheres</td>
</tr>
<tr>
<td>HT-29 cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>HTB-38D</td>
<td>Human colon adenocarcinoma</td>
</tr>
<tr>
<td>Typsin 0.05% EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>25300054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eclipse E600FN upright microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Nikon</td>
<td>Eclipse E600FN </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phantom V310 High-speed imaging camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phantom</td>
<td> V310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BX51 upright research microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus </td>
<td>BX51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpotFlex high resolution color camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diagnostic Instruments </td>
<td>FX1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Function generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent </td>
<td>3325A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RF Power amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EIN</td>
<td>2100L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar flow

Dispositifs microfluidiques ont avancé des études cellulaires en fournissant un environnement dynamique fluidique sur l&#39;échelle de la cellule pour étudier, manipuler, trier et compter les cellules. Cependant, la manipulation de la cellule au sein du domaine fluidique reste un défi et nécessite des protocoles de fabrication complexe pour former des valves et des électrodes, ou les demandes d&#39;équipement spécialisé comme des pinces optiques. Ici, nous démontrons que conventionnelles cartes de circuits imprimés (PCB) peuvent être utilisés pour la manipulation sans contact de cellules en employant diélectrophorèse (DEP) pour la manipulation des billes et des cellules dans les champs de flux laminaire pour bioactuation, et pour la séparation des cellules et billes de microfluidique multicanaux périphériques. Tout d&#39;abord, nous présentons le protocole pour l&#39;assemblage des électrodes DEP et dispositifs microfluidiques, et la préparation des cellules pour le DEP. Ensuite, nous caractérisons l&#39;opération DEP avec des billes de polystyrène. Enfin, nous montrons des résultats représentatifs de la séparation de perles et de cellules dans un dispositif multicanal microfluidique. En résumé, la DEP est une méthode efficace pour manipuler des particules (billes ou de cellules) dans des dispositifs microfluidiques.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Diélectrophorèse (DEP) est une méthode efficace pour manipuler des cellules. Cartes de circuits imprimés (PCB) peuvent fournir des électrodes bon marché, réutilisables et efficace pour la manipulation sans contact des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. En combinant PDMS basée sur des canaux microfluidiques avec des lamelles sur les PCB, nous démontrons la manipulation de billes et de cellules et de séparation au sein multicanal dispositifs microfluidiques.

Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

separating-beads-cells-multi-channel-microfluidic-devices-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.3K vues.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Diélectrophorèse (DEP) est une méthode efficace pour manipuler des cellules. Cartes de circuits imprimés (PCB) peuvent fournir des électrodes bon marché, réutilisables et efficace pour la manipulation sans contact des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. En combinant PDMS basée sur des canaux microfluidiques avec des lamelles sur les PCB, nous démontrons la manipulation de billes et de cellules et de séparation au sein multicanal dispositifs microfl...

Vidéo: Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Recherche

Bio-ingénierie

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-étape Hauteur variable photolithographie pour dispositifs microfluidiques à valve Multilayer

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour les immunoessais

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d&#39;oxygène

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...