This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.

1. Conception et fabrication de la puce MDF <ol><li> Dessiner un motif de couche acrylique individuelle en utilisant des logiciels commerciaux, tels que AutoCAD, et sauvegarder le motif. <ol><li> Revoir la conception du motif de feuille d&#39;acrylique à quatre couches de la figure 1A et confirmer les connexions inter-couches. </li></ol></li><li> Fabriquer toutes les feuilles d&#39;acrylique et de l&#39;adhésif double-face par ablation laser en utilisant un Traceur laser CO 2 (figures 1B, 2A et 2B). 16 <ol><li> Allumez le Traceur laser et raccorder l&#39;appareil à l&#39;ordinateur portable contrôle. </li><li> Exécutez le logiciel commercial et ouvrir le modèle conçu à l&#39;étape 1.1 en cliquant sur &quot;fichier de signatures conçu.&quot; </li><li> Placez un morceau de feuille d&#39;acrylique blanc ou ruban adhésif double face sur la scène XYZ du Traceur laser. </li><li> Réglez la focalisation du faisceau laser sur la surface de la feuille acrylique ou un adhésif double face avec une auto-alignmenT Stick fourni par le fabricant du Traceur laser. </li><li> Envoyer le modèle conçu pour le Traceur laser pour l&#39;usinage direct de la feuille acrylique ou un adhésif double face. </li></ol></li><li> Retirez le papier protecteur des plaques acryliques en utilisant une pince et souffler la surface avec de l&#39;azote gazeux. </li><li> Empiler les feuilles acryliques et les lier ensemble sous une pression de 2 kg / cm 2 dans un dispositif de liaison thermique pendant 45 minutes à 110 ° C pour former l&#39;ensemble de canal d&#39;écoulement stimulation / électrique. </li><li> Préparer la lamelle de microscope en tant que substrat de culture de cellules dans la puce. <ol><li> Mettez le couvercle en verre dans un bocal de coloration et de remplir le pot avec une dilution de dix fois du détergent répertorié dans la liste des matériaux. </li><li> Mettez le couvercle en verre et le bocal de coloration dans un Steri-nettoyeur ultrasonique et nettoyer le cache de verre pour 15 min. </li><li> Verser le détergent dilué dans le pot de coloration, remplir le pot avec de l&#39;eau distillée, et répétez l&#39;étape 1.5.2 ou 3 fois. </li><li> Sécher le couvercle en verre nettoyé en soufflant avec de l&#39;azote gazeux avant d&#39;adhérer à l&#39;adhésif double face. </li></ol></li><li> Adhérer le couvercle en verre nettoyé à l&#39;écoulement ensemble de canal de stimulation / électrique avec le ruban adhésif double face à motifs à l&#39;étape 1.2. </li><li> Adhérer 13 morceaux de adaptateurs acryliques aux ouvertures individuelles dans la couche 1 de l&#39;assemblage de puce MDF avec la super glue. L&#39;ensemble de puce MDF est alors terminée (figure 2D). </li><li> Stériliser l&#39;assemblage complet de la puce MDF avec 30 min d&#39;irradiation UV avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. configuration du pont réseau Sel de la Chip MDF <ol><li> Avant utilisation, stériliser tous les tubes en plastique, noix de doigts serrés, et microtubes présentés dans la figure 3B en fixant un temps de maintien de 15 min à 121 ° C dans l&#39;autoclave. </li><li> Connecter les tubes en plastique fluoré (figure 3B-i) à l&#39;Assemblée de la puce MDF par l&#39;entrée moyenet des adaptateurs de sortie présentés dans la figure 1A. </li><li> Branchez le cône Luer de l&#39;entrée de fluide et la sortie des tubes en plastique dans la figure 3B-i à 3 voies robinets. </li><li> Prendre 2,5 ml de CO 2 -equilibrated saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une seringue de 3 ml et relier la seringue au robinet d&#39;arrêt à 3 voies d&#39;entrée du tube en matière plastique. Connectez un vide 3 ml seringue au robinet à 3 voies du tube de sortie en plastique. Les deux seringues sont ainsi interconnectés via la puce MDF. REMARQUE: Incuber le PBS dans le 37 ° C 5% CO 2 incubateur de culture cellulaire O / N CO 2 pour obtenir -equilibrated PBS. </li><li> Sceller les ouvertures du bleu et les adaptateurs verts (figure 1A) sur la feuille de PMMA couche 1 avec des noix blanches des doigts étanche solides (figure 3B-iii). </li><li> Remplissez les canaux de pont de sel et chambres de culture avec le CO 2 -equilibrated PBS dans la seringue décrit dans étape de configuration 2.4. Éviterla formation de bulles. </li><li> Ensuite, mettre le CO 2 -equilibrated PBS contenant puce MDF dans le 37 ° C 5% -CO 2 culture cellulaire incubateur pour O / N incubation. Cela permet à l&#39;air dissous dans l&#39;adhésif double face pour former des bulles dans les chambres. </li><li> Évacuer les bulles dans les canaux par un écoulement rapide PBS dans le canal à l&#39;aide des deux seringues. Pomper le PBS avant et en arrière si nécessaire. </li><li> Égoutter le PBS dans les canaux par l&#39;intermédiaire du robinet à 3 voies reliée à la tubulure de sortie moyenne. </li><li> Grâce à un nouveau 3-ml seringue, prendre 2,5 ml de CO 2 -equilibrated milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (voir l&#39;étape 3.5), et de remplacer la seringue reliée à l&#39;entrée par la nouvelle. Remplir les canaux avec le milieu. </li><li> Préparation du réseau de pont de sel. <ol><li> Retirer temporairement les écrous solides (figure 3B-iii) sur les cartes vertes (figure 1A) et injecter 3% à chaud (&gt; 70 ° C) agarose dans le bri de seldge canal à travers l&#39;ouverture dans le vert des adaptateurs (figure 1A). REMARQUE: Préparation d&#39;agarose chaude: Dissoudre 1,5 g de poudre d&#39;agarose dans 50 ml de PBS. Stériliser par la fixation d&#39;un temps de maintien de 20 min à 121 ° C dans l&#39;autoclave. </li><li> Arrêter l&#39;injection de l&#39;agarose lorsque le liquide remplit les trois quarts de la longueur du canal de pont salin. </li><li> Sceller les pores sur les adaptateurs verts (figure 1A) en vissant les écrous solides (figure 3B-iii) après l&#39;injection agarose. </li><li> Remplacer les écrous solides sur les adaptateurs bleus (figure 1A) avec les écrous tubulaires translucides des doigts étanche (figure 3B). </li><li> Chargez le 3% préchauffé agarose dans les écrous tubulaires (figure 3B-IV). </li><li> Incluez les électrodes Ag / AgCl (figure 3B-V) dans les écrous tubulaires (figure 3B-iv) devant lasolidification de l&#39;agarose. </li></ol></li><li> Après avoir terminé la mise en place du réseau de pont de sel, injecter les cellules de cancer du poumon CL1-5 dans les chambres de culture, une chambre à la fois. </li></ol> 3. Préparation des cellules cancéreuses et configuré pour Electrotactic Expérience <ol><li> La culture régulière de la lignée cellulaire de cancer du poumon CL1-5. <ol><li> Culture des cellules cancéreuses pulmonaires, CL1-5 obtenus à partir Prof. Pan-Chyr Yang, 17 dans le milieu complet dans un flacon de culture de cellules à 37 75T ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Le milieu complet est composé de DMEM et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Sous-culture les cellules tous les 3 à 4 jours. Les cellules utilisées pour réaliser des expériences de électrotaxie sont inférieures à 25 passages à partir de la source d&#39;origine. </li></ol></li><li> Ajouter 2 ml de tampon de trypsine à 0,25% pour les cellules en croissance exponentielle CL1-5 et incuber pendant 2 min dans le 37 ° C 5% CO 2 incubateur pour culture cellulaire de cellules detachment. </li><li> Terminer le processus de détachement avec 6 ml de 10% de FBS DMEM et centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite éliminer le milieu et suspendre le culot de cellules avec 5 ml de PBS. </li><li> Comptez le nombre de cellules dans le PBS. Ensuite, prendre 1 x 10 6 cellules et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Rejeter le PBS. Suspendre les cellules avec préchauffé CO 2 -equilibrated DMEM et ajuster la densité de cellules à 1 x 10 être 6 cellules / ml. REMARQUE: Incuber le milieu complet dans le 37 ° C 5% -CO 2 cellule incubateur de culture O / N pour obtenir le CO 2 -equilibrated DMEM. </li></ol> 4. Mettre en place pour Electrotactic Expérience <ol><li> De la sortie de la puce MDF, injecter 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, les cellules dans de la puce. </li><li> Incuber la puce MDF cellule tête de série dans l&#39;incubateur de culture cellulaire (fixé à 37 ° C et 5% de CO 2) pour 2-4 heures. </li><li> Configuration de MDF microsystème fluidique. <ol><li> Installez le système microfluidique MDF sur un transparent Indium Tin verre d&#39;oxyde (ITO) chauffe. Mesurer la température de la puce MDF avec un thermocouple de type K coupé entre la puce MDF et le verre ITO. Contrôler le chauffage ITO avec un contrôleur proportionnel intégral-dérivé (PID). Réglez la microfluidique température d&#39;incubation du système MDF à 37 ° C avec le régulateur PID. NOTE: La fabrication du chauffe-ITO et l&#39;installation du système de chauffage de la cellule de la culture sont décrits dans les rapports précédents 18,19. </li><li> Montez la puce de MDF ensemble à température contrôlée sur le XYZ platine motorisée contrôlée par ordinateur sur un microscope inversé. L&#39;utilisation de la platine motorisée est décrite dans l&#39;étape 5.1. Pomper le milieu complet dans des chambres de culture à travers les entrées avec une pompe à seringue à quatre canaux. </li></ol></li><li> Pomper le milieu complet dans la puce MDF à un taux de 20 ul / h débit. Les déchets de la culture du savoirlets est recueilli dans les microtubes (représentés comme des «déchets» dans la figure 3A). </li><li> Incuber les cellules pour un autre 16-18 heures à 37 ° C dans la puce de MDF. </li><li> Pour remplacer le milieu, le milieu contenant de la pompe 50, 25, 5 et 0 inhibiteur de la kinase uM, respectivement, dans chaque chambre de culture à un débit de 20 ul / min pendant 10 min. NOTE: Préparer une solution mère 10 mM de l&#39;inhibiteur de la protéine kinase Y27632 Rho-associé en ajoutant 3 ml d&#39;eau stérile pour l&#39;inhibiteur de kinase de 10,6 mg. Diluer la solution mère de 10 mM à 50, 25 et 5 pm, respectivement, en utilisant 10% de milieu FBS DMEM. </li><li> Incuber les cellules dans l&#39;inhibiteur de kinase pendant encore 60 minutes à 37 ° C. Réglez le débit moyen de 20 ul / h. Utilisez la même température de la culture et le taux décrit ci-dessus dans les étapes ultérieures couler. </li><li> Utilisez des fils électriques pour connecter une alimentation en courant continu à la puce MDF via les électrodes Ag / AgCl sur la puce. </li><li> Série connecter un ampèremètre in le circuit électrique. Utilisez l&#39;ampèremètre pour contrôler le courant électrique dans la puce MDF. </li><li> Allumez l&#39;alimentation DC et réglez l&#39;ampèremètre actuelle à 86,94 uA en ajustant la tension d&#39;alimentation comprise entre 15 et 19 V. NOTE: Compte tenu de la loi d&#39;Ohm, E = I / (aA eff), où I est le courant électrique circulant à travers la matière en vrac, à savoir, le milieu de culture dans la chambre electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) est le conductivité du milieu de culture, A eff (= 0,21 mm 2 pour une largeur de 3 mm x 0,07 mm de hauteur) est la surface en coupe transversale effective de la chambre electrotactic, et le courant électrique (I) nécessaire pour générer un 300 mV / mm EF dans la puce MDF est de 86,94 uA. </li></ol> 5. Acquisition et analyse de la cellule Images <ol><li> Contrôler la platine motorisée à l&#39;aide d&#39;un programme MATLAB GUI. Avec le système microfluidique MDF monté sur le microscoPE, déplacer la puce pour les régions d&#39;observation en utilisant le platine motorisée. </li><li> Images de cellules d&#39;enregistrement à l&#39;aide d&#39;un appareil photo reflex mono-objectif numérique (SLR) montés sur le microscope. </li><li> Prenez des images microscopiques en utilisant un objectif 4X à des intervalles de 15 minutes pendant 2 heures. </li><li> Analyse de la migration cellulaire. <ol><li> Exécutez NIH ImageJ 1,47 V. </li><li> Analyser la distance de la première à la position finale de la centroïde de la cellule. </li><li> Allez dans &quot;Fichier&quot; → → &quot;Importer&quot; &quot;séquence d&#39;images&quot;, et importer neuf images pour l&#39;analyse de la migration cellulaire. La première image est le résultat du temps zéro, et la dernière image est le résultat de 120 min. </li><li> Allez sur &quot;Analyser&quot; → &quot;Définir mesures&quot; et cochez la case à côté de &quot;Centre de gravité&quot; </li><li> Cliquez sur l&#39;icône «main levée de sélections». </li><li> Représenter le bord des cellules sélectionnées dans la première image. </li><li> Allez sur &quot;Edit&quot; → </em&gt; &quot;Sélection&quot; → &quot;Ajouter au Manager&quot; </li><li> Aller à la neuvième image et de représenter le bord des mêmes cellules sélectionnées sur la première image. Les positions de cellule peuvent être tracées en utilisant la deuxième à huitième images. </li><li> Allez sur &quot;Edit&quot; → &quot;Sélection&quot; → &quot;Ajouter au Manager&quot; </li><li> Répétez les étapes 5.4.5 à 5.4.9 de recueillir des données à partir de 90 à 100 cellules. </li><li> Allez sur &quot;Analyser&quot; → &quot;Measure&quot; pour obtenir le résultat des positions initiales et finales des cellules sélectionnées. NOTE: La vitesse de migration est définie comme la durée moyenne de mouvement des cellules par heure. Le directedness est défini comme cosinus, où est l&#39;angle entre le vecteur de la dCEF (de l&#39;anode à la cathode) et le vecteur de point de départ d&#39;une cellule dans sa position finale. Le directedness est -1 pour les cellules qui migrent vers l&#39;anode et une pour les cellules qui migrent vers la cathode. Pour un groupe de manière aléatoire miréseau de cellules, le directedness est 0. 2 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Nous avons trouvé le processus d&#39;adhésion adaptateurs acryliques sur la couche 1 de la puce MDF à être difficile. L&#39;application de seulement 1 à 2 pi de super glue est suffisante pour faire adhérer fermement l&#39;adaptateur sur la puce MDF. De plus grandes quantités de colle ont abouti à une polymérisation incomplète de la super glue et l&#39;échec à adhérer. Une fois que les adaptateurs acryliques ont été fermement collées sur la puce MDF, une fuite de liquide dans le système microfluidique ra...

Le comportement des cellules adhérentes qui se déplacent en direction d&#39;une anode ou de la cathode sous un champ électrique de courant continu (dCEF) est appelée électrotaxie. Le comportement electrotactic de cellules joue un rôle important dans l&#39;embryogenèse, la régénération des nerfs, et la cicatrisation des plaies. 1 Des cellules tumorales telles que des cellules cancéreuses de la prostate de rat, des cellules cancéreuses deux mammaires, 3 et pulmonaires cellules d&#39;adénocarcinome 4-8 ont montré mouvement electrotactic sous une dCEF appliqué . L&#39;EF physiologique a été mesurée dans les tissus de la glande. 9,10 électrotaxie a également été signalé dans les cellules tumorales des glandes associées. 2,3 Pris ensemble, les électrotaxie de cellules cancéreuses est considéré comme un facteur de métastases. 11 Contrôle de la direction électrique les cellules cancéreuses sous dCEF peuvent être une approche potentielle pour le traitement futur du cancer. Cependant, aujourd&#39;hui, le mécanisme moléculaire détaillé de électrotaxie reste controversée. Par conséquent, une enquête de l&#39;influence de la stimulation électrique sur la migration des cellules cancéreuses peut faciliter le développement de stratégies pour le traitement du cancer. Récemment, des dispositifs bio-microfluidique ont été fabriqués pour l&#39;étude des réponses cellulaires à couler force de cisaillement, 12 gradients chimiques, 13 et électrique 4 stimuli in vitro. La fabrication de dispositifs de bio-microfluidique utilisant (PDMS) ou polyméthacrylate de méthyle (PMMA, aussi connu comme l&#39;acrylique) a réussi à réduire le taux de ces expériences d&#39;échec. En outre, en utilisant des dispositifs microfluidiques à base d&#39;acrylique comme un prototype pour enquêter sur des sujets biologiques est plus simple que d&#39;utiliser des copeaux de PDMS. Diverses fonctions dans les dispositifs à base d&#39;acrylique ont été développés pour électrotaxie étude. Cependant, aucune des conceptions antérieures sont capables de tester simultanément les effets de diverses conditions chimiques et le champ électrique sur-cellules pour électrotaxie étude. Ainsi, nous avons développé un dispositif microfluidique mu-leltichannel double champ électrique (MDF) quatre canaux culturels indépendants et huit conditions expérimentales différentes dans une puce contenant puce. La puce de MDF à base d&#39;acrylique, d&#39;abord rapporté par Hou et al., 8 intègre une stimulation électrique et plusieurs canaux isolés chimiquement. Ces canaux isolés chimiquement peuvent être utilisés pour la culture de différents types de cellules dans une expérience. Le dCEF dans les canaux est produite par une source d&#39;alimentation électrique. Deux champs électriques indépendantes, l&#39;une avec une force appliquée de champ électrique (EFS) et l&#39;autre avec 0 EFS, sont menées dans chaque canal chimiquement isolé. De cette manière, la puce fournit EF coexistante mieux contrôlée et la stimulation chimique. En outre, les résultats de la simulation numérique de la diffusion de produits chimiques à l&#39;intérieur de la puce MDF indiquent qu&#39;aucune contamination croisée entre les canaux est survenue après une période expérimentale de 24 heures. 8 Par rapport à la DeviCE rapporté par Li et al., 14 la puce MDF fournit une zone de grande culture, qui permet une plus grande analyse biochimique des cellules stimulées électriquement. En outre, avec une plus grande zone d&#39;observation de la puce MDF, plusieurs cellules peuvent être observées dans le test, si l&#39;analyse de la vitesse de migration ou directedness des cellules stimulées électriquement est plus précis. Les monocanal puce conceptions d&#39;études antérieures rapportés par Huang et al. 4 et Tsai et al. 15 ne permettent qu&#39;un seul type de cellule ou chimique à tester. Cependant, la puce de MDF peut être utilisé pour étudier les effets de différents produits chimiques sur la électrotaxie, ainsi que les effets de la stimulation électrique sur différents types de cellules. En d&#39;autres termes, la puce MDF permet l&#39;étude efficace de dépendances de doses chimiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Reagent</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM medium</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Basic Life</td>
			<td >BL2651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Y-27632 (hydrochloride)</td>
			<td >Cayman Chemical Co</td>
			<td >10005583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agarose</td>
			<td >LONZO, USA</td>
			<td >SeaKem LE AGAROSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>3 ml with Luer taper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way stopcock</td>
			<td>Nipro</td>
			<td >with Luer taper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMMA (acrylic)</td>
			<td >HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td >thickness 1mm, 2mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >acrylic adaptor</td>
			<td >KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td>
			<td >1/4-28 port, 10x10x6 mm</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nut</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td >UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glass</td>
			<td >Deckgl&#228;ser, Germany</td>
			<td >24x60 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-sided tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >PET 8018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >super glue</td>
			<td >3M</td>
			<td >Scotch Liquid Plus Super Glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon tube</td>
			<td >HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan</td>
			<td >UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING</td>
			<td>outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scienti&#64257;c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TFD4 detergent</td>
			<td >Franklab, France</td>
			<td >TFD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultrasonic steri cleaner</td>
			<td >LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo bonder</td>
			<td >KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 laser scriber</td>
			<td >LTT group, Taiwan</td>
			<td >ISL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >indium tin oxide glass (ITO glass)</td>
			<td >AimCore Technology Co., Ltd</td>
			<td >TN/STN, &#8806;10&#937;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >proportional-integral-derivative (PID) controller</td>
			<td>JETEC Electronics Co., Japen</td>
			<td >TTM-J40-R-AB,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-type thermocouple</td>
			<td >TECPEL</td>
			<td >TPK-02A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-channel syringe pump</td>
			<td >KdScientific, USA</td>
			<td >250P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DC power supply</td>
			<td >GWInstek, Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-Y-Z motor stage</td>
			<td >TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >inverted microscope</td>
			<td >Olympus, Japan</td>
			<td >CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >digital SLR camera</td>
			<td >Canon, Japan</td>
			<td >60D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip

Le comportement de la migration cellulaire directionnelle sous un champ électrique à courant continu (dCEF) est désigné comme électrotaxie. Le rôle physiologique important de dCEF à guider le mouvement des cellules pendant le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et la cicatrisation des plaies a été démontré dans de nombreuses études. En appliquant puces microfluidiques à un essai de électrotaxie, le processus d&#39;enquête est raccourcie et les erreurs expérimentales sont minimisés. Ces dernières années, des dispositifs microfluidiques fabriqués avec des matériaux polymères (par exemple, le polyméthacrylate de méthyle, PMMA, acrylique ou) ou du polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été largement utilisés dans l&#39;étude des réponses des cellules à une stimulation électrique. Toutefois, contrairement aux nombreuses étapes nécessaires pour fabriquer un dispositif de PDMS, la construction simple et rapide des micro acryliques fl uidique puce rend approprié à la fois pour le prototypage et la production de l&#39;appareil. Pourtant, aucun des appareils déclarés de faciliter l&#39;étude efficace de la chimique et dcE simultanéeF effets sur les cellules. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication d&#39;un double champ électrique multicanaux à base d&#39;acrylique (MDF) à puce pour étudier l&#39;effet simultané de produits chimiques et la stimulation électrique sur des cellules de cancer du poumon. La puce MDF fournit huit combinaisons de stimulations électriques / chimiques dans un seul test. La puce non seulement raccourcit considérablement le temps nécessaire expérimentale, mais augmente également la précision dans électrotaxie études.

Fabrication et l&#39;assemblage de l&#39;appareil MDF Un diagramme schématique de la puce de MDF à base d&#39;acrylique est représenté sur la Figure 1A. Quatre feuilles d&#39;acrylique, d&#39;un couvercle en verre, 13 adaptateurs acryliques, et un morceau de ruban adhésif double-face ont été utilisés dans l&#39;assemblage de la puce MDF complété (figure 2D). Il ya se...

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Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

electrotaxis-studies-lung-cancer-cells-using-multichannel-dual

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K vues.  Academia Sinica. Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Vidéo: Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Recherche

Bio-ingénierie

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Électrotaxie microfluidique à base d&#39;analyse quantitative à la demande de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Une puce microfluidique pour ICPMS Présentation échantillon

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...