Nous remercions le Dr Ray Krishanu pour les stocks de drosophile, Tarjani Agarwal pour maintenir un Drosophila cage, Peter Juo pour nuIs25 et CGC pour C. souches elegans. SPK fait jsIs609 dans le laboratoire de Michael Nonet l&#39;. Nous remercions Arpan Agnihotri (BITS Pilani) pour son aide dans imagerie time-lapse de transport mitochondries des animaux jsIs609 dans des dispositifs microfluidiques. Nous sommes reconnaissants au Dr Vatsala Thirumalai et Surya Prakash pour nous fournir des embryons de poisson zèbre. Nous remercions le Dr Krishna et CIFF au SPNE pour l&#39;utilisation du microscope confocal à disque rotatif soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie, Centre de nanotechnologie (n ° SR/55/NM-36-2005). Nous remercions également Kaustubh Rau, V. Venkatraman et Chetana Sachidanand pour les discussions. Ce travail a été financé par la DBT bourse post-doctorale (SM), l&#39;heure d&#39;été accélérée régime (SM) et une subvention de la TCD (SPK). SA a été soutenue par des subventions DST et le CSIR à SPK.

1. SU8 Fabrication Maître <ol><li> Concevoir les structures microfluidiques utilisant le logiciel Clewin et l&#39;imprimer en utilisant 65.024 traceur laser DPI avec taille minimum de 8 um sur le film du circuit imprimé. </li><li> Nettoyer 2 cm X 2 cm de plaquettes de silicium avec oxyde natif dans 20% KOH pour 1 min et rincer à l&#39;eau déminéralisée; une plaquette pour chaque couche de l&#39;écoulement et sa couche de contrôle correspondant. </li><li> Sécher les pièces avec de l&#39;azote gazeux et déshydrater sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 4 heures. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Morceaux de silicium lieu une à la fois sur le métier à filer et tourner mandrin sur le vide. Couvrir les surfaces de silicium avec ~ 20 pl hexaméthyldisilazane (HMDS) et les enrober à l&#39;aide d&#39;un. SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 3.000 tours par minute pendant 30 sec </li><li> Couvrir des tranches de silicium complètement avec ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) et des plaquettes en utilisant le manteau SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 sec. Ce protocole de filage produit une épaisseur de photoréserve ~ 40 um qui est approprié pour la commande d&#39;écoulement et les couches pour les premiers stades larvaires de C. elegans. </li><li> ~ 1,5 ml de spin SU8-2050 en utilisant SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 secondes pour obtenir une épaisseur de résine photosensible ~ 80 um qui est adapté à la fabrication de la couche d&#39;écoulement de fin stades larvaires de C. elegans, la couche basale de débit pour Drosophila / poisson zèbre larves et leurs niveaux de contrôle correspondants. </li><li> Placez les morceaux de silicium sur plaque chauffante avec la couche SU8 couché sur le dessus. Souple cuire les morceaux de silicium recouvertes à 65 ° C pendant 1 min, puis 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Placez les morceaux de silicium soft-cuits sur la scène d&#39;exposition avec SU8-2025 sur enduitface sur la face supérieure de la lampe UV. Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) pour la couche d&#39;écoulement et motif de couche de contrôle respectivement pour les premiers stades larvaires de C. elegans. Placer le masque photo sur le dessus de la couche de SU8 et assurer le masque est à plat contre la couche de revêtement. Ouvrez le volet de la lampe UV et d&#39;exposer les SU8 soft-cuits plaquettes à 200 Watt Lampe UV à travers le masque photo pendant 15 sec. </li><li> Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) sur SU8-2050 pièces revêtues (préparé à l&#39;étape 1.6) pour la fabrication de la couche d&#39;écoulement et de la couche de contrôle pour fin stades larvaires de C. elegans. Utiliser le masque photo avec le motif (L1, figure 1C) I et II de conception (L2, figure 1C) pour le débit de la couche basale et la couche de contrôle respectivement pour la drosophile / poisson zèbre larves sur des plaquettes revêtues de SU8-2050 (i préparéEtape n 1,6). Exposer les surfaces SU8 à travers le masque photo pour la lampe UV de 200 watts pendant 15 secondes. </li><li> Placer les morceaux de silicium exposées sur une plaque chauffante avec la couche enduite sur le dessus. Déposer cuire les tranches à 65 ° C pendant 1 min suivie de 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Développer les pièces en utilisant la solution SU8 développeur pendant 20 min. Rincer les morceaux dans de l&#39;alcool isopropylique (IPA) et sécher à l&#39;aide de l&#39;azote gazeux. </li><li> Placer les morceaux de silicium dans un dessicateur avec le motif sur le dessus SU8. Enduire les morceaux avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures. </li></ol> Précautions: Prendre les précautions pour manipulation des produits chimiques au cours du traitement KOH, revêtement de résine photosensible et en développement. Silane revêtement en phase vapeur doit être effectué à l&#39;intérieur d&#39;un dessiccateur dans un endroit aéré. Protéger résine SU8 de plus de l&#39;exposition à la lumière. Utilisez des lunettes de protection UV avec une ligsource de ht. 2. Fabrication de moules PDMS <ol><li> Préparer 10:01 PDMS en combinant 50 g de Sylgard 184 de base avec 5 g de durcisseur dans un gobelet en plastique. Mélanger manuellement le contenu de ~ 3 min. Dégazer le mélange à l&#39;intérieur d&#39;un dessiccateur pour éliminer toutes les bulles d&#39;air formées pendant le mélange. </li><li> Versez un mélange de 5 mm d&#39;épaisseur PDMS sur les plaquettes de silicium avec SU8 modèle de conception II, pour la couche de contrôle, doucement pour éviter la formation de bulles d&#39;air. Dans le cas où des bulles se forment lors de la coulée, dégazer le PDMS sur le modèle SU8 dans le vide bas pour enlever toutes les bulles. </li><li> Placer les tranches de silicium avec SU8-2025 modèle de conception que j&#39;ai, pour la couche d&#39;écoulement, sur le mandrin spinner et allumez le vide pour les retenir. Couvrir les plaquettes avec ~ 1 ml de mélange PDMS et enrober les pastilles à l&#39;aide SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.500 tours par minute pendant 30 sec. </li><li> ~ 1 ml manteau PDMS mélange sur des tranches de silicium avec l&#39;um 80 SU8-2050 modèle de conception I (L1, figure 1B), pour lacouche d&#39;écoulement pour fin stades larvaires de C. elegans en utilisant la centrifugeuse SPIN150 à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.000 tours par minute pendant 30 sec. Enduire une couche épaisse de mélange PDMS sur les morceaux de silicium avec SU8-2050 modèle de flux de couche de dessin I (L1, figure 1C) pour Drosophila / poisson-zèbre, en utilisant des larves SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 35 sec. </li><li> Cuire des morceaux de PDMS avec revêtement en silicone de conception I et plaquettes avec un design correspondant II pour le contrôle de la couche contenant PDMS pour C. larves elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre dans un four à convection d&#39;air chaud à 50 ° C pendant 6 heures. </li><li> Découper la pièce à partir de PDMS contenant le substrat de silicium du motif de SU8 C. II elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves à l&#39;aide d&#39;une lame tranchante. Percer un trou de petit diamètre de ~ 1 mm au-dessus du réservoir principal reliant le piège dans le moule PDMS en utilisant un perforateur Harris. </li><li> Placez le poing PDMS bloc (contenant le moule 40 um d&#39;épaisseur pour le contrôlecouche L2) sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez la tranche de silicium revêtue PDMS contenant des 40 um d&#39;épaisseur SU8 conception que j&#39;ai sur le même plateau, avec le PDMS surface enduite orientée vers le haut. Insérez le bac dans la chambre de nettoyeur à plasma et mettez le vide pendant 2 min. Par la suite, la mise sous tension du plasma et abaisser la pression dans la chambre jusqu&#39;à ce que la chambre vire au rose pâle. Exposer les deux surfaces à 18 Watt air par plasma sous vide basse pendant 2 min. </li><li> Placez le bloc de poing PDMS retiré les 80 um d&#39;épaisseur SU8 maître modèle contenant II pour la fin stades larvaires de C. elegans ou larves de Drosophila / poisson zèbre sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez le correspondant de spin cuite couche de PDMS déposé sur la plaquette de silicium contenant 80 um d&#39;épaisseur conception I pour plus tard C. étapes elegans ou la drosophile / poisson zèbre larves simultanément sur ​​le même plateau avec le plat recouvert PDMS surface vers le haut. Utiliser le même protocole mentionné ci-dessus pour les exposer à l&#39;air plasma. </li><li> Placez les deux surfaces de plasma traités pour C. elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves avec une légère pression et faites cuire au four les convection d&#39;air chaud à 50 ° C pendant 2 heures. </li><li> Découper les dispositifs asservis du substrat de silicium avec SU8 conception de C. I elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves. Perforation des trous d&#39;accès à des réservoirs d&#39;entrée et de sortie du canal d&#39;écoulement. </li><li> Placer le moule PDMS collé sur un plateau en plastique pour C. elegans, avec le côté moulé de la conception de la couche d&#39;écoulement vers le haut. Clean lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) et le placer sur le même plateau en plastique. Insérez le bac contenant moule PDMS et lamelle de verre à l&#39;intérieur de la chambre à plasma. Exposer la surface inférieure du dispositif de PDMS et lamelle de verre de 18 Watt plasma d&#39;air à basse pression pendant 2 min. Placez les deux surfaces de plasma traités avec gentle la pression et faire cuire au four les convection d&#39;air chaud à 50 ° C pendant 2 heures. </li><li> Stocker l&#39;appareil dans un environnement propre pour une utilisation future. </li></ol> 3. Étapes supplémentaires pour la drosophile / Zebrafish périphérique <ol><li> Exposer la surface de verre propre de taille 2 cm x 2 cm avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures. </li><li> Spin ~ 1 ml de 10:1 mélange PDMS préparé à l&#39;étape 2.1, la surface du verre silanisé utilisant SPIN150 spinner à 500 tours par minute pendant 35 sec. Cuire les substrats de verre revêtus PDMS dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 6 heures avec la surface revêtue vers le haut. Permettre à la couche de PDMS refroidir à température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Poinçon la couche de revêtement à l&#39;aide d&#39;un perforateur personnalisé construit en métal pointu au milieu du PDMS, pour former la couche d&#39;espacement PDMS. La forme du poinçon métallique est conçu semblable à la conception de flux de Drosophila / poisson zèbre (L1, figure 1C </strong&gt;). </li><li> Exposer la couche d&#39;espacement PDMS et l&#39;unique lié bloc (débit de la couche et la couche de contrôle, effectuée à l&#39;étape 2.9 pour Drosophila / poisson zèbre larves) à 18 watts d&#39;air plasma en utilisant nettoyeur à plasma à faible vide. Placez les deux surfaces de plasma traités ensemble et les faire cuire dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 2 heures. </li><li> Couper le dispositif lié à partir de la vitre, les trous d&#39;accès à poinçonner les réservoirs d&#39;entrée et de sortie et elle liaison à une lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) en utilisant un filtre à plasma tel que mentionné dans l&#39;étape 2,11. Cela permettrait de produire un dispositif d&#39;immobilisation pour les larves de premier stade drosophile avec une hauteur de canal de ~ 500 um. Pour embryons de poisson zèbre, dupliquez le calque entretoise PDMS procédé de fabrication d&#39;une étape de liaison supplémentaire. La double couche de PDMS-S produit une hauteur de canal de 900 um pour 30 hfp poisson zèbre larves. </li></ol> Précautions: Eviter les particules de poussière lors de la fabrication du dispositif. Deux plasma nettoyé la surfaces doivent être complètement exempte de poussière pour une bonne adhérence. Stocker les appareils dans un dessiccateur dans les situations où une salle spéciale propre n&#39;est pas disponible de manière à minimiser l&#39;accumulation de particules de poussière dans les appareils. 4. Utilisation PDMS Membrane <ol><li> Connecter une extrémité d&#39;un tube de micro-flex (diamètre intérieur ~ 1,6 mm, diamètre extérieur 4,8 mm ~) à un régulateur d&#39;alimentation en azote gazeux sous pression et l&#39;autre extrémité au réservoir principal de collecteur à travers une aiguille de calibre 18 (diamètre extérieur ~ 1,25 mm) collé au tube. Un robinet 3-voies utilisées dans le milieu de la connexion du tube permet l&#39;application ou la libération de la pression sur la membrane. </li><li> Remplir le tube relié au dispositif de PDMS avec une colonne de 10 cm d&#39;eau distillée avant de le raccorder au réservoir de la trappe principale d&#39;un C. elegans et / ou de larves de drosophile / poisson zèbre. </li><li> Activer la soupape de la fourniture d&#39;azote à 14 psi lire et contrôler la membrane du piège principal de déviation vers èmee canal d&#39;écoulement à faible grossissement d&#39;un microscope inversé. Longueur de la colonne d&#39;eau dans le tube de micro-flex est comprimé lorsque le robinet à 3 voies est ouverte. Bords de la membrane dévié, sont visibles en lumière transmise (figure 1I et 1J). Déviation membrane provoque un déplacement des particules de poussière / bulles sous la membrane de PDMS et les pousse aux limites du canal. </li><li> Attendez que le liquide remplit avant le microcanal complètement sans bulles d&#39;air. </li><li> Relâcher la pression à l&#39;aide du robinet 3-voies pour détendre la membrane à sa position de repos. </li></ol> 5. Insertion C. Les larves elegans, la drosophile et le poisson-zèbre dans l&#39;appareil et les immobiliser sous la membrane flexible PDMS <ol><li> Remplir le canal d&#39;écoulement avec un tampon M9 [3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O à 1 L, stériliser par autoclaving] pour C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O à 1 L, stériliser à l&#39;autoclave] pour Drosophila / 19 pour le poisson-zèbre larves 10 min avant un expérience. </li><li> Localiser un seul C. elegans de passage obligé sur une plaque NGM 18 (ou larves de premier stade drosophile de la plaque de gélose oeuf ou manuellement dechorionated 30 larves du poisson zèbre hpf en milieu liquide 20) à l&#39;aide d&#39;un microscope stéréo à faible grossissement. Choisissez un seul animal en utilisant un petit volume de solution tampon dans un embout micro. Utiliser un embout de micro avec son extrémité coupée pour accueillir plus la drosophile ou poisson zèbre dans le tampon. </li><li> Poussez le seul organisme à travers l&#39;entrée du canal d&#39;écoulement. Régler la pression de pipetage pour positionner l&#39;animal individuel dans le piège principal. </li><li> Augmenter la pression de la membrane de PDMS lentement à la position de l&#39;animal contre la chanfrontière nel et l&#39;immobiliser avec 14 psi pour C. elegans, 7 psi pour la drosophile et 3 psi pour les larves de poisson zèbre. </li><li> Positionner l&#39;animal immobilisé au centre du champ de vision microscopique. Utiliser un microscope inversé au niveau désiré pour le champ lumineux haute résolution ou l&#39;imagerie par fluorescence. Acquérir une ou time-lapse images de fluorescence à la cadence prédéfinie. </li><li> Relâcher la pression piège et contrôler la locomotion de l&#39;animal pendant 5-10 min à faible grossissement. </li><li> Rincer l&#39;animal et insérer un animal frais de répéter les étapes ci-dessus. </li><li> Lavez tous les animaux à partir du réservoir de déchets en utilisant de l&#39;eau distillée appliqué à l&#39;aide d&#39;une seringue. Sécher le canal en poussant l&#39;air à l&#39;aide d&#39;une seringue pour une réutilisation ultérieure. </li></ol> Précautions: Animaux nécessitant une pression élevée de pipetage à l&#39;écoulement à l&#39;intérieur du canal principal tendent à montrer locomotion pauvre / santé après la libération du piège et doivent être évités pour imaGing. Nettoyer le canal d&#39;écoulement pour toute trace de tampon pour éviter le colmatage du canal par les cristaux. Si l&#39;huile est utilisée pour l&#39;imagerie haute résolution, nettoyer la lamelle de verre pour être en mesure de maintenir un bon signal sur bruit pour les expériences ultérieures.

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P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+development+in+the+zebrafish.+I.+Myocardial+fate+map+and+heart+tube+formation.">Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation.</a> Development. 119, 31-40 (1993).</li><li>Hall, D. H., Hedgecock, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans.">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li><li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).</li><li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dispositifs microfluidiques en PDMS sont optiquement transparents peuvent donc être utilisés pour une grande résolution imagerie in vivo de tout organisme modèle transparent / translucide. Notre modèle est approprié pour un grossissement spatio-temporelle d&#39;imagerie élevé d&#39;événements cellulaires et sous-cellulaires intactes dans les animaux vivants. En utilisant des techniques de microfabrication de lithographie douce permet une manipulation aisée des dimensions de l&#39;appareil pour les di...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Plaquettes de silicium </td><td> Plaquette Université </td><td> 150 mm (100) Mech année SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb logiciel </td><td> Version 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Traceur laser </td><td> Imagerie Fine Line </td><td> 65024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Promoteur </td><td> Microchem </td><td> SU8 développeur </td><td></td></tr><tr><td> Silane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Lampe UV </td><td> Oriel </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg. Oriel Lumière </td></tr><tr><td> Four à air chaud </td><td> Instruments Ultra </td><td> Sur mesure </td><td> Fixée à 50 ° C </td></tr><tr><td> Plaque de cuisson </td><td> Équipement de laboratoire IKA </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Nettoyeur à plasma </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Fileur </td><td> Systèmes de production de semi-conducteurs </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Lamelle de verre </td><td> Sceau d&#39;or </td><td> 22 X 22 mm, épaisseur n ° 1 </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> E1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {} chaGAL4 / cyo, SAMU-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Le poisson zèbre </td><td> Indien de type sauvage </td><td> De type sauvage </td><td></td></tr><tr><td> Tube de Tygon </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-aiguille </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Coupez-les en morceaux de 1 cm </td></tr><tr><td> 3-way robinet </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Puncheur Harris </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azote gazeux comprimé </td><td> Fournisseur de gaz local </td><td></td><td> Utiliser un régulateur pour réguler la pression </td></tr><tr><td> Microscope stéréoscopique &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Andor et Olympus </td><td> Yokogawa rotation du disque microscope confocal </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Basé sur Java programme de traitement d&#39;image </td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

Micro fabriqués dispositifs fluidiques fournir un accès micro-environnement pour les études in vivo sur de petits organismes. Procédés de fabrication simples sont disponibles pour dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie douce 1-3. Dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour les sous-imagerie cellulaire 4,5, in vivo microchirurgie au laser et imagerie cellulaires 2,6 4,7. L&#39;imagerie in vivo nécessite l&#39;immobilisation des organismes. Ceci a été réalisé en utilisant une aspiration 5,8, 6,7,9 canaux coniques, des membranes déformables, 2-4,10 aspiration avec refroidissement supplémentaire 5, gaz anesthésique 11, gels sensibles à la température 12, 13 et colle cyanoacrylate anesthésiques tels que le lévamisole 14 , 15. Anesthésiques couramment utilisés influencer la transmission synaptique 16,17 et sont connus pour avoir des effets néfastes sur la sous-cellulaire 4 transport neuronal. Dans cette èreudy nous démontrons une membrane à base de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) dispositif qui permet l&#39;immobilisation sans anesthésie intactes organismes modèles génétiques telles que Caenorhabditis elegans (C. elegans), larves de drosophile et les larves de poisson zèbre. Ces organismes modèles sont adaptés pour des études in vivo dans des dispositifs microfluidiques en raison de leurs faibles diamètres et des organismes optiquement transparents ou translucides. Diamètres de corps vont de ~ 10 um à 800 um ~ pour les premiers stades larvaires de C. larves elegans et le poisson zèbre et nécessitent des dispositifs microfluidiques de tailles différentes pour atteindre une immobilisation complète pour la résolution imagerie time-lapse élevé. Ces organismes sont immobilisés en utilisant la pression appliquée par l&#39;azote gazeux comprimé à travers une colonne de liquide et imagée à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé. Animaux libérés du piège de revenir à la locomotion normale dans les 10 min. Nous démontrons quatre applications imagerie time-lapse en C. elegansnommément imagerie mitochondriale de transport dans les neurones, le transport vésiculaire présynaptique dans un transport défectueux mutant, le transport des récepteurs du glutamate et de la division cellulaire Q neuroblastes. Les données obtenues à partir de ces films montrent que l&#39;immobilisation microfluidique est un moyen utile et précise de l&#39;acquisition de données in vivo d&#39;événements cellulaires et sub-cellulaires par rapport aux animaux anesthésiés (figure 1J et 3C-F 4). Dimensions de l&#39;appareil ont été modifiées pour permettre imagerie time-lapse de différents stades de C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre. Transport de vésicules marquées par synaptotagmine marqués à la GFP (syt.eGFP) dans les neurones sensoriels montre mouvement dirigé des marqueurs de vésicules synaptiques cholinergiques exprimés dans les neurones sensoriels de larves de premier stade intacte chez la drosophile. Un dispositif similaire a été utilisée pour effectuer imagerie time-lapse de battement de coeur dans ~ 30 heures après la fécondation (HPF)poisson-zèbre larves. Ces données montrent que les dispositifs simples que nous avons développées peuvent être appliquées à une variété de systèmes modèles pour étudier les phénomènes cellulaires plusieurs biologiques et de développement in vivo.

Le dispositif d&#39;immobilisation est un bloc bicouche PDMS fabriqué par collage de deux couches: une couche d&#39;écoulement (couche 1) et une couche de commande (couche 2) comme le montre la Figure 1. Le piège principal est connecté à une bouteille de gaz azote à travers un détendeur et une vanne d&#39;arrêt 3-voies nécessaires pour appliquer (3-14 livres par pouce carré) de pression sur la membrane à travers une colonne de liquide (figure 1A). La membrane dévié immobili...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intact<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves et des larves de poisson zèbre. Le dispositif utilise une membrane déformable PDMS pour immobiliser ces organismes modèles pour effectuer une imagerie laps de temps de nombreux procédés tels que battement de coeur, la division cellulaire et subcellulaire de transport neuronale. Nous démontrons l&#39;utilisation de cet appareil et de montrer des exemples de différents types de données collectées à partir des systèmes de modèles différents.

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K vues.  NCBS-TIFR. Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit In vivo Imagerie de C. elegans, Intact Drosophila Larves et des larves de poisson zèbre. Le dispositif utilise une membrane déformable PDMS pour immobiliser ces organismes modèles pour effectuer une imagerie laps de temps de nombreux procédés tels que battement de coeur, la division cellulaire et subcellulaire de transport neuronale....

Vidéo: Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-étape Hauteur variable photolithographie pour dispositifs microfluidiques à valve Multilayer

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour les immunoessais

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d&#39;oxygène

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Une méthode de fabrication simple et évolutive pour les dispositifs électroniques organiques sur les textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Une plate-forme microfluidique d’imagerie longitudinales chez Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...