Nous sommes reconnaissants à Samuel Shepard, Peter Bazeley, et John David Bell pour l&#39;administration des pages web génomique IRM. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation récompense de carrière &quot;Enquête sur les rôles cellulaires intron&quot; [numéro de subvention MCB-0643542].

Tous les programmes utilisés dans le document ont été écrites en utilisant perl, et toutes les pages web ont été créés en utilisant PHP. 1. Point de départ: Ouvrez la page d&#39;accueil de l&#39;ensemble du génome à l&#39;IRM en ligne http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / GMRI /. La ressource Web fournit également des instructions / des explications sur les programmes dans le menu «Aide (How-to/README)&quot; lien, tandis que tous les documents publiés sur la génomique des algorithmes IRM et similaires sont listés dans le &quot;Liens vers des ressources pertinentes&quot; lien. 2. Préparation et le chargement de la séquence d&#39;entrée (s). Créer un fichier avec FASTA format séquence (s) pour démarrer une session d&#39;analyse GMRI. Chaque séquence nucléotidique dans ce format devrait être précédée par une seule ligne en commençant par le caractère &quot;&gt;&quot; qui représente un identificateur, suivi sur la même ligne par une courte description de cette séquence. Les séquences nucléotidiques pour l&#39;analyse GMRI permet aussi des personnages comme R, Y, N, X, etc Hwever, non-A, T, C, G caractères ne seront pas traitées par le programme et sera ignorée. Séquences dans lesquelles les éléments répétitifs ont été «masquée» (remplacé par &quot;N&quot; s) peut être utilisé comme entrée. Notez que les caractères de séquence sont insensibles à la casse. <ol><li> Commencez une session GMRI en cliquant sur ​​&quot;Démarrer ou Reprendre&quot; sur la page d&#39;accueil IRM génomique. Cela prend à l&#39;utilisateur d&#39;une page où les séquences nucléotidiques peuvent être téléchargés. </li><li> Copier-coller votre FASTA des séquences au format ou télécharger un fichier contenant les séquences à partir de votre ordinateur local en utilisant les &quot;choisir fichier&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;démarrer une nouvelle session avec ce fichier&quot;. Un message de confirmation devrait apparaître au-dessus de la fenêtre d&#39;entrée indiquant que &quot;Votre séquence a été téléchargé avec succès&quot; et vous devriez également obtenir une alphanumériques &quot;GMRI identifiant&quot; [le site appelle un &quot;label de session»] pour votre session (par exemple b16yMj), qui peut être utilisée pour récupérer et continuer une session pour un maximum de deux semaines après la première utilisation. </li></ol> REMARQUE: Désormais les séquences d&#39;entrée sont désignés comme &quot;userfile&quot;. 3. Obtenir une distribution de fréquence des oligonucléotides des séquences d&#39;entrée (en option). Cliquez sur &quot;ISR Analyzer&quot; onglet (rangée du haut) afin d&#39;obtenir une distribution des fréquences d&#39;oligonucléotides pour l&#39;ensemble des séquences d&#39;entrée. L&#39;ISR est l&#39;acronyme de courte portée non-homogénéité. À ce stade, l&#39;utilisateur peut spécifier la longueur de plus d&#39;oligonucléotides (de 2 à 9 nucléotides, par défaut 6 nuits) pour les fréquences qui seront calculés. Cette sélection se fait en cliquant sur ​​l&#39;option souhaitée dans la case &quot;Taille maximale oligomère&quot; liste. Appuyez ensuite sur la &quot;analyser un fichier&quot; bouton pour lancer le calcul. Une représentation grossière de la composition de la séquence d&#39;entrée apparaît immédiatement comme une courte table au milieu de cette page web et téléchargeable comme «userfile.comp.tbl&quot;. Ce tableau ne représente que les oligonucléotides les plus et les moins abondantes dans les séquences d&#39;entrée. Le tableau de fréquence pour tous les oligonucléotides possible est généré dans un fichier nommé &quot;userfile.comp&quot;, qui peut être obtenue via le &quot;fichier de composition Télécharger&quot; lien. REMARQUE: SRI analyseur compte l&#39;ensemble de tous les oligonucléotides qui se chevauchent. 4. Générer des séquences aléatoires ayant la même composition oligonucléotide comme dans les séquences d&#39;entrée (en option). (Achèvement de l&#39;étape 3 du protocole est requis pour cette tâche). <ol><li> Cliquez sur &quot;Générateur ISR&quot; onglet (rangée du haut) pour ouvrir une nouvelle page web qui crée des séquences aléatoires. Choisissez le nombre d&#39;échantillons de séquences aléatoires doit être généré en utilisant la boîte de liste sur cette page web. Chacun de ces fichiers contiennent des séquences échantillon aléatoire du nombre et de même longueur que les séquences d&#39;entrée dans &quot;userfile&quot;. Par ailleurs, si une séquence d&#39;entrée contient non-A, T, C, G ou des caractères, la séquence aléatoire aura &quot;N&quot; s exactement les mêmes positions que dans la séquence d&#39;entrée. </li><li> Choisissez la plus grande longueur d&#39;oligonucléotides pour lequel les fréquences seront rapprochées dans les séquences aléatoires. Cela peut être choisi en cochant le bouton radio pour le niveau oligomère désiré (par exemple «4-Mers» pour quatre bases oligonucléotides) dans le tableau au centre de l&#39;écran. Il est à noter ici que des séquences aléatoires consistera non seulement les fréquences approximative au niveau oligomère choisi, mais aussi les fréquences correspondantes des niveaux oligomère courte, comme dans les séquences d&#39;entrée. Petites fluctuations de l&#39;oligonucléotidefréquences d&#39;entrée et de séquences aléatoires sont possibles en raison de la procédure appliquée modèle de Markov pour la génération de séquences aléatoires. </li><li> Démarrez le programme en cliquant sur ​​&quot;Générer un fichier&quot; bouton. Si les séquences d&#39;entrée sont volumineux qu&#39;il ne pouvait prendre une couple de minutes pour générer des séquences aléatoires. Ainsi, un utilisateur doit attendre bleu &quot;Télécharger&quot; liens apparaissent au bas de cette page. Les jeux de hasard sont placés dans des fichiers avec des noms tels que &quot;userfile.randX_Y&quot; où X est le numéro de la série aléatoire et Y est le niveau oligomère choisi (par exemple &quot;userfile_rand2_4&quot;). </li></ol> 5. Analyse de milieu de gamme Inhomogénéité (IRM) des entrées et des séquences aléatoires. <ol><li> Cliquez sur le &quot;Analyseur IRM&quot; onglet (rangée du haut), ce qui ouvre une nouvelle page web qui analyse l&#39;inhomogénéité de milieu de gamme de la composition en nucléotides de séquences. </li><li> Sélectionnez une séquence à analyser à partir du &quot;fichier à analyser&quot; zone de liste (un choix entre la séquence d&#39;entrée et de jeux généré des séquences aléatoires peuvent être faites ici). </li><li> Choisissez le type de contenu de l&#39;IRM pour être analysés via la boîte de liste fournie. (Sept options de contenu sont disponibles: G + C, G + A, G + T, A, G, C ou T.) </li><li> Choisissez la longueur de la fenêtre pour laquelle les séquences riches en contenu et le contenu des pauvres seront examinés par la case &quot;taille de la fenêtre&quot; liste (valeur par défaut est 50 nucléotides, la plage valide est de 30 à 1000). </li><li> Choisissez le seuil supérieur et inférieur de seuil pour les régions riches en contenu et le contenu des pauvres, respectivement. Ces seuils peuvent être définis par le nombre exact des nucléotides notamment dans la fenêtre courante (en utilisant l&#39;option nombre par la zone de liste) ou selon le pourcentage de ces nucléotides dans la fenêtre (en utilisant l&#39;option de par le pourcentage) </li><li> Après les cinq choix ont été faits (par exemple: Séquence = &quot;userfile&quot;; contenu = GC; taille de la fenêtre = 50; Seuil supérieur = 35; Basse seuil = 15), invoquez le programme en appuyant sur ​​le bouton Analyser fichier. Le programme balaie toutes les séquences de l&#39;entrée sélectionnée consécutivement. A chaque étape on obtient un segment de la séquence actuelle avec une longueur égale à la taille de la fenêtre spécifiée et calcule si le nombre ou le pourcentage de nucléotides du contenu choisi est au-dessus du seuil supérieur ou inférieur au seuil inférieur. Si la fenêtre ne correspond pas à deux critères, la fenêtre suivante qui se chevauchent (décalé d&#39;un nucléotide) est sélectionné pour la même analyse. Quand une fenêtre se trouve là où la séquence répond à l&#39;une des conditions de seuil pour le contenu riche ou pauvre en composition, le programme enregistre la séquence de cette fenêtre dans le fichier de sortie et génère une impulsion sur la sortie graphique. Après cela, le programme saute à la prochaine ne se chevauchent fenêtre adjacente et reprend le processus de numérisation jusqu&#39;à la fin de la séquence est atteint. </li><li> Après l&#39;achèvement du programme, un lien vers le fichier de sortie (avec le nom &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; pour l&#39;exemple ci-dessus) apparaît et une représentation graphique des résultats est affichée dans le milieu de la page Web (voir Figure 1). Sur cette représentation graphique de toutes les séquences d&#39;entrée de la userfile sont concaténés en une chaîne unique et présenté comme une ligne noire horizontale sur l&#39;axe X, avec une longueur en kilobases (kb) ci-dessous. Toutes les régions riches en contenu le long des séquences d&#39;entrée sont marqués en bleu &quot;ascendante&quot; des pointes, et le contenu des régions pauvres comme le rouge &quot;descendante&quot; des pointes. Le nombre total de fenêtres riches en contenu et le contenu des pauvres sont présentés dans parenthses dans la légende au bas de cette figure (32 et 19, respectivement). Le chiffre sert à illustrer l&#39;abondance relative et la disposition des régions IRM. En attendant des détails spécifiques sont présentés dans le fichier de sortie (voir Figure 3). Dans ce dossier, tous les segments de la séquence nucléotidique qui correspondent au contenu riche ou pauvre critères et leurs coordonnées sont disponibles à un utilisateur comme une liste en fonction de leurs positions consécutives le long du fichier d&#39;entrée. </li><li> Après achèvement de l&#39;analyse d&#39;IRM pour la séquence choisie, un utilisateur peut lancer un nouveau processus dans la même page Web en apportant des changements aux paramètres et / ou les fichiers d&#39;entrée. Par exemple, afin d&#39;examiner l&#39;échantillon préalablement généré au hasard # 1 avec les mêmes paramètres d&#39;IRM, l&#39;utilisateur a seulement besoin de modifier le fichier à analyser des options et sélectionnez l&#39;option &quot;userfile_rand1_4&quot; fichier, puis appuyez sur le bouton Fichier Analyser de nouveau. Un nouveau fichier et l&#39;affichage graphique remplacera l&#39;ancien. Les résultats et les chiffres de tous les examens sous chaque &quot;session lable» (GMRI identifiant) sera enregistrée et sera disponible pendant deux semaines à partir de la dernière activité. Afin de sauvegarder les résultats / figueres de façon permanente, l&#39;utilisateur doit sélectionner le &quot;Télécharger les fichiers&quot; onglet (rangée du haut) et télécharger toute la session ou des fichiers individuels, selon les besoins. </li><li> Avec cette page web Analyzer IRM, un utilisateur peut étudier <ul><li> (G + C) et riche (A + T)-régions riches </li><li> Purine (A + G) et riche en pyrimidine (C + T) des régions riches </li><li> Keto (G + T)-riche et aminés (A + C) des régions riches en </li><li> Une des régions riches et pauvres Une </li><li> Régions riches en G et G-pauvres </li><li> T-régions riches et les pauvres en T </li><li> C-riche et C-régions pauvres </li></ul></li><li> La dernière version de génomique IRM a une nouvelle option pour l&#39;étude des régions riches en purine avec (R) / pyrimidine (Y) les modèles d&#39;alternance qui pourraient se former ADN-Z conformations. Actuellement, cette option est disponible à partir du lien &quot;ADN-Z&quot; et il fonctionne sur la même base que les autres régions susmentionnées IRM. Un utilisateur doit sélectionner des seuils supérieurs et inférieurs pour le nombre de (RY + YR) dinucléotides se chevauchent dans la fenêtre de numérisation. Le programme produit une sortie similaire graphique et un fichier de segments d&#39;ADN enrichi et appauvri en alternant les purines et les pyrimidines. L&#39;ADN-Z putatifs régions doivent être hautement enrichi par l&#39;alternance R / Y bases (voir la revue de F &amp; F 2011). </li></ol> 6. Programmes supplémentaires dans le paquet génomique IRM (en option). Les ressources génomiques IRM a également deux options avancées pour la génération de très spécifique des séquences aléatoires. Ils sont disponibles à travers le «Générateur d&#39;IRM» et «CDS générateur&quot; onglets dans la rangée du haut. <ol><li> Générateur de séquences IRM crée randomisés avec la même composition oligonucléotide comme le fichier d&#39;entrée (similaire à l&#39;ISR générateur). Toutefois, en plus, des séquences aléatoires imiter un modèle particulier l&#39;IRM spécifié par l&#39;utilisateur. Dans cette page web d&#39;un utilisateur doit spécifier dans une liste déroulante un modèle particulier l&#39;IRM pour être imité. La boîte de liste contient tous les motifs qui ont été examinés dans cette session par IRM analyseur (par exemple &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;). Une séquence aléatoire générée avec cette option aura la même composition oligonucléotide comme le fichier d&#39;entrée sélectionnée et également les mêmes riches en GC et-mauvaises habitudes comme on le voit dans &quot;userfile_GC_50_35 .. 15». </li><li> CDS générateur est utilisé pour la randomisation des séquences codant pour des protéines. Il préserve la même séquence d&#39;acides aminés que celui codé par l&#39;entrée spécifiée par l&#39;utilisateur. En outre, le programme conserve le même codon et di-codon préjugés comme spécifié dans le choisis par l&#39;utilisateur table d&#39;entrée. La version en ligne du générateur de CDS accepte également une séquence protéique comme entrée. Toutes les autres options pour le programme sont offerts uniquement via des scripts autonomes Perl disponible pour téléchargement à partir de la page Web principale génomique IRM. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Ce protocole permet à un utilisateur d&#39;étudier la composition inhomogénéité des séquences nucléotidiques. Surtout, il supporte aussi la génération d&#39;une variété de séquences aléatoires avec une composition proche de celle d&#39;oligonucléotides de séquences d&#39;entrée. Habituellement, les séquences génomiques des eucaryotes complexes ne sont pas homogènes dans leur composition, mais représentent plutôt une mosaïque complexe de segments de séquences enrichies par les nucléotides particulier (par exemple, riches en purines, (G + T)-riche, (A + T)-riche, etc.) Ces modèles à mi-plage d&#39;échelle (30-1000 pb) sont visualisés par la sortie graphique de l&#39;analyseur d&#39;IRM qui montre sélectionnés riches en contenu que les segments supérieurs des pointes bleues et le contenu des pauvres segments inférieurs des pointes rouges (voir les figures 1 et 2). Typiquement, le nombre des régions éventuellement riches en contenu et le contenu des pauvres dans une séquence naturelle (figure 1) est de l&#39;ordre de fois plus élevé que le nombre des mêmes types de régions correspondantes séquences randomisées (figure 2) ayant le même oligonucléotide composition. Ces segments de séquence avec milieu de gamme inhomogénéité dans la composition des nucléotides peuvent être d&#39;intérêt pour l&#39;utilisateur. Ils sont disponibles à partir des fichiers de sortie génomique IRM pour complément d&#39;enquête. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un exemple de la sortie de l&#39;analyseur graphique de l&#39;IRM de l&#39;étape 5.7. Les résultats ont été obtenus sur un échantillon de 44 introns humains. Barres bleues représentent les positions des régions riches en GC le long de ces introns. Les barres rouges représentent GC-pauvres (ou riches en AT) IRM régions. L&#39;axe des y contient les seuils supérieurs et inférieurs pour le type de contenu donné. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. IRM sortie de l&#39;analyseur pour la séquence aléatoire &quot;userfile.rand1_4&quot;. Le GraphiReprésentation cal de l&#39;IRM dans une séquence aléatoire généré en utilisant le programme générateur de l&#39;ISR. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Un exemple du début d&#39;un fichier de sortie textuelle de l&#39;analyseur d&#39;IRM. Toutes les séquences riches en contenu et le contenu des pauvres détecté par le programme sont présentés dans la dernière (quatrième) de la colonne. Leur position relative, mesurée en nombre de fenêtres, sont présentés dans la première colonne. Les deuxième et troisième colonnes sont des indicateurs pour les régions riches en contenu et le contenu des pauvres, respectivement.

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

Les régions à composition nucléotidique inhomogène au milieu de gamme des échelles (30-1000 nucléotides) sont surabondants dans les génomes des eucaryotes complexes et peuvent être trouvés nulle part (régions intergéniques, les introns, des exons régions non traduites, les éléments répétitifs). Ces régions sont souvent associées à l&#39;ADN conformations inhabituelles. Par exemple, les séquences purine-/pyrimidine-rich ont tendance à former des triplex ADN (H-ADN); séquences avec alternance de purine / pyrimidine bases sont associées à des ADN-Z conformations; (G + C)-régions riches présentent des anomalies structurelles dans le B- ADN et pourrait être sujette à un clivage colonne vertébrale; (A + T)-régions riches pourraient former une structure inhabituelle - un ADN dénouement élément; etc (revu par Fedorov et Fedorova 2010). Certains de ces modèles de milieu de gamme (par exemple (G + T)-régions riches) sont à peine étudiées et attendent toujours l&#39;exploration approfondie et de reconnaissance. L&#39;objectif principal de notre ressource Web génomique IRM est d&#39;aider les utilisateurs dans l&#39;identification de ces régions IRM pour leur analyse expérimentale plus loin et pour l&#39;exploration de leurs fonctions possibles. La connaissance des régions IRM pourrait être incorporé dans et à améliorer la nouvelle génération de programmes prédicteur génétique (Shepard 2010) et de faire progresser notre compréhension des fonctions du génome et les propriétés.

<ul><li> Ordinateur connecté à Internet </li><li> Les fichiers avec des séquences de nucléotides pour examen. </li></ul>

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

Des régions non codantes génomique chez les eucaryotes complexes, y compris les zones intergéniques, les introns et d&#39;exons non traduits segments, sont profondément non-aléatoire dans leur composition en nucléotides et se composent d&#39;une mosaïque complexe de schémas séquence. Ces modèles comprennent ce qu&#39;on appelle Mi-Range Inhomogénéité (IRM) des régions - 30-10000 séquences nucléotides de long qui sont enrichies par une base ou d&#39;une combinaison de bases (par exemple (G + T)-riches, riches en purines, etc ). IRM régions sont associées à des structures d&#39;ADN inhabituels (non-B-forme) qui sont souvent impliqués dans la régulation de l&#39;expression génique, la recombinaison, et d&#39;autres processus génétiques (Fedorova &amp; Fedorov 2010). L&#39;existence d&#39;un biais de la fixation solide au sein des régions IRM contre les mutations qui ont tendance à réduire leur inhomogénéité séquence supporte en outre les fonctionnalités et l&#39;importance de ces séquences génomiques (Prakash et al. 2009). Ici nous démontrons une ressource Internet librement disponibles - l&#39;ensemble des programmes génomiques IRM - (. Bechtel et al 2008) conçu pour l&#39;analyse informatique de séquences génomiques afin de trouver et de caractériser les différents modèles d&#39;IRM en leur sein. Ce package permet également la génération de séquences aléatoires avec des propriétés différentes et le niveau de correspondance avec les séquences d&#39;ADN naturelles d&#39;entrée. L&#39;objectif principal de cette ressource est de faciliter l&#39;examen de vastes régions des régions non codantes d&#39;ADN qui sont encore peu étudiés et attendent d&#39;exploration approfondie et de reconnaissance.

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Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Nous présentons un site Web public de calcul pour l&#39;analyse des séquences génomiques. Il détecte les schémas de séquences d&#39;ADN avec les diverses organisations non-aléatoire de nucléotides compositions. Cette ressource génère également des séquences aléatoires avec les divers niveaux de complexité.

Genomic IRM - une ressource publique pour l&#39;étude des schémas de séquence dans l&#39;ADN génomique

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K vues.  University of Toledo Health Science Campus. Nous présentons un site Web public de calcul pour l'analyse des séquences génomiques. Il détecte les schémas de séquences d'ADN avec les diverses organisations non-aléatoire de nucléotides compositions. Cette ressource génère également des séquences aléatoires avec les divers niveaux de complexité.

Vidéo: Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolement de l&#39;ADN génomique de souris Tails

Recherche

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l&#39;environnement

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Etudier Instabilité génomique fonction de l&#39;âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Une méthode pratique et roman d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.