Cette étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (GM071440 au CH et NS051630/MH076090/MH078972 à PJ).

1. La fragmentation ADN génomique Fragment d&#39;ADN génomique en utilisant sonication à une gamme de taille souhaitée adapté à la plate-forme de séquençage du génome entier. (En général, nous soniquer à ~ 300 pb.) Vérifier la distribution de la taille de l&#39;ADN génomique fragmenté sur gel d&#39;agarose 1% (Figure 1). 2. Préparation de l&#39;ADN Déterminer les quantités d&#39;ADN à partir basées sur l&#39;abondance de la 5-HMC dans l&#39;ADN génomique. Depuis le 5-HMC niveaux varient considérablement dans différents types de tissus, des quantités d&#39;ADN à partir dépendre des niveaux de 5-HMC des échantillons. S&#39;il vous plaît se référer au tableau 1 pour des exemples. 3. β-GT réaction catalysée (Réaction de transfert de glucose) <ol><li> Mélanger à la pipette le mélange comme indiqué dans le tableau 2 et incuber dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 1 heure. </li><li> Après incubation, nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides, utilisant 10 pg d&#39;ADN parcolonne. Éluer avec 30 pl d&#39;eau par colonne et se combinent. </li></ol> 4. La réaction de biotinylation (Cliquez Chimie) <ol><li> Ajouter DBCO-SS-biotine conjugué Peg3-solution de travail (1 mM) dans la solution d&#39;ADN élué (à partir de l&#39;étape 3) à une concentration finale de 150 uM (soit 5 ul de solution de travail pour 30 solution d&#39;ADN ul). </li><li> Mélanger à la pipette et incuber dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 2 heures. </li><li> Nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides. Le volume d&#39;élution idéal totale est de 100 ul. </li><li> Quantifier la quantité d&#39;ADN récupéré à l&#39;aide spectrophotomètre échelle du microlitre (p. ex., NanoDrop). </li></ol> 5. La capture de 5-HMC ADN contenant <ol><li> Lavez 50 pi de Dynabeads MyOne C1 streptavidine 3 fois avec 1 ml de B &amp; W 1X tampon conformément aux instructions du fabricant. Séparer les billes avec un support magnétique. </li><li> Ajouter un volume égal de tampon 2X B &amp; W pour le récupéré D biotinyléNA (100 ul) pour les billes lavées. </li><li> Incuber pendant 15 min à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur. </li><li> Séparer les billes avec un support magnétique et laver les billes 3 fois avec 1 ml de tampon 1X B &amp; W. </li><li> Éluer l&#39;ADN par incubation des billes dans 100 ul de fraîchement préparée DTT 50 mM pendant 2 h à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur. </li><li> Séparer les billes avec un support magnétique. Aspirer l&#39;éluant et la charge sur un Micro Bio-Spin 6 Colonne selon les instructions de fabrication pour enlever la TNT. L&#39;ADN cible est présent dans la solution. </li><li> Purifier l&#39;ADN élue de l&#39;étape précédente par Qiagen PCR Purification Kit MinElute et éluer l&#39;ADN dans 10 pl de tampon EB. Quantifier l&#39;ADN en utilisant fluorimètre qubit, ou NanoDrop si la concentration est supérieure à 20 ng / ul. L&#39;ADN est prêt pour aval du génome entier de préparation bibliothèque séquençage. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Si le joint de la qualitéf ADN génomique est élevée, les rendements de récupération typiques après la β-GT et les réactions sont biotinylation ~ 60-70%. Cependant, l&#39;efficacité de captage varient considérablement en fonction des types de tissus différents en fonction des niveaux de 5-HMC des échantillons. En règle générale, l&#39;efficacité de captage de l&#39;ADN génomique du cerveau est d&#39;environ 4-9%, et dans certains cas extrêmes, le rendement peut atteindre jusqu&#39;à 12%. Pour les cellules ES, l&#39;efficacité de captage moyenne est d&#39;environ 2-4%, contrairement à ~ 0,5% pour les cellules souches neurales. La faible efficacité vu jusque là est pour l&#39;ADN génomique à partir de cellules cancéreuses. Tout l&#39;ADN enrichi est prêt pour la prochaine génération de standards protocoles de préparation de la bibliothèque. En outre, l&#39;ADN capturée peut également être utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel pour détecter l&#39;enrichissement de quelques fragments d&#39;ADN par rapport à l&#39;entrée, si les amorces liées sont disponibles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Figure 1. Soniquées homme fragments d&#39;ADN génomique dans1% gel d&#39;agarose. 10 pg d&#39;ADN génomique isolé à partir de cellules iPS humaines dans 120 ul de tampon TE 1X a été soniquée à l&#39;aide d&#39;un dispositif de sonication (Covaris). Après sonication, 2 pl de l&#39;ADN soniqué a été chargé sur un gel d&#39;agarose 1% en utilisant 100 pb de l&#39;ADN marqueur pour comparer les tailles des fragments d&#39;ADN soniqué. <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Eau </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de 10 X Réaction β-GT </td><td> 2 pl </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Jusqu&#39;à 10 mg d&#39;ADN génomique </td><td> _ Pl </td><td> Jusqu&#39;à 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 ul </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 1 pl </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 20 pi </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Pour l&#39;ADN génomique des tissus (haute teneur en 5-HMC&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Eau </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de 10 X Réaction β-GT </td><td> 10 pl </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Jusqu&#39;à 20 mg d&#39;ADN génomique </td><td> _ Pl </td><td> Jusqu&#39;à 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> Ul 1,33 </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 2 pl </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 40 pi </td><td></td></tr></tbody></table> ii) Pour l&#39;ADN génomique de cellules souches (médiane 5-HMC contenu ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Eau </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de 10 X Réaction β-GT </td><td> 10 pl </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Jusqu&#39;à 50 mg d&#39;ADN génomique </td><td> _ Pl </td><td> Jusqu&#39;à 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 ul </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 5 pl </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 100 pi </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Pour l&#39;ADN génomique des cellules cancéreuses (faible teneur en 5-HMC ~ 0,01%) Tableau 1. Exemples de quantités d&#39;ADN d&#39;entrée et de réactions de marquage utilisant des échantillons avec différents niveaux de 5-HMC par la méthode de marquage chimique sélective. <table border="1"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> 5-HMC niveau </strong&gt; </td><td> ADN de départ (pg) </td><td> La récupération après l&#39;étiquetage (entrée à billes) (pg) </td><td> Rendement de récupération </td><td> Pull-down ADN (ng) </td><td> Pull-down rendement </td></tr><tr><td> Cervelet de souris adulte </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Postnatal du cervelet de souris 7 jours </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Souris cellules ES E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Résultats représentatifs à partir de tissus de cerveau de souris et des cellules ES.

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l&#3...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commenter </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium 5M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M pH 8,0 acide éthylène diamine (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma de base (Tris) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-biotine conjugué Peg3- </td><td> Cliquez sur Outils Chimie </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-dithiothréitol, ultrapure (TNT) suprapur </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick suppression de nucléotides </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Colonne </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen PCR Purification Kit MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucose </td><td> Active Motif </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzyme </td></tr><tr><td> β-glucosyltransférase (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Dispositif de sonication </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse bureau </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Appareil de gel running </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pied de séparation magnétique </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 fluorimètre </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 10 Configuration réactif X β-GT tampon de réaction (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X à relier et de lavage (B &amp; W) tampon (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, 0,02% de Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l&#39;ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l&#39;expression des gènes, le maintien de l&#39;intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer 1. Récemment, la présence d&#39;un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales 2-4. 5-HMC est généré par l&#39;oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases 2, 3. 5-HMC est proposé de participer à l&#39;entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote 2, 5-10. Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC 11 </sup&gt;. Pour élucider la biologie de la 5-HMC, nous avons développé une approche chimique très efficace et sélective d&#39;étiqueter et de capturer 5-HMC, profitant d&#39;une enzyme bactériophage qui ajoute une fraction de glucose à 5 HMC spécifiquement 12. Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l&#39;étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l&#39;ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d&#39;une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l&#39; modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l&#39;étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l&#39;étiquetage quelle que soit l&#39;abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d&#39;ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d&#39;une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d&#39;ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération. Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d&#39;ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d&#39;une seule base de 5-HMC.

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Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l&#39;aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l&#39;enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d&#39;étiquetage efficace et spécifique permet l&#39;enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

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11.9K vues.  Emory University School of Medicine. Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençag...