Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, la Colombie-Britannique, de développement des connaissances du Fonds, Génome Colombie-Britannique et la British Columbia Ministry of Forests and Range de soutenir les études en cours sur la productivité des sols forestiers. SL a été soutenu par une bourse de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution.

Partie I: Extraction d&#39;ADN Procédure 1. 8 heures sont nécessaires, pour le traitement des 6 échantillons excluant la quantification de l&#39;ADN. Avant de commencer l&#39;extraction, vous aurez besoin de pré-froid de mortier, un pilon et une spatule dans un congélateur à -20 ° C ou en utilisant l&#39;azote liquide. En outre, pré-froid des tubes de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme alcool isoamylique (24:1) sur la glace. Réglez le four à hybridation à 65 ° C à préchauffer. Vérifiez solution de CTAB, s&#39;il est cristallisé chaude à 60 ° C pour faire fondre les cristaux. Remplissez la solution de dénaturation et de tampon d&#39;extraction en ajoutant les ingrédients dernier juste avant de commencer l&#39;extraction (voir la recette ci-dessous). Effectuer toutes les procédures d&#39;extraction dans une hotte. 2. Préparer le tampon de dénaturation et de tampon d&#39;extraction. Remarque: Afin de maximiser le rendement de l&#39;ADN, il est essentiel de faire des tampons avec précision en suivant les instructions. 3. Placer 2 g de sol dans un mortier pré-réfrigérée. Remarque: Le sol prélevés sur le terrain doivent être congelés sur glace sèche pour le transport et conservés à -80 ° C. Décongeler et le sol en utilisant un tamis tamis de 2 mm avant l&#39;extraction de l&#39;ADN. Vous pouvez augmenter le montant de départ du sol jusqu&#39;à 10 g. 4. Ajouter 1 ml de solution dénaturante sur le sol. 5. Gel et broyer le sol en azote liquide 2 en utilisant un pilon jusqu&#39;à ce que les particules du sol poudreux et chercher homogène. Répétez congélation et broyage à deux reprises. Remarque: Conservez l&#39;échantillon de sol gelé pendant le broyage, en utilisant suffisamment d&#39;azote liquide pour couvrir entièrement l&#39;échantillon de sol. Légère fondre lors du broyage est acceptable. 6. Transfert sol-chaussée d&#39;un tube conique de 50 ml avec une spatule de pré-réfrigérée. Note: L&#39;échantillon de sol au sol peuvent être conservés à -80 ° C à ce point, si nécessaire. 7. Ajouter 9 ml de tampon d&#39;extraction. Pour mélanger la solution et le sol, brièvement au vortex à basse vitesse. Remarque: Pour s&#39;assurer que le tampon est homogène, il chaude à 60 ° C pendant 10-15 minutes avant utilisation. Gardez le reste de tampon à 60 ° C tout au long de l&#39;extraction. Vortex à vitesse 8 (sur une échelle où 10 est le maximum). 8. Incuber pendant 40 min à 65 ° C dans un four à hybridation. Durant l&#39;incubation, les tubes tournent en permanence à la vitesse la plus basse, ou retourner doucement les tubes toutes les 10 min. Remarque: Placer le tube horizontalement dans un four à hybridation pour permettre tampon contact avec le sol sur une grande surface. La solution peut sembler un peu visqueux, pendant l&#39;incubation. 9. Centrifuger à 1800 x g pendant 10 min à 10 - 14 ° C. Transférer le surnageant dans la pré-réfrigérée tube conique de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme-alcool isoamylique (24:1), rester sur la glace. Remarque: Lorsque vous transférez surnageant, veillez à ne pas perturber la couche organique (couche inférieure). Laisser 1-2 ml de surnageant si elle est nécessaire afin de recueillir uniquement le surnageant propre. Vous pouvez voir souvent une couche beige (environ 1-3 mm d&#39;épaisseur) sur le dessus du surnageant. Ne pas déranger cette couche lors de la collecte du surnageant. Essayez de faire glisser la pointe le long de la paroi du tube pour éviter les bris de cette couche beige. Si le surnageant est trop trouble, répéter l&#39;extraction d&#39;alcool isoamyle chloroforme-une fois de plus sur le surnageant. Ne pas utiliser les pipettes en plastique jetables lors du transfert de chloroforme, le chloroforme va fondre le plastique. Utiliser une pipette en verre, ou un verre graduée, ou verser directement dans le chloroforme 50 ml tubes coniques. 10. Extrait des pastilles de sol 2 fois plus; 10.1. Ajouter 5 ml d&#39;un tampon d&#39;extraction des granulés du sol, mélanger délicatement à l&#39;aide une astuce ml suivie par vortex brièvement à faible vitesse. Remarque: Agiter et mélanger le tampon avant utilisation. 10.2. Incuber à 65 ° C pendant 10 min dans le four d&#39;hybridation. Centrifuger à 1800 x g pendant 10 min à 10 - 14 ° C. Transférer le surnageant dans le tube à l&#39;étape 9. Gardez le tube avec surnageant recueilli et le chloroforme-alcool isoamylique sur la glace lors de l&#39;extraction. Remarque: Assurez-vous d&#39;ajouter le surnageant dans le même tube sans croix de mélange entre les échantillons. 10.3. Répétez 9.1 et 9.2 une fois de plus. 11. Utiliser une plaque tournante, très doucement le tube de roche qui contient le surnageant recueilli (14-19 ml) et de chloroforme-alcool isoamylique à 1,25 rpm pendant 10 min. Remarque: Fermez le couvercle très serré pour empêcher les fuites. Placez une serviette en papier sur la plaque bascule avant de placer le tube de sorte que toute fuite peut être facilement détectée. 12. Centrifuger à 1800 x g pendant 20 min à 10 - 14 ° C. 13. Transfert phase aqueuse dans un nouveau tube. Note: Ne pas déranger l&#39;interphase entre la phase aqueuse (couche supérieure) et organisationsnique (couche inférieure) lorsque vous transférez le surnageant. Laissez environ 1,5 à 2 ml surnageant afin d&#39;assurer la collecte de seulement surnageant propre. 14. Récupérer l&#39;ADN en utilisant l&#39;alcool isopropylique (étape 15.a - 21.a). Sinon, utilisez Amicon ® Ultra-Centrifuge 15 dispositifs de filtrage (étape 15.b - 21.b) si vous vous attendez très faible quantité de biomasse dans votre échantillon, qui produira à peine visible à granulés par précipitation d&#39;alcool isopropylique qui est difficile à récupérer. 15.a. Placer le surnageant dans un nouveau tube d&#39;ultracentrifugation. 16.a. Ajouter l&#39;alcool isopropylique pour le surnageant recueilli dans un rapport de volume de 0,6:1. Inverser les tubes doucement quelques fois pour mélanger. Incuber 17.a pendant 30 min à température ambiante. 18.a. Centrifuger à 16000 x g, pendant 20 min à 20 - 25 ° C. S&#39;assurer que le poids de tous les tubes sont équilibrés, bien avant l&#39;étape de centrifugation. Remarque: Repérer le sens de la force centrifuge sur le tube, de sorte que vous pouvez détecter le culot d&#39;ADN plus facilement lorsque le rendement en ADN est faible. 19.a. Retirer l&#39;alcool isopropylique par décantation ou aspiration sous vide. Attention à ne pas perturber le culot d&#39;ADN. Remarque: Retirez l&#39;alcool isopropylique, dès que la centrifugation est terminée. Soyez très prudent pour ne pas perdre le culot d&#39;ADN. La taille du culot d&#39;ADN peut varier considérablement selon le type de sol, de façon visible clairement (diamètre ~ 9 mm) pour à peine visible. Il est recommandé d&#39;enlever les résidus d&#39;alcool isopropylique par aspiration le long de la paroi du tube soigneusement afin de ne pas aspirer le culot d&#39;ADN. 20.a. Dry culot d&#39;ADN à température ambiante pendant 5 - 20 min. Note: Ne pas trop sèche culot d&#39;ADN, sinon il sera difficile à redissoudre l&#39;ADN. 21.a. Reprendre le culot d&#39;ADN dans 200 ul de TE. Il Mélanger en tapotant doucement. Transférer la solution d&#39;ADN en tube de 1,5 ml. Garder le tube à 4 ° C pendant la nuit, afin de dissoudre complètement l&#39;ADN. Remarque: Selon la taille des granulés, vous pouvez régler le volume de TE à ajouter. Habituellement de 200 à 400 ul de TE fonctionne bien. * Ou suivez les étapes 15.b - 21.b. 15.b. Pré-lavage Amicon ® Ultra-Centrifuge 15 dispositifs de filtrage, ajouter 15 ml de TE à l&#39;appareil et centrifuger à 3500 x g pendant 10 min. Jeter l&#39;effluent à travers. 16.b. Placer la solution d&#39;ADN de l&#39;étape 13 au filtre Amicon pré-lavés. Centrifuger à 3500 x g jusqu&#39;à ce que le volume ADN est réduite à 200 - 500 pi. Jeter l&#39;effluent à travers. 17.b. Laver l&#39;ADN avec TE deux fois; ajouter 10 ml de TE aux dispositifs Amicon filtre. Centrifuger à 3500 x g jusqu&#39;à ce que le volume ADN est réduite à environ 200 pi. Jeter l&#39;effluent à travers. Répéter une fois de plus. 18.B. Transférer la solution d&#39;ADN sur le filtre à un nouveau tube de 1,5 ml. 19.b. Ajouter 40 ul de TE au filtre Amicon. Lavez les deux côtés de membranes de filtration par aspiration et refoulement, afin de récupérer tout résidu d&#39;ADN sur le filtre. Ajouter cette solution de lavage pour le tube à 18.B. étape 20.b. Si nécessaire, l&#39;ADN peut être davantage concentrés par Microcon ® Ultracel YM-30 Unité de filtre centrifuge; pré-laver le filtre en ajoutant 200 ul de TE et la centrifugation à 10000 xg pendant 7 minutes. Ajouter la solution d&#39;ADN sur le filtre et centrifuger à 5000 x g pendant 1 min. Répétez jusqu&#39;à ce que la centrifugation quantité de solution d&#39;ADN sur le filtre réduit à 50 pi environ. Remarque: Le volume maximal de l&#39;échantillon initial pour Microcon filtre est de 500 pi. Ne pas centrifuger à une vitesse supérieure à 14 000 x g. Ne pas trop centrifugeuse jusqu&#39;à la membrane sèche complètement. Assurez-vous que certains liquides couvre encore le filtre après centrifugation. Si vous plus centrifugé et la membrane est sèche, puis ajouter 15 ul de TE, agiter doucement pendant 30 secondes, et passez à l&#39;étape 21.b. 21.b. Placez l&#39;unité de filtre à l&#39;envers dans un tube et centrifuger Microcon nouvelles à 1000 xg pendant 3 minutes pour récupérer les ADN. 22. Quantifier l&#39;ADN du gel par TAE (0,8%, 0.5xTAE, 50 V pour 4 heures), et par spectrophotomètre Nanodrop ou Pico-vert dosage et lecteur de plaque. Nota: Un montant ADN peut être estimée en comparant la bande de l&#39;échantillon à la bande de marqueur à la concentration connue (Haute marqueur d&#39;ADN moléculaire ou λHindIII) sur le gel. 23. Vérifier l&#39;intégrité de l&#39;ADN de haut poids moléculaire en utilisant électrophorèse en champ pulsé (PFGE) avec 1%, 1xTAE gel (Pour plus de détails, voir l&#39;Étape II, part2 au <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 par Taupp et al 2009).. Note: Vous pouvez utiliser régulièrement un gel d&#39;agarose à cet effet QC lieu de basse température de fusion d&#39;agarose. En bref, électrophorèseconditions résistance sont comme suit: 2-250 ko, 6 volts, initiales temps de commutation: 5 sec, temps final de commutation: 15 sec, une durée de 12 heures à 14 ° C. SYBR Gold coloration pendant une heure pour visualiser l&#39;ADN sur le gel. 24. Si le poids moléculaire de l&#39;ADN extrait sont satisfaisants, puis passez à l&#39;étape suivante de centrifugation en gradient de CsCl. Alternativement, l&#39;ADN peut être conservé à -20 ° C ou -80 ° C avant la centrifugeuse CsCl. La taille médiane de l&#39;ADN devrait être l&#39;égal ou supérieur à 36 Ko, si vous voulez construire une bibliothèque d&#39;insérer grande métagénomique ADN. Partie II. Purification d&#39;ADN à l&#39;aide de césium ultracentrifugation en gradient de chlorure de Préparation de la centrifugeuse: 1,5 - 2 heures Étape de centrifugation: 18 heures Retrait de bromure d&#39;éthidium (BET) et concentre l&#39;ADN après centrifugation: 3 heures Procédure Pour plus de détails, reportez-Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Résultats Représentant / résultat Le montant total de l&#39;ADN génomique isolé à partir de 2 g de forêt organique du sol (O horizon) et horizons minéraux (Ae, AB et Bt horizons) (échantillon de la productivité des sols à long terme (LTSP) site situé à Skulow lac, BC, Canada et gérés par BC Ministry of Forests and Range) variait de 10 mg à 180 mg. La taille médiane de l&#39;ADN isolé a été généralement entre 40 - 60 Ko (figure 1). Le rapport de l&#39;absorbance à 260 nm a été nm/280 entre 1.3 à 1.6 et il y avait un pic à 230 nm, ce qui peut indiquer une contamination acide humique souvent observé dans les échantillons de sol. La centrifugation en gradient de CsCl considérablement réduit cette contamination et a également augmenté le ratio de 260 / 280-1.8 - 1.9 Comme le montre la figure 2a et 2b. <img src="files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. ECP photos de l&#39;ADN génomique extrait avant ultracentrifugation CsCl. lane1: 1 ko marqueur de 100 ng, piste 2: λHind III marqueur de 100 ng, piste 3: λHind III marqueur de 250 ng, piste 4: λHind III marqueur de 500 ng, lane5: fosmide 36 ko marqueur de 100 ng, voies 6 et 7: génomique l&#39;ADN isolé à partir du sol minéral horizon Ae, couloir 8 et 9: l&#39;ADN génomique isolé de l&#39;AB horizon minéral du sol sur le site LTSP situé Skulow Lake, C.-B. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /></a> Chromograms Figure 2. De l&#39;ADN génomique détecté par spectrophotomètre avant (A) et après ultracentrifugation CsCl (B). Notez la réduction de la valeur d&#39;absorbance à la longueur d&#39;onde nm 230 après ultracentrifugation CsCl, ce qui indique une amélioration dans la qualité de l&#39;ADN génomique.

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Recette * Solution dénaturante 4 M Guanidine isothiocyanate 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) EDTA 1 mM 0,5% de 2-mercaptoéthanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solution de dénaturation: 10 ml au total </td></tr><tr><td> Isothiocyanate de guanidine (MW 118.16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter de l&#39;eau à 9,95 ml au total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter 50 ul de 2-mercaptoéthanol juste avant utilisation. (5 ul de 2-mercaptoéthanol par 1 ml Solution dénaturation) Remarque: Conservez la solution dénaturante à 4 ° C. Ne pas utiliser de tampon plus d&#39;une semaine. Si possible, faire tampon frais d&#39;utilisation. </td></tr></table> Tampon d&#39;extraction ** 100 mM de tampon phosphate de sodium [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM d&#39;EDTA [pH 8,0] 1,5 M de NaCl Bromure de Hexadecyltrimethylammonium 1% (CTAB) 2% de SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampon d&#39;extraction pour 1 litre au total </td></tr><tr><td> Sodium 1M tampon phosphate [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tris-HCl 1M [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave et le conserver à température ambiante. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter 200ml, le bromure Hexadecyltrimethylammonium 5% (CTAB, autoclave) et 100 ml, 20% de SDS (autoclave) juste avant utilisation. Si CTAB a été cristallisé, le faire fondre à 60 ° C. * Buffer phosphate de sodium 1M: 57,7 ml, de sodium 1M phosphate monobasique (NaH 2 PO 4) et 42,3 ml, 1 M phosphate de sodium dibasique (NaH 2 PO 4). Ajuster le pH à 7,0 Note: Ne pas utiliser 20% de SDS si elle a des précipitations. Il est normal de voir la suspension laiteuse quand vous ajoutez à la solution de SDS. Une fois que vous ajoutez SDS, placer le tampon d&#39;extraction à 60 ° C pour assurer la SDD est ainsi suspendu. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Le microbiome sol est un réservoir vaste et relativement inexploré de la diversité génomique et l&#39;innovation métabolique qui est intimement associé à des éléments nutritifs et flux d&#39;énergie dans les écosystèmes terrestres. La culture indépendante génomique environnementale, aussi connu comme métagénomique, les approches promets un accès sans précédent à cette information génétique à l&#39;égard de la reconstruction et la voie de criblage fonctionnel à des fins thérapeutiques de grande valeur et des processus de conversion de la biomasse. Toutefois, le microbiome sol reste encore un défi largement dû à la difficulté d&#39;obtenir un ADN de haut poids moléculaire d&#39;une qualité suffisante pour la production d&#39;insérer grande bibliothèque. Ici, nous introduisons un protocole pour l&#39;extraction de haut poids moléculaire, l&#39;ADN génomique microbienne communauté de sols et les sédiments. La qualité de l&#39;ADN génomique isolé est idéal pour la construction de grands insertion environnementale des banques génomiques pour des applications de séquençage et de dépistage en aval. La procédure débute par la lyse cellulaire. Les parois cellulaires et les membranes des microbes sont lysées par les deux forces mécaniques (broyage) et chimiques (β-mercaptoéthanol). L&#39;ADN génomique est ensuite isolé en utilisant un tampon d&#39;extraction, le chloroforme-alcool isoamylique et d&#39;alcool isopropylique. Les tampons utilisés pour la lyse et des étapes d&#39;extraction comprennent isothiocyanate de guanidine et le bromure de hexadécyltriméthylammonium (CTAB) pour préserver l&#39;intégrité de l&#39;ADN génomique de haut poids moléculaire. Selon votre application en aval, l&#39;ADN génomique isolé peut être davantage purifiée en utilisant du chlorure de césium (CsCl) ultracentrifugation en gradient, ce qui réduit les impuretés, notamment des acides humiques. La première procédure, l&#39;extraction, il faut environ 8 heures, à l&#39;exclusion étape quantification de l&#39;ADN. L&#39;ultracentrifugation en gradient de CsCl, est un processus en deux jours. Pendant toute la procédure, l&#39;ADN génomique devrait être traitée en douceur pour éviter le cisaillement, éviter les vortex sévère et répétitif pipetage rudes.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l&#39;ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Research

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Biology

25.6K vues.  University of British Columbia - UBC. Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l'ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolement de l&#39;ADN génomique de souris Tails

Recherche

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic IRM - une ressource publique pour l&#39;étude des schémas de séquence dans l&#39;ADN génomique

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Une méthode pratique et roman d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Extraction d'ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Isolement de l'ADN génomique de souris Tails

Extraction de l'ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

Génération d'ADN / ARN hybrides d'ADN génomique par la transformation en utilisant l'ARN contenant Oligonucléotides

Genomic IRM - une ressource publique pour l'étude des schémas de séquence dans l'ADN génomique

Extraction d'ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

Extraction d'ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

Une méthode pratique et roman d'extraire l'ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Capture d'sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l'ADN génomique

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l'ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d'intégration