Fabrication Moule en silicone Lithographie Matériaux: <ul><li> 75 tranches de silicium mm </li><li> SU-8 2 photoresist négatif (Microchem, Boston, MA) </li><li> N2 </li></ul> Méthode: <ol><li> Déshydrater wafer silicium à 120 ° C pendant 2 heures. </li><li> UV traitement de surface d&#39;ozone pendant 7 minutes pour enlever des matières organiques. </li><li> De surface soufflent N2 pour éliminer les particules. </li><li> Appliquer SU-8 2 pour couvrir 70% de la surface (~ 10 ml pour 75 plaquette mm). </li><li> Centrifuger à 2000 rpm pendant 20 secondes avec une accélération 300 tr / s. </li><li> Placer la galette sur une plaque chauffante et la rampe de la température ambiante à 95 ° C. </li><li> Softbake la résine pendant 15 minutes à 95 ° C. </li><li> Flood exposent plaquette pour 20 - 25 mJ/cm2 dose à 365 nm (I-line) pour former la couche inférieure. </li><li> Appliquer SU-8 2 pour la couche photosensible secondes. </li><li> Spin à 550 rpm pendant 20 secondes avec une accélération 300 tr / s pour un film d&#39;environ 11 um d&#39;épaisseur. </li><li> Placer la galette sur une plaque chauffante et la rampe de la température ambiante à 65 ° C. </li><li> Softbake la plaquette à 65 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Rampe de la plaque de cuisson de 65 ° C à 95 ° C. </li><li> Softbake la galette pendant 55 minutes à 95 ° C. </li><li> Plaquette refroidir à température ambiante pendant 20 minutes. </li><li> Aligner le masque sur la plaquette et mPAD exposer pour 95 à 100 mJ/cm2 dose à 365 nm (I-line). </li><li> Placer la galette sur une plaque chauffante et la rampe de la température ambiante à 95 ° C. </li><li> Post-exposition cuire la résine pendant 25 minutes à 95 ° C. </li></ol> Développer Matériaux: <ul><li> Plats en verre 100mm (5) </li><li> Le propylène glycol méthyl éther acétate (PGMEA) </li><li> Isopropanol (IPA) </li><li> N2 </li></ul> Méthode: <ol><li> Dans une hotte chimique, combler cinq plats avec PGMEA (2), IPA, et l&#39;hexane (2). </li><li> Tenez plaquette en 1ère PGMEA pendant 10 secondes </li><li> Agiter plaquette pendant 50 secondes </li><li> Transfert à la 2e tranche de PGMEA avec ménisque du PGMEA. </li><li> Agiter pendant 5 secondes. </li><li> Transfert plaquette d&#39;IPA avec ménisque du PGMEA. </li><li> Agiter pendant 20 secondes. </li><li> Transfert plaquette au 1er IAP. </li><li> Agiter pendant 5 secondes. </li><li> Transfert à l&#39;IPA plaquette 2e. </li><li> Agiter pendant 5 secondes. </li><li> Enlever rapidement les plaquettes de l&#39;IPA 2ème avec ménisque de l&#39;IPA et sec avec N2 </li><li> Inspectez motif. </li><li> Plaquette Hardbake à 120 ° C pendant 14-20 heures pour réticuler SU-8. </li><li> Dés la plaquette avec un tailleur de diamants </li><li> Montez la plaquette sur une lame de verre à l&#39;aide d&#39;époxy </li><li> Fluorosilanize la plaquette (voir les instructions dans le moulage de réplication) </li></ol> Le moulage de la réplication du mPADS Moule négatif Matériaux: <ul><li> Aluminium jetables pesant bateau </li><li> Agent de polydiméthylsiloxane (PDMS) de base et de durcissement (Dow, Midland, MI) </li><li> Razorblade </li><li> Silane: (tridécafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-trichlorosilane </li><li> Lame de verre </li><li> Pipette Pasteur en verre </li></ul> Méthode: <ol><li> Mélanger PDMS 10:01 en poids et dégazer en sous vide pendant 1 heure pour éliminer les bulles. </li><li> Placez moule maître de silicium dans un bateau en aluminium. </li><li> Verser 50 - 60 g de PDMS sur moule maître de bateau en aluminium. </li><li> Degas sous vide pendant 30 minutes pour enlever les bulles. </li><li> Soufflez des bulles d&#39;air piégées dans la surface-PDMS souffle rapide de N2. </li><li> Bateau Mettre au four à convection à 110 ° C pendant 15 minutes jusqu&#39;à ce que le PDMS est ferme. </li><li> Coupez bateau en aluminium. </li><li> Avec lame de rasoir, rogner PDMS dessous de silicium maître. </li><li> Peler PDMS loin de maîtrise de silicium lentement et avec le mouvement constant dans une direction pour éviter de détruire le maître. </li><li> Inspectez maître de silicium pour les dommages. </li><li> Couper moule négatif en 4 morceaux. </li><li> Répétez les étapes 1-10 pour un grand lot de moules négatifs. </li><li> Plasma d&#39;oxygène traiter moule négatif de 1,5 minutes pour activer la surface, ou </li><li> Ozone traiter moule négatif pendant 10 minutes pour activer la surface. </li><li> Placer les moules dans la négative dessicateur avec des fonctionnalités mPAD exposés. </li><li> Fais 250-500 ul de silane sur lame de verre dans le centre de dessiccateur </li><li> Placez la pipette en verre avec des pâturages 150-200 uL de silane dans le bout intérieur de dessiccateur. </li><li> Chambre à vide à s&#39;évaporer silane et du pelage des moules négatifs pour les&gt; 14 heures. </li></ol> mPADS Matériaux: <ul><li> Agent de polydiméthylsiloxane (PDMS) de base et de durcissement (Dow, Midland, MI) </li><li> Col large pipettes de transfert jetables </li><li> 2 &quot;x 3&quot; lames de verre </li><li> Scribe verre </li><li> N2 </li></ul> Méthode: <ol><li> Mélanger PDMS 10:01 en poids et dégazer en sous vide pendant 1 heure pour éliminer les bulles. </li><li> dentelles silanisé moules négatifs en «croix» </li><li> Pipeter PDMS dans des moules négatifs de sorte que les fonctionnalités sont entièrement couverts d&#39;une épaisseur de 1 mm. </li><li> Attendre 30 minutes pour les bulles d&#39;air dans le PDMS à monter à la surface. &lt;/ Li&gt; <li> En 30 &#39;indisponibilité, de la poussière de verre 22x22mm lamelles (n ° 2) avec un courant de N2. </li><li> Oxygène diapositives plasma traitent le verre moitiés de 1,5 minutes pour nettoyer et activer le verre </li><li> Soufflez des bulles d&#39;air piégées dans la surface-PDMS souffle rapide de N2. </li><li> Posez délicatement du bord du verre sur la lamelle PDMS avec le côté du plasma nettoyé en face du PDMS. Abaissez lentement la lame de verre pour que le PDMS totalement contact avec la surface du verre et d&#39;éviter les bulles d&#39;air se trouver piégé sous le lame de verre. </li><li> Placer les moules dans les assemblées four à convection à 110 ° C pendant 20 heures pour sécher complètement. </li><li> Retirer les moules du four et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Tenez lame de verre avec une main sur le dessus et retirez lentement l&#39;écart négatif le moule négatif à partir du bas pour libérer le mPAD. </li><li> Inspectez le mPAD sous un microscope pour des postes effondrés. </li><li> Re-silaniser moule via le plasma et le silane tous les quatre pièces coulées. La durée de vie moule négatif pour la réplication est d&#39;environ 60 à 20 bonnes moulages. </li></ol> Cellules ensemencement sur mPADS Estampillage Matériaux: <ul><li> PDMS des timbres pour UCP (voir Tien, J &amp; Chen, CS, dans les méthodes de l&#39;ingénierie tissulaire, 2001, p. 113-120.) </li><li> L&#39;éthanol (100% et 70%) </li><li> Eau stérilisée désionisée </li><li> 50 pg / ml de fibronectine humaine dans l&#39;eau déminéralisée stérile (BD Biosciences) </li><li> 5 ug / ml, solution DiI filtrée avec membrane de 0,2 um (D-3886, Molecular Probes, OU) </li><li> 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey) </li><li> Solution 1X tampon phosphate. </li><li> 100 mm x 25 mm boîte de Petri (4) </li><li> 150 mm x 25 mm boîte de Petri (2) </li><li> Le papier d&#39;aluminium </li><li> N2 </li><li> Pince à épiler </li><li> Hotte stérile </li></ul> Méthode: <ol><li> Garniture excès de PDMS à partir mPADs </li><li> Si le timbre en PDMS a été utilisé précédemment, soniquer timbres dans de l&#39;éthanol à 100% pendant 5 minutes pour frotter loin protéines contaminantes. </li><li> Dans hotte stérile, maintenez timbres sur leurs côtés avec des pincettes et sec avec N2 après trempage dans de l&#39;éthanol timbres 100% frais et l&#39;eau stérile </li><li> Placer dans 150 mm boîte de Petri avec le travail vers le haut. </li><li> Aliquoter gouttes de solution de fibronectine sur chaque timbre. Commencez par les coins sur chacun des timbres, puis les bords, et enfin les régions de l&#39;intérieur. Initialement la surface du timbre en PDMS est hydrophobe, mais devient hydrophile que la protéine est adsorbée. Travail &quot;extérieur vers l&#39;intérieur&quot; change l&#39;angle de contact du PDMS afin qu&#39;un faible volume de solution de fibronectine est nécessaire pour bien enrober les timbres. </li><li> Laisser reposer pendant 1 heure dans le capot pour l&#39;adsorption des protéines. </li><li> Laver à l&#39;eau DI timbres en versant dans le plat et laisser le niveau d&#39;eau augmenter au cours des timbres. </li><li> Lavez timbres dans 100 mm boîte de Petri remplie d&#39;eau DI. </li><li> Retirez et sécher avec N2. </li><li> MPADS traiter l&#39;ozone pendant 7 minutes pour activer la surface d&#39;estampage. </li><li> Sous le capot, le cachet mPADS en plaçant bord de timbre sur les mPAD et doucement pour faire baisser le plein contact. Frapper légèrement le haut du timbre avec des pincettes pour s&#39;assurer que toutes les régions ont un bon contact, mais attention à ne pas l&#39;effondrement des postes. </li><li> Retirez délicatement timbres avec des pincettes. </li><li> MPADS Submergez dans 100 boîtes de Pétri mm avec 100% d&#39;éthanol pour ~ 15 secondes. Gardez micro-aiguilles de démouillage lors du transfert par le transfert rapide entre les plats. </li><li> MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri à l&#39;éthanol 70% pour les ~ 15 secondes. </li><li> MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri avec de l&#39;eau DI pour ~ 15 secondes. </li><li> MPADS Submergez dans le deuxième boîte de Pétri de 100 mm avec de l&#39;eau DI pour ~ 15 secondes. </li><li> MPADS Submergez dans 150 boîtes de Pétri mm avec de l&#39;eau DI. </li><li> MPADS Submergez dans 150 boîtes de Pétri mm avec 100 ml de solution de DII. </li><li> Couvrir de papier aluminium et laisser tremper pendant 1 heure. </li><li> MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri avec de l&#39;eau DI pour ~ 15 secondes. </li><li> MPADS Submergez dans 150 boîtes de Pétri mm avec 10 ml de Pluronics 2% et 90 ml de PBS pour la concentration totale de Pluronics 0,2%. </li><li> Couvrir et laisser tremper pendant 1 heure. </li><li> MPADS Submergez dans 100 mm boîte de Petri avec de l&#39;eau DI pour ~ 15 secondes. </li><li> MPADS Submergez dans le deuxième boîte de Pétri de 100 mm avec de l&#39;eau DI pour ~ 15 secondes. </li><li> MPADS Submergez en troisième boîte de Pétri de 100 mm avec du PBS pour ~ 15 secondes. </li></ol> Semis Matériaux: <ul><li> Lignée cellulaire choisie </li><li> Trypsine-EDTA (0,25% de trypsine avec EDTA • 4NA, Cat Gibco. N ° 25200-056) </li><li> Milieu de croissance </li><li> Solution 1X tampon phosphate. </li></ul> Méthode: <ol><li> Dans hotte stérile, mPADS lieu en 100 mm boîte de Petri et de remplir avec 17 ml de milieu. </li><li> Placez boîte de Petri dans un incubateur à réchauffer à 37 ° C </li><li> Suspendre les cellules par la trypsine </li><li> Aspirer à plusieurs reprises pour briser des amas de cellules. </li><li> Suspension de cellules de pipette dans la boîte de Pétri avec le mPADS. Ajouter ces cellules, ils resteront des cellules individuelles (sans contacts cellule-cellule) au moment de l&#39;analyse. Le montant exact de cellules à ajouter est un type de cellule spécifique etdépend de zone de propagation des cellules et le taux de croissance. </li><li> Doucement se dispersent dans les cellules boîte de Pétri avec pippetting lente. </li><li> Placer dans un incubateur pendant 2 heures pour permettre aux cellules de s&#39;établir et de se conformer sur micro-aiguilles. </li><li> Inspectez mPADS pour voir si les cellules se sont propagées. Les cellules se penchera aplati et durée de six ou plus de postes. </li><li> Si les cellules sont réparties, le transfert à de nouveaux mPADS boîte de 100 mm de Pétri avec 21 ml de milieu frais. </li><li> Le mPADS sont prêtes pour votre expérience. </li></ol> Coloration et montage mPADS Fixation Matériaux: <ul><li> L&#39;eau déminéralisée </li><li> Paraformeldahyde (16%) flacon </li><li> 10X solution tampon phosphate. </li><li> Solution 1X tampon phosphate. </li></ul> Méthode: <ol><li> Dans un tube de 50 ml à centrifuger, ajouter 30 ml de di, 10 ml de paraformeldahyde (flacon entier), et 4,5 mL de PBS 10X pour la solution de fixation. </li><li> Ajouter ~ 25 mL de solution à la fixation d&#39;un plat de Pétri de 100 mm. </li><li> Doucement submerger mPAD avec des cellules dans la fixation de plat et laisser incuber pendant 20 minutes. </li><li> MPADS Submergez dans 100 mm avec plat du PBS 1X à trois reprises. </li><li> Prêt pour immunocoloration et de montage. </li></ol> Analyse des Forces cellulaire sur mPADS Imagerie confocale Matériaux: <ul><li> Microscope confocal </li><li> Objectif 63X </li><li> Cubes de filtre pour les anticorps secondaires </li><li> Filtre vert cube (rhodamine) pour DiI imagerie de micro-aiguilles. </li></ul> Méthode: <ol><li> MPADs place sur scène et de trouver des cellules individuelles d&#39;exposition avec 300 ms, pas de binning. </li><li> Sommets Image de micro-aiguilles d&#39;image supérieure. </li><li> En utilisant z-contrôle de lecture, capture d&#39;images de micro-aiguilles d&#39;image du bas. </li><li> Image d&#39;autres canaux que vous avez des taches dans (Hoechst, phalloïdine etc) </li></ol> Image Analysis Matériaux: <ul><li> MATLAB avec Image Processing Toolbox </li></ul> Méthode: <ol><li> Rotation et d&#39;enregistrer des images en haut et en bas </li><li> Centroïdes Mesure de bas (déviés) et supérieure (dévié) postes </li><li> Calculer le déplacement </li><li> Utilisation de la constante de ressort pour les postes (connue, dépend de la géométrie de poste), calculer vecteur de force à chaque poste </li><li> Analyse d&#39;erreur est basé sur la capacité de résoudre des forces, et dépend de la résolution de l&#39;image et la résolution de détection centroïde </li><li> Organiser les données selon vos besoins personnalisés - par exemple grandeurs vigueur, et / ou la direction, comme un cours du temps, de nombreuses mesures dans des conditions différentes, etc </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

Dans cette vidéo, nous allons présenter notre approche pour mesurer les forces de traction cellulaire en utilisant un large microfabriqué de postes. Les forces de traction sont générées par la myosine-actine interactions et jouer un rôle important dans notre physiologie. Au cours du développement, ils permettent aux cellules de se déplacer d&#39;un endroit à l&#39;autre afin de former les structures début des tissus. Les forces de traction aider dans le processus de guérison. Ils sont nécessaires à la bonne fermeture de plaies ou de la migration des leucocytes et de ramper à travers notre corps. Ces mêmes forces peuvent être nuisibles à notre santé en cas de métastases du cancer ou de croissance vasculaire vers une tumeur. La méthode la plus commune par laquelle l&#39;étude des cellules in vitro a été d&#39;utiliser un verre ou un plat en polystyrène. Cependant, la rigidité des substrats rend impossible de mesurer physiquement les forces de traction cellulaire, et il existe des méthodes relativement peu d&#39;étudier les forces de traction. Notre laboratoire a développé une technique pour surmonter ces limitations. La méthode est basée sur un réseau vertical de cantilevers flexible, la rigidité et la taille de l&#39;échelle qui sont telles que les cellules individuelles réparties sur de nombreuses consoles les détourner dans le processus. Les piliers que nous utilisons sont de 3 m de diamètre, 10 um de haut, et sont configurés dans un réseau régulier avec 9 um centre à centre de l&#39;espacement. Mais ces dimensions physiques peuvent être facilement variées pour accueillir une variété d&#39;études. Nous commençons avec un maître de silicium, mais les messages finales sont faites de caoutchouc de silicone appelée poly (diméthyl siloxane), ou PDMS. Nous pouvons mesurer les déformations sous un microscope et de calculer la magnitude et la direction des forces de traction requise pour produire des déviations observées. Nous appelons ces substrats microfabriqué après-array-détecteurs ou mPADs. Ici, nous allons vous montrer comment nous fabriquons et utiliser le mPADs d&#39;évaluer les modulations de la contractilité cellulaire.

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Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Dans cette vidéo, nous démontrons comment fabriquer et utiliser des détecteurs matriciels microfabriqué poste (mPADs) pour évaluer les modulations de la contractilité cellulaire.

Microfabriqués post-Array-détecteurs (mPADs): une approche pour isoler les forces mécaniques

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

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Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K vues.  University of Pennsylvania. Dans cette vidéo, nous démontrons comment fabriquer et utiliser des détecteurs matriciels microfabriqué poste (mPADs) pour évaluer les modulations de la contractilité cellulaire.

Vidéo: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utiliser Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) pour développer des outils diagnostiques

Recherche

Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Une approche alternative pour la préparation de l&#39;échantillon avec une faible Nombre de cellules d&#39;analyse TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Évaluation de Dictyostelium discoideum réponse à la Stimulation mécanique aiguë

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Une méthode de sortie élevée pour isoler les péricartétes cérébraux de la souris

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...