Ce travail a été soutenu par le Prix de carrière Burroughs Wellcome à l&#39;interface scientifique (ARD), le National Institutes of Health à travers le directeur du NIH Programme Innovateur Prix Nouveau 1-DP2-OD007078 (ARD), le William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), et le Stanford Cardiovascular Institute Jeune bourse pré-doctorale (JC). Les auteurs tiennent à remercier James pour le prêt Spudich équipement de microscopie.

1. Préparation des cellules de débit <ol><li> Lamelles (# 1.5, 22x22 mm et 22x40 mm, VWR) sont nettoyés à l&#39;aide sonication. <ol><li> Ajouter les lamelles d&#39;un petit récipient en verre capable de tenir les lamelles et le montage dans le sonicateur (voir étape 2). </li><li> Remplissez le récipient avec de l&#39;isopropanol et sonifier dans un bain sonique pendant 20 minutes. </li><li> Jeter l&#39;isopropanol et rincer les lamelles avec de grandes quantités d&#39;eau déminéralisée produite par un appareil Barnsted MilliQ ou un dispositif similaire. Remplissez le récipient avec de l&#39;eau et à une sonication pendant 20 minutes. </li><li> Après sonication, sécher les lamelles dans un flux d&#39;eau filtrée, air exempt de poussière. Utilisez seulement des lamelles qui apparaissent propres (c.-à-pas de bavures). </li><li> Doucement la flamme des lamelles pour quelques secondes afin de les nettoyer de toute poussière et l&#39;humidité restante: passer les lamelles à travers une flamme de gaz produite avec un bec Bunsen, en prenant soin de ne pas déformer la lamelle en raison de l&#39;excès de chaleur. Cette étape supprime la surface résiduellecontaminants. </li></ol></li><li> En utilisant du scotch double face, fixez les deux lamelles ensemble. Couper la bande ~ 3 cm de longueur et 0,3 cm de largeur. Attacher la bande sur la lamelle mm 22x40 laissant un canal 1,6 cm au milieu. Utiliser un embout de pipette pour appuyez doucement sur la lamelle afin de s&#39;assurer que la bande a bien respecté. </li></ol> 2. Configuration magnétique Pince à épiler et d&#39;étalonnage <ol><li> Pinces magnétiques ont été installés à l&#39;aide permanents aimants de terres rares comme décrit précédemment 10,12. Un support en L en aluminium a été construit avec un trou d&#39;épingle de 1 mm de diamètre et monté sur une verticale z-traducteur (Thorlabs) pour moduler la hauteur des pinces. Deux permanents de terres rares aimants sont fixés au support de chaque côté du trou d&#39;épingle pour créer le piège magnétique (figure 1). </li><li> Préparation de l&#39;ADN: l&#39;ADN de phage lambda marqué à son extrémité 5 &#39;et 3&#39; extrémités avec de la biotine et la digoxigénine (IDT ADN, San Diego, CA) a été utilisée pour calibrer le magpinces magnétiques. <ol><li> Mélanger 50 uL de 4 nM λ-ADN avec 2 pi de 40 nM oligonucléotide conjugué biotine et de la chaleur à 60 ° C pendant 10 minutes. Puis, lentement, laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Ajouter ligase d&#39;ADN selon les spécifications du fabricant et ligaturer à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Ajouter 2 ul de 400 nM oligonucléotide digoxigénine conjugué et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. </li><li> Ajouter 1,5 pi de 10 mM d&#39;ATP et continuer la ligature de l&#39;oligonucléotide conjugué à la digoxigénine l&#39;ADN-λ pendant 3 heures. </li><li> Retirez les oligonucléotides en excès et la ligase ADN à l&#39;aide de 100 filtres de spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un total de l&#39;échange de tampon de 1000 fois dans du tampon TE est suffisant pour éliminer les oligos excédentaires. Remarque: Il est important de ne pas utiliser des vitesses d&#39;essorage&gt; 500xG parce qu&#39;elle conduira à la tonte de l&#39;ADN. </li><li> Examiner un échantillon de l&#39;ADN par électrophorèse sur un gel d&#39;agarose à 0,7% pour que l&#39;ADN in&#39;est pas dénaturé ou cisaillés. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN. L&#39;utilisation d&#39;un Nanodrop spectromètre UV-Vis (Thermo Scientific) est recommandée car le volume d&#39;échantillon disponible peut être très faible. </li></ol></li><li> Préparer les cellules de flux tel que décrit dans l&#39;article 1. </li><li> Pour la fixation de l&#39;ADN à la cellule de flux, ajoutez anticorps anti-digoxigénine (IgG de mouton; 1 pg mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Allemagne) et de lui permettre d&#39;adhérer à la surface du verre pendant 15 minutes. </li><li> Passiver la surface de la cellule d&#39;écoulement pour empêcher le collage non spécifique de l&#39;ADN par addition de 2 mg ml de BSA -1, 0,1% de Tween-20 dans du PBS 1x. Incuber à température ambiante pendant 45 minutes. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5. </li><li> Ajouter 50 pM de fuctionalized λ-ADN et permettent d&#39;attacher à la lamelle pendant 15 minutes. </li><li> Laver tout excédant d&#39;ADN avec 1x PBS. </li><li> Ajouter billes superparamagnétiques recouvertes de streptavidine (billes 1 um = 2 pg mL -1; 2,8 um = perles 20 pg ml -1 </sjusqu&#39;à&gt;) et de leur permettre de joindre à l&#39;ADN immobilisé pendant 15 minutes. </li><li> Laver excès de billes avec 1x PBS. </li><li> Magnétique d&#39;étalonnage Brucelles <ol><li> Déplacer les aimants permanents à une position qui est éloignée de la surface d&#39;échantillon (&gt; 15 mm). </li><li> Placez la cellule d&#39;écoulement préparée dans le microscope. </li><li> Déplacer les aimants permanents en position au-dessus de la cellule d&#39;écoulement. </li><li> Choisissez le plan focal de λ-ADN billes fonctionnalisées en se concentrant sur les perles loin de surfaces de verre les deux. Le plan focale correcte est celui dans lequel les perles ont un centre souhaités lumineuse. </li><li> Prenez une vidéo du mouvement talon à 80 Hz ou plus pour 500 cadres. </li><li> Déplacer l&#39;aimant plus proche de la surface d&#39;échantillon. Pour les distances supérieures de 5 mm, déplacer par incréments de 1 mm. Pour les distances entre 1 et 5 mm, déplacer par incréments de 0,5 mm. Pour les distances inférieures à 1 mm, déplacer par incréments de 0,25 mm. </li><li> Répétez les étapes 2.11.5 et 2.11.6 à chaque position de l&#39;aimant nouvelle. </li><li> Pour chaque ensemble de donnéesdéfinir, suivre le centre des billes en utilisant un ajustement 2D gaussien. </li><li> Calculer la force par l&#39;intermédiaire des fluctuations browniennes en utilisant: </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> où k B T est l&#39;énergie thermique de Boltzmann, L est la longueur de λ-ADN, et &lt;x 2&gt; est la variance dans la position centroïde. <ol start="10"><li> Confirmez l&#39;exactitude des forces en cochant la calcul de la force par l&#39;intermédiaire d&#39;un ajustement du spectre de puissance de Lorentz afin de trouver la fréquence Atténuation. Force appliquée est liée à la fréquence rolloff par la relation: </li></ol><img alt="L&#39;équation 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> Où 0 est la fréquence ƒ rolloff, a est le rayon de talon, et μ est la viscosité du fluide 12. </li></ol> 3. Pièce jointe Peptide de collagène pour Cellules à écoulement Afin de donner un exemple concret de l&#39;application de notre méthodologie, nous décrivons les travaux récents de notre laboratoire qui caractérise la protéolyse d&#39;un peptide modèle collagène trimérique. Nous prévoyons que cette approche générale peut être largement appliquée à d&#39;autres protéines et polynucléotides. <ol><li> Le peptide modèle collagène consiste en une N-terminale 6x His-tag pour la purification, suivie par un code 5x myc, (PPM) de 10 à appliquer formation de triple hélice, le collagène a1 résidus 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), qui forment la MMP- une site de reconnaissance, la séquence foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), et un KKCK C-terminale de faciliter le marquage avec la biotine-maléimide. Foldon dérive de la protéine T4 fibritin-phage, et stabilise trimères modèle de collagène lorsqu&#39;il est fondu à l&#39;extrémité N - ou C-terminale 13,14. </li><li> Le peptide de collagène et de MMP-1 protéines ont été exprimées et purifiées comme décrit précédemment 4,15. &lt;/ Li&gt; <li> Ajouter anti-myc (15 ug mL -1) à la cellule d&#39;écoulement et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre à l&#39;anti-myc à joindre à la surface de la cellule d&#39;écoulement. </li><li> Passiver la cellule d&#39;écoulement afin de prévenir de fixation non spécifique de protéines en utilisant 5 mg ml -1 BSA de la même manière que décrit dans l&#39;étape 2.5. </li><li> Ajouter 150 peptide de collagène pM et lui permettre de joindre à l&#39;anticorps par l&#39;intermédiaire du tag myc pendant 45 minutes. </li><li> Laver excès de collagène à l&#39;aide du tampon PBS. </li><li> Ajouter des billes de streptavidine superparamagnétiques revêtu (1 perles um = 2 pg mL -1 et 2,8 um = perles 20 pg mL -1) et de leur permettre de se fixer aux molécules de collagène pendant 45 minutes. Les perles de 1 um doit être dilué à la concentration souhaitée dans du PBS. Les 3 perles um doit être séparé de la solution en utilisant des aimants puissants, alors en solution dans du PBS. Ce processus doit être répété 3 fois. Nous avons remarqué que cette étape est essentielle pour GEt les 3 perles um de se lier à la surface immobilisée peptide de collagène. </li></ol> 4. Essai protéolyse vigueur <ol><li> Une fois la cellule de flux est assemblé avec le peptide de collagène et des billes magnétiques, l&#39;image de la cellule de flux dans le piège magnétique sous peu, ~ 1 pN vigueur. Dans notre expérience, une sous-population des perles est parfois faiblement collée à la surface d&#39;une manière non-spécifique. L&#39;application de la force modeste veille à ce que ces perles sont libérés. </li><li> Ajouter une enzyme activée à la cellule d&#39;écoulement. Dans ce cas, MMP-1 a été pré-activée en ajoutant 3,5 mM APMA (4-aminophénylmercurique acétate) et incubées à 37 ° C pendant 3 heures. L&#39;activation a été vérifiée par SDS-PAGE. </li><li> Dès que la cellule de flux est ré-introduit dans l&#39;appareil magnétique pince à épiler, enregistrer une vidéo couvrant quelques champs de vue, généralement céder plusieurs centaines de perles attachées. Ce sera t = 0. </li><li> Répétez le même processus d&#39;enregistrement de plusieurs champs de vue (alors qu&#39;il rentrait to le même champ de vision) en des points de temps réguliers, jusqu&#39;à ce que toutes les perles se détachent ou pas encore protéolyse est perceptible. </li><li> Kinetic analyse des données <ol><li> Compter les perles dans les différents domaines de vue à différents moments et de les moyenner. Normaliser le nombre de billes en divisant le nombre moyen de billes à chaque point temporel par le nombre de billes à l&#39;instant t = 0. Cela garantit que nous pouvons comparer les taux de protéolyse à partir d&#39;expériences différentes, parce que le nombre absolu de perles sera différent d&#39;une expérience à. </li><li> Tracer le rapport en tant que fonction du temps. Dans ce cas, nous l&#39;avons monté sur une décroissance exponentielle plus une constante. </li></ol><img alt="L&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> où f (t) est le rapport des perles attachées (ou les molécules de collagène unproteolyzed), t est le temps, a est la fraction de billes attachés par une attache collagène, b est le taux de décroissance constante, et cest la fraction de billes qui sont attachés de manière non spécifique. <ol start="3"><li> La même expérience est répétée à force variable et les concentrations de MMP-1 pour élucider l&#39;effet de la force sur la protéolyse du collagène par la MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs Le protocole ci-dessus décrit une nouvelle utilisation de pinces magnétiques (Figure 1) pour étudier l&#39;effet de la force sur la protéolyse enzymatique. Nous calibré la pince à épiler pour 1 pm et 3 perles um utilisant à la fois l&#39;ampleur des fluctuations observées browniens et le calcul de la fréquence roll-off à des positions différentes aimant (Figure 2). Dans les expériences de protéolyse de force, la configuration est similaire, sauf que l&#39;ADN est remplacé par du collagène (figures 3, 4). Le nombre normalisé de billes restantes peuvent être tracées en fonction du temps pour trouver les taux de protéolyse (Figure 5), et ce processus peut êtrerépétée pour différentes concentrations d&#39;enzymes et des forces. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du processus d&#39;étalonnage piège magnétique (pas à l&#39;échelle). Deux aimants permanents de terres rares créer un champ magnétique qui tire sur le bourrelet superparamagnétique. Traduire l&#39;aimant de haut en bas permet de régler la force appliquée. Les perles sont imagées en utilisant un classique champ lumineux microscope avec la lumière qui traverse un trou d&#39;épingle entre les deux aimants Encart:. Image prise avec un objectif 40x air. Les tranchants, des points ronds correspondent aux billes attachés à la surface de lamelle. Les objets out-of-discussion sont des perles détachées. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> Figure 2. Graphiques de force calibrée en fonction de la distance aimant de la surface d&#39;échantillon de 1 pm (gauche) et 2,8 microns (droite) de talons. Les données ont été ajustées à la fonction empirique <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> , Où x est la distance entre l&#39;aimant. Une = 31,8, b = 5,61, et c = 4,39 pour les billes 1 um et une = 140, b = 3,10 et c = 1,86 pour les bourrelets 3 um. Ces valeurs sont spécifiques à notre instrument spécifique et de la géométrie expérimentale, et chaque instrument doit être étalonné individuellement. Les barres d&#39;erreur à chaque point représentent une variabilité ~ 10% en force appliquée sur un bourrelet à base de talon, en raison de la variabilité de la taille des billes. La force appliquée est proportionnelle au volume des perles, et le volume varie bourrelet ~ 9% par rapport à la moyenne (selon les spécifications du fabricant). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> Figure 3. Configuration dosage force la protéolyse (Pas à l&#39;échelle). Le modèle de trimère collagène est fixée à la surface de la lamelle intermédiaire myc / anti-myc conjugaison. Les billes revêtues de streptavidine superparamagnétiques sont attachés à des trimères de collagène par une liaison biotine-streptavidine. Activé MMP-1 coupes du collagène dans le temps, provoquant les billes de se détacher de la surface et de s&#39;éloigner du plan focal. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> Figure 4. Dessin schématique d&#39;une protéolyse en fonction du temps. La caricature montre un champ de l&#39;échantillon de vue au fil du temps que la protéolyse se produit. Au fil du temps, MMP-1 coupe le collagène et les perles se détacher et de s&#39;éloigner du plan focal, sous l&#39;influence du champ magnétique. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> Taux de protéolyse Figure 5. Dépendent force appliquée 16. Montré sont données recueillies à 1,0 pN (3 uM MMP-1, noir), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rouge) et 13 pN (0,2 uM MMP-1; magenta). Les taux de protéolyse (paramètres de l&#39;ajustement) sont les suivantes: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 pN), et 2,08 ± 0,18 min -1 (13 pN). La fraction de perles unproteolyzed à des moments longs (&gt; 15 minutes) reste à peu près constante à ~ 0,25 travers différentes expériences. Les barres d&#39;erreur correspondent à la statistique de Poisson, reflétant le nombre d&#39;observations à chaque instant. L&#39;erreur à chaque point temporel pour les billes n est le n 1/2. L&#39;erreur dans la fraction de perles attachées a été calculé par erreur propagation.1 perles um ont été utilisées pour 1,0 et 6,2 pN pN expériences et 2,8 um perles ont été utilisés pour des expériences pN 13.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce protocole décrit une nouvelle utilisation d&#39;une technique seule molécule classique. Pinces magnétiques permettent à moyen et à haut débit des tests de molécules simples d&#39;une manière rentable. Cependant, comme toutes les techniques expérimentales il ya des défis et les pièges potentiels. Limitations de pinces magnétiques Par rapport à un piège optique de la résolution spatiale et temporelle d&#39;un appareil de MT est faible. En outre, les ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Micro couvercle en verre # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro couvercle en verre # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> ADN ligase T4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc Anticorps </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 streptavidine </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-aminophénylmercurique Acétate </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotine-maléimide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Marquée à la biotine oligo </td><td> IDT ADN </td><td> Synthèse à façon </td></tr><tr><td> Digoxigénine marqué oligo </td><td> IDT ADN </td><td> Synthèse à façon </td></tr><tr><td> Collagènegène du peptide </td><td> ADN 2.0 </td><td> Synthèse à façon </td></tr><tr><td> MMP-1 d&#39;ADNc </td><td> Base de données de Harvard plasmide </td><td></td></tr><tr><td> z-traducteur </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Contrôleur de servomoteur pour les traducteurs </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

La génération et la détection des forces mécaniques est un aspect omniprésent de la physiologie cellulaire, en rapport direct avec le cancer métastatique 1, 2 et athérogenèse cicatrisation de la plaie 3. Dans chacun de ces exemples, les cellules à la fois exercer une force sur leur environnement et, simultanément, par voie enzymatique de remodeler la matrice extracellulaire (MEC). L&#39;effet des forces sur ECM est donc devenue un domaine d&#39;intérêt considérable en raison de son importance biologique et médicale susceptible 4-7. Techniques molécules simples telles que le piégeage optique 8, microscopie à force atomique 9, et des pinces magnétiques 10,11 permettre aux chercheurs de sonder la fonction des enzymes au niveau moléculaire en exerçant des forces sur les protéines individuelles. Parmi ces techniques, pinces magnétiques (MT) sont remarquables par leur faible coût et à haut débit. MT exercer des forces dans la gamme de ~ 1-100 pN et peut fournir milliseconde résolution temporelle,qualités qui sont bien adaptés à l&#39;étude du mécanisme enzymatique à la molécule seul niveau 12. Nous rapportons ici un test MT hautement parallélisable pour étudier l&#39;effet de la force sur la protéolyse de molécules de protéines uniques. Nous présentons l&#39;exemple spécifique de la protéolyse d&#39;un peptide de collagène trimérique par la matrice métalloprotéinase 1 (MMP-1); cependant, ce test peut être facilement adapté à l&#39;étude d&#39;autres substrats et des protéases.

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Dans cet article, nous décrivons l&#39;utilisation de pinces magnétiques pour étudier l&#39;effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l&#39;échelle de la molécule unique d&#39;une manière hautement parallélisables.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K vues.  Stanford University. Dans cet article, nous décrivons l'utilisation de pinces magnétiques pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l'échelle de la molécule unique d'une manière hautement parallélisables.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

S&#39;étendant de courtes séquences d&#39;ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Recherche

Bio-ingénierie

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Numérisation rapide résonance paramagnétique électronique ouvre de nouvelles voies pour l&#39;imagerie physiologiquement Paramètres importants<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...