This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. la culture de cellules sur Micropost Arrays Remarque: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour assurer la stérilité. Les volumes sont indiquées ici pour des flacons de culture T25 cellulaire. La densité de la recette et ensemencement cellulaire milieu de culture cellulaire sont optimisés pour les lignées cellulaires de cancer de l&#39;os HuO9 et M132. <ol><li> Préparer une culture de cellules pour l&#39;ensemencement sur un réseau de micro-message. <ol><li> Inspecter la qualité d&#39;une culture de cellules en plaçant le flacon de culture sur un microscope optique standard. Veiller à ce que les cellules montrent une croissance et une morphologie en estimant la quantité de fond de flacon de culture est couvert. Une couverture de 70% -80% reflète un taux de croissance saine. Faites attention à la quantité de cellules flottantes, car ils représentent les cellules mortes et / ou une culture envahie. </li><li> Trypsiniser les cellules en éliminant milieu et on lave avec 4 ml 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) tampon. Ajouter 0,8 ml de trypsine 1x / acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incubation à température ambiante jusqu&#39;à ce que la cellules déloger, ce qui prend environ 2-4 min. Vérifier le processus avec le microscope et parfois appuyez sur le flacon doucement pour soutenir le délogement. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire (le milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / F12 avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de pénicilline / streptavidine (Pen / Strep)) pour arrêter la réaction et pour laver les cellules résiduelles qui siègent encore sur le fond du flacon. Par la suite pipette cette suspension monter et descendre plusieurs fois pour obtenir un mélange homogène. Assurez-vous de la pipette toutes les solutions à travers la zone de croissance d&#39;origine du flacon pour obtenir un délogement efficace. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de table à 0,5 g pendant 3 min. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu par aspiration et refoulement 5 fois. Veillez à éviter la formation de bulles en le faisant. </li><li> Déterminer la densité cellulaire en utilisant une chambre de comptage de cellules et une lumière microscope. Vérifier la suspension de cellules dans la chambre de comptage de cellules pour des agrégats de cellules et s&#39;assurer d&#39;avoir seulement des cellules individuelles pour l&#39;expérience suivante. Pipette à nouveau de haut en bas plusieurs fois si les cellules ont tendance à former des agrégats de les séparer. </li><li> Diluer la suspension cellulaire avec du milieu suffisante pour obtenir une solution de cellules de 25.000 cellules / ml. Bien mélanger en inversant le tube fermé à plusieurs reprises. </li></ol></li><li> Préparer un réseau de micro-message pour l&#39;ensemencement des cellules. Remarque critique: Ne pas pipeter sur le réseau de micro-message directement car cela pourrait potentiellement nuire les microposts, en particulier lorsque des bulles indésirables sont introduits. En outre, assurez-vous que le réseau de micro-message ne sèche jamais comme se produisant forces capillaires conduisent à l&#39;effondrement des micro-messages. <ol><li> Placer le substrat de verre avec la matrice de micro-message face dans un puits d&#39;une plaque à 12 puits en utilisant une paire de pinces et de le mouiller par addition de 1 ml d&#39;éthanol (99%). Incuber à température ambiante pendant 20-30 secondes. </li><li> Diluer l&#39;éthanolpar étapes en ajoutant environ 1 ml de l&#39;eau déminéralisée stérile (eau DI) sur le côté du puits et aspirer environ 1 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert ou d&#39;un dispositif d&#39;aspiration. Répétez cette étape au moins 3 fois. </li><li> Remplacer l&#39;eau déminéralisée avec du PBS-tampon de la même façon par addition d&#39;aspiration et environ 1 ml. Répétez cette étape 3 fois. </li><li> Remplacer le tampon PBS avec du milieu par addition d&#39;aspiration et environ 1 ml de milieu. Répétez cette étape 3 fois. </li></ol></li><li> Solution de la pipette de 1 ml de cellules (25.000 cellules) sur le dessus de chaque réseau de micro-message préparé. Fermer plaque multi-puits et le transférer dans un incubateur (5% de CO 2, 37 ° C). Laissez les cellules adhèrent et se développent au-dessus de microposts pour 6 -7 h. </li><li> Inspectez le processus d&#39;adhésion à l&#39;occasion en utilisant une lumière d&#39;un microscope. Vérifiez que la plupart des cellules apparaissent propagés sur plusieurs microposts. </li></ol> 2. Fixation et coloration des cellules Remarque: Toutes les étapes etvolumes donnés ici sont pour un seul puits d&#39;une plaque de 12 puits. Il est recommandé de traiter pas plus de quatre des douze puits à la fois pour éviter un assèchement des puits après l&#39;aspiration de tout liquide, qui se traduira par un effondrement des micro-messages. <ol><li> Aspirer le milieu du puits et laver les cellules 2 fois avec 1 ml de PBS-tampon. Assurez-vous d&#39;appliquer une force douce tout en lavant avec du PBS pour éliminer les débris cellulaires qui se sont accumulés sur le réseau de micro-message pendant l&#39;incubation et de détacher les cellules mortes. </li><li> Fixer les cellules avec une solution de formaldehyde tamponnée 0,5 ml de 3,7% pendant 5 min. </li><li> Remplacer la solution de formaldéhyde en lavant les micro-message matrice 2x avec 1 ml d&#39;eau désionisée stérile. </li><li> Colorer les cellules avec 0,05% (colorant bleu brillant de Coomassie à 50% d&#39;eau, 40% d&#39;éthanol et d&#39;acide acétique à 10%) pendant environ 90 sec. Laver la solution de coloration excès hors 2x avec 1 ml d&#39;eau DI stérile. Ajouter 1 ml d&#39;eau DI à Micropost tableau. </li><li> Vérifier le résultat de la coloration à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Répétez til l&#39;étape de coloration, si le corps cellulaire est trop faible pour être visualisées. </li><li> Tableaux de Micropost de magasin avec les cellules colorées sur le dessus dans un réfrigérateur à 4 ° C. Assurez-vous de les garder sous l&#39;eau en tout temps. </li></ol> 3. imagerie cellulaire Nota: L&#39;étape 4 applique uniquement aux microscopes sans corrigé à l&#39;infini optique. <ol><li> Ajouter 2 ml de l&#39;eau déminéralisée à une boîte de Pétri avec un fond de verre mince pour l&#39;imagerie haute résolution. </li><li> Transfert tableau micropost utilisant une paire de pince à épiler dans le plat d&#39;imagerie avec les micro-messages vers le haut. </li><li> Placez l&#39;imagerie boîte de Petri sur une scène mobile d&#39;un microscope optique. </li><li> Tournez la bague de compensation de la lentille utilisée pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à ce que le chiffre de l&#39;échelle représente l&#39;épaisseur totale de tous les matériaux le long du trajet optique afin de compenser la non-concordance des indices de réfraction du substrat de verre, l&#39;élastomère de silicone et le liquide sur le dessus. Cela devrait conduire à un aspect brillant des micropostsnoyaux. </li><li> Fermer le diaphragme sur le côté d&#39;éclairage jusqu&#39;à 50% et retirez les anneaux de contraste de phase du trajet optique permettant un mode champ lumineux ordinaire. </li><li> Aligner le réseau de micro-message que les microposts forment une ligne horizontale à travers le champ d&#39;observation. Définir un point de départ (par exemple, en haut à gauche) et déplacer le plat Petri par étapes à travers la scène balayage de la matrice de micro-message tout en prenant de nombreuses images. </li><li> Prenez toutes les images avec le réglage de la résolution la plus élevée pour l&#39;appareil photo en utilisant un objectif 20X ou 40X. But d&#39;avoir une seule cellule dans le centre de l&#39;image. </li><li> Balayer le long de l&#39;axe z à travers le substrat jusqu&#39;à ce que les conseils de Micropost sont en discussion. Utilisez la molette de réglage de mise au point fine du microscope et tournez vers concentrant sur le fond de micropost pendant environ 2-3 um. </li><li> Établir une procédure d&#39;imagerie standard en prenant série d&#39;images d&#39;essai d&#39;une section de tableau balayant les imagerie paramètres un à la fois (par exemple, le temps d&#39;exposition,réglage de l&#39;iris, les paramètres de la lampe, etc.). Analyser les images avec MechProfiler et de déterminer un ensemble de paramètres appropriés pour une analyse rapide et fiable. </li></ol> 4. Analyse d&#39;image avec l&#39;Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Remarque: Toutes les fonctions du logiciel peuvent être activés avec un dispositif de pointage en utilisant le bouton gauche de la souris. Toutefois, un opérateur formé va utiliser les touches de raccourci documentés conçus pour être sur la moitié gauche du clavier pour permettre un traitement d&#39;image à deux mains efficace. <ol><li> Commencez analyse d&#39;image MechProfiler logiciel et ouvrir une série d&#39;images qui doivent être analysés en cliquant sur «Ouvrir». </li><li> Insérez tous les paramètres dans la section &quot;Paramètres&quot; donnée par le développeur du logiciel. Déterminer les paramètres qui doivent être configurés sur mesure (par exemple, le seuil de contour et la distance minimale) selon les modes opératoires décrits en détail dans le manuel du logiciel. </li><li> Analyser l&#39;images un par un en les recadrage pour la zone d&#39;intérêt en utilisant &quot;cultures&quot; (cliquez et glissez avec le bouton de la souris enfoncé). Double-cliquez à l&#39;intérieur du rectangle dessiné pour terminer cette action. </li><li> Marquage chaque contour de la cellule visible un par un en cliquant sur &quot;Dessiner les contours de cellules&quot; et utilisez le curseur en forme de croix pour le dessin y compris tous les microposts la cellule est attaché. </li><li> Jeter toutes microposts indésirables en cliquant sur &quot;Supprimer les messages&quot; et utilisez le curseur en forme de croix pour le dessin. Joindre les micro-messages qui appartiennent à une cellule à l&#39;extérieur de la section d&#39;image qui sont déviées ou pour toute autre raison, mais pas par la cellule d&#39;intérêt. </li><li> Démarrez le sous-programme de logiciel &quot;Trouver Centroïdes&quot; par clic de souris. Ajustez le réglage juste à côté du bouton &quot;Trouver Centroïdes&quot; jusqu&#39;à ce que tous les micro-messages sont enregistrés, ce qui est visible par une croix rouge dans leur centre filtre. Si le réglage du filtre est trop faible microposts seront ignorés, si elle est trop élevée multiple positions seront marqués pour un seul micropost. Gardez réglage constant au cours d&#39;une séance d&#39;analyse du filtre. </li><li> Utilisez la fonction manuelle d&#39;édition &quot;Edit Manuel» pour centroïdes avec multiples ou manqués positions de Micropost. Utilisez les cheveux de croix de la souris pour sélectionner le micropost en question en cliquant et en faisant glisser partout. Double-cliquez dans le rectangle et placez le marqueur rouge manquant dans la section image agrandie, qui se ferme automatiquement. Jeter un tel micropost si elle est à l&#39;extérieur du contour des cellules dessinée (voir l&#39;étape 4.5) avant de continuer. </li><li> Trouver la grille de micropost idéal en activant la fonction &quot;Générer Grille&quot; avec un clic de souris. Vérifiez que la position correspond à la vraie tête de micropost, indiqué par un anneau bleu, l&#39;intérieur du contour de la cellule dessinée. </li><li> Corrigez tout fabricant de grille déplacée à l&#39;intérieur de la zone de la cellule si nécessaire en utilisant la fonction correspondante &quot;Manuel Edition&quot; avec un clic de souris. Utilisez la croix pour sélectionner le micropost dans question en cliquant et en faisant glisser partout. Double-cliquez dans le rectangle apparaissant et placez le marqueur bleu manquant dans la section image agrandie, qui se ferme automatiquement. </li><li> Utilisez le bouton &quot;calculer&quot; Déviations par clic de souris pour obtenir un histogramme des valeurs de déviation calculé sur la différence entre la position d&#39;un micro-message à l&#39;intérieur de la section de l&#39;image et la grille idéal engendré. </li><li> Enregistrer l&#39;analyse complète, y compris les tableaux de valeurs par un clic de souris sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Poursuivre l&#39;analyse d&#39;image soit en cliquant sur &quot;Reset View&quot; et d&#39;analyser une autre section de l&#39;image ou de la souris, cliquez sur &quot;Image suivante&quot;, qui peut facilement être fait en utilisant la touche de curseur droite du clavier. </li></ol> 5. Analyse des données - Mechanoprofiling <ol><li> Ouvrez le fichier &quot;results.xls&quot; avec un tableur de bureau à partir du dossier avec les images analysées. Il contient les données avec all valeurs calculées, y compris toutes les déviations de Micropost et mesures dérivés standards tels que le travail (par exemple, l&#39;énergie de déformation du substrat) par la cellule analysé. </li></ol>

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The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Ce travail vise à faire progresser le domaine de la force de traction microscopie en abaissant considérablement les obstacles techniques et pratiques à l&#39;entrée. Ces obstacles proviennent de deux côtés. Tout d&#39;abord sont les nombreux défis techniques non négligeables qui doivent être surmontés pour la fabrication reproductible et mettre en service un réseau de micropost expérimentalement. Deuxièmement, la nécessité est de même non négligeable pour une analyse semi-automatique fiable des forces d...

Tests cellulaires mécano-sensibles permettent d&#39;enquêter sur les cellules adhérentes, avec une large gamme d&#39;applications qui reflètent le rôle central que peuvent jouer la mécanique en biologie cellulaire. Ces applications se concentrent souvent sur les mécanismes sous-jacents qui animent les processus intracellulaires ou le comportement de cellules entières. D&#39;une part, les facteurs externes environnementaux tels que la composition de la matrice extra-cellulaire ou la rigidité de la matrice peuvent considérablement influer sur la réponse mécanique et biologique d&#39;une cellule. 1 La même chose peut être observée après utilisation de plusieurs classes de composés pharmaceutiques actifs, dont les effets sont caractérisé souvent en utilisant des modèles de culture de cellules. 2 Dans les autres propriétés génotypiques à main, tels que ceux causés par des mutations génétiques spontanées ou induites expérimentalement, peut induire des changements marqués dans le phénotype des cellules qui sont associées à des altérations de la structure et la fonction du cytosquelette. 3 Ces exemples sont quelques-uns des nombreux possiblesujets pour lesquels phénotypage mécanique des cellules est pertinente, et tous ceux-ci ont été utilement étudiée avec des tableaux de Micropost. Au moment d&#39;écrire ces lignes, environ 200 articles ont été publiés décrivant l&#39;interaction cellule-micropost. Ces œuvres de discuter des aspects théoriques de Micropost principes de déviation ainsi que des instructions pratiques sur leur fabrication. Le premier article décrivant l&#39;interaction des cellules et des tableaux de Micropost flexibles a été publié par Tan et ses collègues en 2003. 4 Contrairement à la microscopie à force de traction classique (TFM) où substrats souples continues sont utilisées pour estimer la contractilité cellulaire nanonewton échelle, Tan et al. décrit une méthode utilisant des faisceaux multiples verticales rapprochées en élastomère silicone. Les principaux avantages de cette technique se dégagent de deux caractéristiques principales. D&#39;abord afin de modifier la rigidité du substrat cellulaire apparente il suffit de modifier les dimensions de Micropost tout en gardantla composition du substrat par ailleurs constante et en évitant ainsi les différences de topologie de surface et la chimie. Deuxième microposts agissent comme des ressorts individuels qui peuvent être analysés discrètement avec force et résolution spatiale de l&#39;ordre des adhésions focales individuels et peut réduire les défis analytiques qui sont inhérents à l&#39;analyse analogue par la norme TFM. Aujourd&#39;hui, la gamme d&#39;applications pour les réseaux de Micropost dépasse grandement simplement la cartographie des forces pendant quelques cellules individuelles. Par exemple, Akiyama rapporte l&#39;utilisation d&#39;un tissu de vaisseau dorsal isolé à partir d&#39;une chenille de papillon comme un actionneur destiné à un réseau de micro-message, afin de développer un robot autonome micro-propulsion musculaire insecte. 5 Cependant, la plupart des applications publiées de microposts ont mis l&#39;accent sur les études de conditions médicales telles que l&#39;infection ou un cancer. Par exemple, les tableaux de Micropost ont été utilisés pour étudier la production d&#39;groupé pili de type IV de Neisseria gonorrh de forceoea colonies qui est associé à l&#39;amélioration de cascades de signaux infection. 6 D&#39;autres ont utilisé microposts pour étudier les cellules de cancer du sein traitées avec des composés pharmaceutiques ciblant le cytosquelette. 7 Déviation d&#39;un micro-message est souvent décrit en utilisant la théorie de faisceau classique pour une console avec une charge d&#39;extrémité en supposant que la cellule attache seulement à la pointe de la micropost. Ici, la force F appliquée qui provoque une déviation δ dépend de &quot;rigidité de flexion&quot; S k et le micro-message est calculée par: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) avec E, I et L étant le module de Young, le moment d&#39;inertie de la zone et de la poutre longueur respectivement. Cependant, les résultats de cette équation ne donnent qu&#39;une approximation générale des forces à l&#39;œuvre depuis le cisaillement de la poutre et de flexion ainsi que la déformation du substrat ne sont pas prises en courant alternatifcompter. Considérant que microposts sont généralement fabriqués à partir de matériaux souples comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) à base de caoutchouc de silicone de ces facteurs doivent être inclus. . Schoen et al a montré qu&#39;il existe un tel facteur de correction en se basant sur ​​le rapport d&#39;aspect du micro-message (L / D) et du polymère correspondant coefficient de Poisson v 8 Il est donné par.: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Avec T Tilt (v) étant un coefficient de basculement qui comprend un raccord paramètre = 1.3 que l&#39;on peut trouver dans le même article: <img alt="Équation 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Cela signifie que la rigidité d&#39;un micropost corrigée k corr est le produit de la rigidité à la flexion pur k = k virage et le facteur de correction corrdonné par: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Par conséquent, les calculs de la force de cellules devraient être effectuées en utilisant la variation plus raffinée de l&#39;équation (1) en train de lire: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) L&#39;impact de la correction devient plus évident dès que les valeurs typiques pour les dimensions de Micropost sont utilisés. Par exemple, une longue micro-message 15 microns avec une section transversale circulaire et un diamètre de 5 um en caoutchouc de silicone à base de PDMS conduit à un facteur de correction de 0,77 et donc un calcul non corrigé serait surestimer les forces de cellules exercée par 23%. Cela devient encore plus sévère pour les micro-messages avec des rapports d&#39;aspect plus petits. Traditionnellement, micropost analyse d&#39;image a également été basée sur la théorie de flexion du faisceau idéalisée. En 2005, le groupe qui a lancé l&#39;utilisation de MICRtableaux de opost publié un logiciel d&#39;analyse d&#39;image adaptée à l&#39;analyse de micropost 9 Le logiciel requiert une licence de logiciel et l&#39;utilisateur doit prendre trois images pour chaque position. une chacune de plans supérieur et inférieur de la micro-message en mode de transmission et une autre en mode de fluorescence avec la cellule colorée. Après avoir comparé les positions supérieure et inférieure pour chaque Micropost le logiciel détermine un champ force de vecteur et calcule les paramètres connexes comme force par poste. Les autres logiciels existent et leurs principes de l&#39;analyse sont brièvement mentionnés dans les articles correspondants qui les décrivent, mais ces progiciels d&#39;analyse sont généralement pas accessibles au public. 10,11 Les tableaux de Micropost conçus pour les forces de cellules de cartographie peuvent être classés comme étant dans une mise en micropost orthogonale ou un être hexagonale, dont le dernier qui ont l&#39;avantage de lacunes équidistants entre tous microposts voisins. Microposts typiques have une section transversale circulaire et vont de 1,0 um à 10 um de diamètre et de 2 à 50 mm de longueur. 4 leurs dimensions Cependant, microposts avec section elliptique ou carrée ont également été signalés. 12,13 L&#39;utilisation de mélanges de silicones à base de PDMS comme matière de micro-message pour l&#39;ajout de nanoparticules permet dans le mélange. Par exemple en ajoutant cobalt nano-barres permet une activation magnétique de la micropost et donne ainsi un autre degré de liberté de modèles expérimentaux potentiels. 14 La plupart des groupes produisent leurs réseaux de Micropost sur ​​des substrats rigides plats comme le verre de couverture ou à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri. Cependant, Mann et ses collègues ont récemment rapporté une matrice de micro-message formé sur une membrane extensible. 15 Cela permet à l&#39;application de l&#39;étirement cellulaires forces de cellules adhérentes tout en étudiant cellules vivantes subcellulaire réponses dynamiques en termes de la contractilité cellulaire. L&#39;éta et le plus largement utiliséblies processus pour la fabrication de tableaux de Micropost est basé sur la lithographie douce comme décrit dans les protocoles perspicaces de Sniadecki et collègues. 16-18 Dans courtes processus de salle blanche standard sont utilisés pour générer les microstructures sur le dessus d&#39;une plaquette de silicium en utilisant résine photosensible SU8. Ceci est suivi par un processus de copie, dans lequel le caoutchouc silicone est moulée sur les structures les transférer dans les moules. Dans une deuxième étape ces moules sont utilisés pour reproduire la microstructure initiale en utilisant un caoutchouc de silicone sur le dessus d&#39;un substrat choisi. Cependant, malgré le nombre important et croissant de publications liées à leur application, en établissant un processus de fabrication pour microposts prend beaucoup de temps, même pour des experts micro-ingénierie; il existe de nombreuses étapes de traitement qui nécessitent une optimisation et l&#39;adaptation à l&#39;environnement de laboratoire micro-message spécifique et la mise en page pour obtenir un niveau de qualité acceptable. Tableaux de Micropost commerciales sont maintenant disponibles dans un prête-to-utilisation (&quot;off-the-shelf») format avec un qualité constante. Comme tels, ils sont une alternative à la longue et complexe processus de fabrication nécessaires à la production sur place. Dans cet article, un tableau de micropost disponible dans le commerce a été utilisé pour cartographier les forces cellulaires en utilisant une seule image à champ lumineux microscopie. Plus important encore cet article décrit et documente un logiciel open-source entièrement fonctionnelle nommé MechProfiler, qui est disponible en téléchargement en tant que matière supplémentaire à ce manuscrit. Une version maintenue activement du logiciel peut également être trouvé à http://www.orthobiomech.ethz.ch. La combinaison d&#39;un essai &quot;off-the-shelf» et un logiciel d&#39;analyse compatible open-source abaisse nettement l&#39;entrée obstacle pour atteindre expériences précises TFM. Chercheurs sans accès ni salles blanches ou des logiciels expertise en développement peuvent analyser les forces cellulaires succès. Il permet à un utilisateur de se concentrer sur les mechanossortie de dosage de ensitivity plutôt que la technologie elle-même, et qui rend la mesure de la force de traction disponible à une communauté plus large. En outre, cela est une étape importante pour ouvrir la voie vers le dépistage entièrement automatique de tableaux de Micropost. Le logiciel d&#39;analyse MechProfiler traite les images en format de fichier tiff, png, bmp et jpg. Les images peuvent être prises en utilisant la fluorescence, contraste de phase ou de la microscopie optique à champ lumineux. Le programme autonome fonctionne conjointement avec la libre MATLAB Compiler Runtime (disponible à l&#39;adresse: Figure 12) et algorithmes sous-jacents de permettre le traitement d&#39;image simplifiée, qui permet à l&#39;utilisateur de traiter des images avec des cellules uniques ou multiples dans environ 1 min. En outre, ces cellules peuvent être soit vivant ou «fixes». Le logiciel MechProfiler est capable d&#39;augmenter grandement l&#39;analyse de données débit en se fondant sur la reproductibilité de réseaux de Micropost commerciale de qualité, plus spécifiquement, la valeur par défaut &amp; #8220; non dévié &quot;position de chaque poste dans le tableau peut être présumé contre une grille idéale (les écarts de fabrication de la grille dans les tableaux utilisés pour cette étude étaient inférieures à 100 nm). En bref on ouvre une sélection de fichiers d&#39;image pour l&#39;analyse, les cultures de la région d&#39;intérêt, définit les postes couverts par des cellules ou qui doivent être mis au rebut, détermine les positions de départ, calcule les déviations / forces contre la grille idéale, et enfin enregistre toutes les données spécifiques des cellules avec une possibilité pour l&#39;exportation, y compris à une feuille de calcul de bureau standard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Le principal avantage de la technique décrite réside dans sa simplicité et le potentiel pour une intégration rapide et efficace dans le travail de laboratoire de routine. La combinaison des réseaux de capteurs commerciaux de haute qualité jumelés avec des logiciels open-source fournit des informations sur la mécano-sensibilité qui autrement nécessite l&#39;accès à des installations de salles blanches et d&#39;une connaissance approfondie de l&#39;analyse de l&#39;image et le développement de logiciels. <str...

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K vues.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Etudier Trajectoires Cellule roulant sur les Patterns récepteur asymétrique

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Recherche

Bio-ingénierie

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l&#39;aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Tableaux Scellable femtolitre Chambre pour la biologie acellulaire

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Interfaçage Microfluidics microélectrode tableaux pour étudier la Communication neuronale et la Propagation des signaux axonale

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

Réseaux de cardiomyocytes dérivés de l'iPSC sur des réseaux de micro-électrodes multipuits pour des enregistrements potentiels d'action récurrents

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

Fabrication de Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays pour In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...