BS a été soutenue par l&#39;Université du programme de formation et de recherche d&#39;été pour étudiants Milan-Bicocca; recherche a été financée par des fonds du ministère italien de la Santé et le ministère italien de l&#39;Education, de l&#39;Université et de la Recherche et la Fondazione Humanitas à GC, nous remercions Michael VG Latronico pour la lecture critique de la manuscrit.

1. Entretien chargeur et sans repiquage des iPS humaines lignées cellulaires <ol><li> Préparer les plats Matrigel revêtus. Décongeler une fiole de Matrix ESC qualifié humaine sur la glace pendant une heure et diluer dans 25 ml de milieu DMEM-F12. Ajouter 1 ml de chaque plaque de 35 mm (ou des quantités équivalentes par unité de surface si d&#39;autres plats sont utilisés), tout garder sur la glace et faire en sorte que toutes les plaques et tubes sont pré-refroidi. Couvrir les plaques avec du papier d&#39;aluminium. </li></ol> Note: actions concentrations de Matrigel varient selon le lot. instructions de dilution sont indiqués sur la feuille de données. <ol start="2"><li> Conserver les plaques sur de la glace pendant la nuit et de retirer de la glace le lendemain. Les plaques peuvent être conservés au réfrigérateur jusqu&#39;à une semaine avant de l&#39;utiliser. </li><li> Préparer le milieu complet mTESR1 (ou décongeler un flacon de milieu Nutristem) et le H-ESM (Moyen CSE humaines), selon le tableau ci-dessous. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> Concentration finale </td><td> Pour 500 ml </td></tr><tr><td> Knockout remplacement Serum (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> MEM acides aminés non essentiels </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> 100 U / ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 pi </td></tr><tr><td> B27 supplément - sans VitaminA </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Supplément N2 </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> moyen d&#39;actions peut être conservé à 4 ° C pendant plus de 2 semaines. Pour préparer un milieu de croissance complet, le FGF basique est ajouté juste before alimentation à une concentration finale de 20 ng / ml. </li></ol> Note: Complete H-ESM conditionnés sur des fibroblastes embryonnaires de souris peut être utilisée à la place de mTESR1 ou Nutristem pour les cellules iPS. <ol start="4"><li> Placez plaques enduites dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min à 2 h avant repiquage. </li><li> Les cellules doivent être repiquées environ tous les 5 jours, même si elles n&#39;ont pas atteint la confluence. Colonies ne doivent pas se toucher. </li><li> Remplacez le milieu de croissance avec 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissoudre à partir d&#39;un mg / ml de bouillon dans 10 PBS). </li><li> Retirer différencier les zones où tiré Pipettes Pasteur en verre. Domaines qui devraient être supprimés incluent des structures en forme de cratères ou kystique dans le centre de colonies, et les zones où les cellules ont été séparés de colonies et aplaties et semblent être la migration vers l&#39;extérieur. </li><li> Incuber à 37 ° C sous une hotte de culture jusqu&#39;à ce que les frontières de la colonie deviennent plus lumineux et commencent à se détacher (généralement autour de 5-7 min). Discard dispase. Laver avec 1 ml H-ESM et le jeter. </li><li> Dans 1 ml de H-ESM, utilisez un levier de cellule (en forme de spatule grattoir) aux colonies de récolte et de rassembler dans un tube Eppendorf 15 ml. Rincer avec 1 ml H-ESM et d&#39;ajouter au tube. Tourner à 1.000 rcf pendant 4 min et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre le culot dans 1 milieu de croissance préchauffé ml (soit mTESR1 ou Nutristem). Éviter de casser les mottes trop - pipette de haut en baisse de moins de 6-8x. Déterminez le nombre de cellules doit être plaqué et éliminer les cellules inutiles (généralement 01h04 ou 01h05 dilution), par exemple pour 2 plaques à 1:5, supprimer 600 ul, puis ajouter 1,6 ml de milieu frais. </li><li> Retirer Matrigel à partir de plaques. cellules de lieu goutte à goutte, répartissant uniformément sur la plaque. Evitez de secouer le tube trop, car cela va amener les cellules à se déplacer vers le centre. </li><li> Lavez tube avec 1 ml de milieu et fracture entre les plaques. Le volume final dans chaque assiette devrait être de 1,5 -2 ml. </li><li> Changer le milieu tous les jours, sauf le jour après repiquage. Bien qu&#39;il soitidéal pour changer le support de tous les jours, cela peut être parfois modifié à une fréquence d&#39;une fois tous les deux jours si pas plus de 2-3 jours se sont écoulés depuis le dernier passage sans affecter le potentiel pluripotence ou de différenciation. </li><li> Si la ligne de la cellule doit être congelée, remettre en suspension au lieu de 1-2 ml de milieu de congélation mFreSR utilisant une pipette de 2 ml et placer 1 ml / cryovial. Placer les flacons dans un Cryobox à -80 ° C et le transfert de l&#39;azote liquide dans les 3-4 jours. </li></ol> Note: Manuel microdissection de cellules iPS doit être effectuée sous une loupe binoculaire. Une fécondation in vitro (FIV), poste de travail (par exemple, une station de travail à partir de la FIV KSystem) intégré avec un microscope stéréoscopique permet la manipulation des cellules dans des conditions stériles pendant qu&#39;ils sont maintenus sur une surface chauffée. Si ce n&#39;est pas disponible, une loupe binoculaire peut être déplacé sous une hotte à flux laminaire régulier. 2. Embryoïde organismes Agrégation et cardiaque induction <ol><li> Préparez-20 EBM moyen selon le tableau ci-dessous. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> Concentration finale </td><td> Pour 500 ml </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (origine Amérique du Sud) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> MEM acides aminés non essentiels </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline - streptomycine </td><td> 100U/ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> 50 pM </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Utilisation de FBS d&#39;origine Amérique du Sud est essentiel pour déterminer l&#39;efficacité de différenciation: l&#39;emploi d&#39;autres types de sérums peuvent affecterle processus de différenciation. Pour préparer EBM-20, l&#39;acide ascorbique module complet (AA) à une concentration finale de 50 ng / ml. Un milieu de croissance complet peut être conservé à 4 ° C pendant pas plus d&#39;une semaine. </li><li> iPS colonies de récolte telles que décrites ci-dessus (étapes 1.6 à 1.9). </li><li> Reprendre doucement dans 1 ml EBM-20 avec une pipette de 2 ml. Éviter de casser les mottes trop - pipette de haut en bas pas plus de 2 à 3 fois, vérifier la taille des colonies sous la loupe binoculaire. Plaque sur des plaques ultra-faible attachement au rapport 1:1 (par exemple pour un plat de 35 mm, utiliser 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits). Rincer le tube avec 1 ml EBM-20 et ajouter à la plaque. </li></ol> Note: La taille des colonies affectent le processus de différenciation, de contrôler l&#39;efficacité et le moment de l&#39;induction cardiaque. Agrégation de façon homogène taille EB ont été montré pour réduire la variabilité observée au cours de la différenciation. <ol start="4"><li> Au jour 3, changer EBM-20 une fois en utilisant un microscope à éviter à nouveauDépose d&#39;EBS. Gardez la pipette contre bord de la plaque, et éliminer le milieu. </li><li> Au jour 7, le commutateur à EB plaques revêtues de 0,1% de gélatine et placé précédemment à 37 ° C pendant 30 min. Si nécessaire, la gélatine peut être retirée et des plaques laissé sous hotte de culture cellulaire S / N. Ajouter 35-40 EB par boîte de 35 mm. </li><li> Vérifiez EB pour battre les zones et les changements EBM-20 deux fois par semaine. Marquez où zones battantes sont situés sur le dessus du couvercle du plat, afin de faciliter leur localisation sous la loupe binoculaire. Zones contractantes devraient apparaître après environ 10-20 jours. </li><li> Lorsque les zones où la contraction spontanée apparaissent, passez à moyen et EBM-2 (préparer comme EBM-20, avec 2% de FBS place) et les isoler comme décrit ci-dessous dans la section 3. </li><li> Continuez à vérifier d&#39;autres domaines pour battre et changer moyenne deux fois par semaine jusqu&#39;à zones battantes sont nécessaires pour d&#39;autres expériences. </li></ol> Note: l&#39;efficacité du processus de différenciation est très dépendanteplusieurs facteurs, le plus important dont les lignées cellulaires spécifiques et le lot de sérum utilisé pour induire la différenciation cardiaque. Pour obtenir le rendement le plus élevé, des lignées de cellules de test pour le potentiel cardiomyogénique et divers lots de sérum. 3. Battre les zones d&#39;isolement et de la culture <ol><li> Plaques à 12 puits manteau (4 cm zone 2) ou les plaques d&#39;intérêt avec 5 ug / cm 2 fibronectine, dilués dans du PBS pour faire un volume suffisant pour couvrir toute la surface complètement (300 totale par puits dans des plaques à 12 puits). Gardez découvert dans la hotte de culture cellulaire et laisser sécher. Les plaques peuvent être conditionnés et conservés à 4 ° CO / N. </li><li> Retirez zone à l&#39;aide d&#39;un verre battre tiré pipette Pasteur et scalpel, selon les besoins. Transfert à plaques revêtues de fibronectine avec une pipette de 1 ml. </li><li> Ajouter 1 ml EBM-2. </li><li> Rayez la plaque pour indiquer les zones où les cellules ont été enlevés et changer le milieu. Les plaques peuvent être conservés jusqu&#39;à 1 mois, comme d&#39;autres secteurs peuvent commencer bmanger plus tard. </li></ol> Remarque: Si les petites touffes battant sont nécessaires, une pipette la zone explanté monter et descendre plusieurs fois sous la loupe binoculaire, jusqu&#39;à ce qu&#39;il casse en petits morceaux. Cela se traduira par des groupes de quelques cellules de battage (voir film 3). <ol start="5"><li> Changer le milieu deux fois par semaine avant d&#39;être prêt pour les analyses. </li></ol> Note: cardiomyocytes obtenus à partir de ce protocole possèdent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles du fœtus ressemblant; maturation vers un phénotype adulte comme peut être obtenu en augmentant le temps de la culture afin de mieux différencier ces cellules. 4. Simple Battre cellules d&#39;isolement et de l&#39;analyse <ol><li> Manteau de diapositives 2 chambre (4 cm zone 2) ou autres supports appropriés avec 5 ug / cm 2 fibronectine dilué dans PBS suffisante pour couvrir la surface de culture entier. Si un support de verre est utilisé, manteau avec la laminine et la fibronectine (5 ug / cm &lt;sup&gt; 2 chacun). </li><li> Retirez zone battre avec une pipette Pasteur / scalpel à partir des plaques de la section 3. </li><li> En utilisant une pipette de 1 ml, transférer les cellules sur un tube de 15 ml contenant 500 ul collagénase II (480 U / ml dans PBS avec Mg et Ca) et incuber 15 min à 37 ° C, en agitant le tube une fois au cours de l&#39;incubation. </li><li> Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette 200 pl. Si les grumeaux restent, transfert à frais collagénase II et répétez l&#39;étape 4.3. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.4 jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun de grosses touffes sont laissés. </li><li> Inactiver collagénase avec 3 ml EBM-2 (sans AA). Le tube peut alors être laissée sous le capot dans un rack chauffée jusqu&#39;à ce que d&#39;autres tubes sont prêts. Centrifugeuse à 1000 rcf pendant 4 min. </li><li> Remettre le culot dans 1 ml de trypsine à 0,25% / EDTA (dilué à partir d&#39;un stock de 0,5% dans du PBS 1X) et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Combiner les fractions de digestions du même échantillon initial. </li><li> Inactiver la trypsine avec 4 ml EBM-2 (sans AA). Passez cellules à travers une aiguille 18G sur une seringue de 2,5 pas plus than 7x. Centrifugeuse à 1000 rcf pendant 4 min. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml EBM-2 par puits et la plaque. Les cellules peuvent être utilisées pour des analyses morphologiques et fonctionnelles 2-3 jours après placage. </li></ol>

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	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. 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Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

Aucun intérêt financier à divulguer.

Les cellules souches pluripotentes ont le potentiel de se différencier spontanément en GC, mais avec une faible efficacité et une forte variabilité entre les lignes. Le développement de nouvelles méthodes d&#39;induction a donc mis l&#39;accent sur l&#39;amélioration de l&#39;efficacité du processus et se déplaçant vers des protocoles plus définis. Cependant, la plupart de ces nouvelles méthodes de différenciation sont assez complexes, nécessitant des conditions complexes de la culture, le contrôle préci...

Historiquement, l&#39;étude des mécanismes génétiques et moléculaires de conduire le développement humain et la maladie a été basée sur la production de modèles de recherche génétiquement modifiés. Cependant, de nombreux phénotypes humains ne parviennent pas à être reproduit avec succès chez la souris, principalement en raison des différences biologiques existant entre les deux espèces. D&#39;autre part, l&#39;accès aux tissus humains peuvent être limitées et souvent ne permettent pas suffisamment de matière pour être obtenue pour des études expérimentales en profondeur. Le domaine de la biologie cardiovasculaire souffre de ces deux limites: la physiologie du cœur de l&#39;homme est nettement différente de celle de la souris, et une quantité importante de tissu cardiaque est uniquement accessible post-mortem ou pendant la chirurgie cardiaque. Trouver une source optimale pour la différenciation fonctionnelle de CMS Human est donc devenue un sujet central en biologie cardiovasculaire, et beaucoup d&#39;efforts ont été faits pour résoudre ce problème. Différents types de cellules ont été proposées, including myoblastes squelettiques, cellules cardiaques locaux souches de moelle osseuse, des cellules mononucléaires, des progéniteurs endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. Toutefois, les données obtenues en utilisant ces cellules n&#39;ont pas été conforme 4. La dérivation de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) 5 et la découverte révolutionnaire de cellules induites souches pluripotentes (iPS) par Yamanaka et Thomson 6,7 semblé première tard pour apporter des solutions: ces cellules ont la capacité de croître indéfiniment et le potentiel de donner augmenter à tous les dérivés de cellules des trois feuillets embryonnaires, dont les GC. L&#39;utilisation de cellules iPS offre d&#39;autres avantages: être dérivées de cellules autologues adultes, ils portent le même génome que l&#39;individu ou le patient dont ils sont issus. Ils permettent donc le développement de modèles in vitro qui facilitent la recherche sur les maladies et les mécanismes de développement génétiques humaines. En vertu de cette caractéristique, les cellules iPS peuvent également overcome problèmes liés au rejet immunitaire et les questions éthiques 8. Pour ces raisons, même si les CES représentent toujours l&#39;étalon-or dans le domaine de la biologie des cellules souches, les chercheurs du monde entier sont en train de passer plus vers la technologie des cellules iPS. Les cellules iPS sont maintenant utilisés pour modéliser les maladies humaines in vitro pour diverses conditions, y compris les troubles cardio-vasculaires congénitales 9,10. Récemment, l&#39;application de la modélisation des maladies des cellules iPS a été effectuée pour des troubles cardiaques monogéniques (par exemple syndrome du QT long, catecholaminergic tachycardie ventriculaire polymorphe) et les pathologies dans lesquelles les malformations cardiaques font partie d&#39;un phénotype complexe (ie Leopard et Timothy syndromes, cardiomyopathie dilatée). Ces rapports ont confirmé que les cellules iPS spécifiques au patient qui se différencient en GC présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles similaires à celles de la maladie in vivo. Cependant, ilya encore de nombreux défis pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;induction des cellules iPS dans la lignée cardiaque. La génération spontanée de la CMS à partir de CSE humaines par la formation d&#39;agrégats appelé corps embryoïdes (EBS) ont fait leurs preuves 17. Depuis cette découverte, de nombreuses autres méthodes ont été proposées. De nombreux groupes ont grandement amélioré l&#39;efficacité du protocole de différenciation et se sont déplacés vers les réactifs de culture chimiquement définis et animale produits frais (voir Mummery, C., et al., De la recherche de Circulation (2012) pour un examen complet de toutes les méthodes 3 existants ). Néanmoins, la méthode classique basée sur EB agrégation représente toujours le plus couramment utilisé pour réaliser des études fonctionnelles et d&#39;enquêter sur les mécanismes de la maladie. Notre protocole proposé est fondé sur l&#39;agrégation des cellules iPS dans EBS et de la culture en présence d&#39;acide ascorbique et de sérum, qui a été montré pour améliorer le processus de différenciation cardiaque et de poincidence sitively la maturation de ces cellules 18,19. Dans cet article, nous allons passer par cette méthode en détail et nous allons montrer comment utiliser des lignées de cellules iPS chargeur sans pour générer spécifique au patient CM iPS dérivées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

Afin d&#39;enquêter sur les événements de conduite développement du cœur et de déterminer les mécanismes moléculaires conduisant à des maladies du myocarde chez l&#39;homme, il est essentiel d&#39;abord de générer des cardiomyocytes humains fonctionnels (CMS). L&#39;utilisation de ces cellules dans la découverte de médicaments et les études de toxicologie serait également très bénéfique, en permettant de nouvelles molécules pharmacologiques pour le traitement des troubles cardiaques être validées au stade clinique sur les cellules d&#39;origine humaine. Parmi les sources possibles de la CMS, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont parmi les plus prometteurs, car ils peuvent être directement dérivées de tissus du patient facilement accessibles et possèdent une capacité intrinsèque pour donner naissance à tous les types cellulaires de l&#39;organisme 1. Plusieurs méthodes ont été proposées pour la différenciation des cellules iPS en GC, allant des classiques des corps embryoïdes (EBS) approche agrégation des protocoles définis chimiquement 2,3. Dans cet article, nous proposons un protocole EBS-base et montrons comment cette méthoD peut être utilisé pour générer efficacement des cellules CM-comme fonctionnels à partir de cellules iPS sans chargeur.

Dans nos études, nous avons généré CM de plusieurs lignées de cellules iPS. Ces lignes ont d&#39;abord été générées sur une couche nourricière MEF mais ont été immédiatement placés sur Matrigel utilisant un milieu défini (soit mTESR1 ou Nutristem). Différents tests ont permis de vérifier l&#39;entretien des propriétés morphologiques, l&#39;expression de marqueurs typiques des cellules pluripotentes (Oct-4, SSEA4 et TRA1-60) et leur stabilité du génome (Figure 1). <p class="jove...

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Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l&#39;induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K vues.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Vidéo: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Recherche

Biologie

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.

Production et maintien de cellules souches pluripotentes induites par les primates dérivées de l’urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Caractérisation des antigènes de surface et de la capacité de prolifération dans les CSM pilotant les hiPSC

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la recherche sur les iPSC et les maladies génétiques 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...