Un merci spécial à M. Boris Greber pour la mise en place de la activine Un protocole ELISA tel que publié dans Greber et al. 2007. Nous sommes particulièrement reconnaissants à Mme Monica Shevack pour la préparation de l&#39;aperçu graphique. Nous sommes très reconnaissants au Dr Fuchs Heiko pour toute l&#39;aide et des suggestions utiles avant et pendant le tournage. Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Adjaye, en particulier Elisabeth Socha pour maintenir un approvisionnement constant de les FAE et CM. Nous reconnaissons également nos collègues de l&#39;animalerie de l&#39;MPIMG pour leur soutien permanent. Ce travail a été financé en partie par la Société Max Planck et l&#39;[BMBF; numéro de subvention 0315717A], les partenaires de l&#39;initiative soutenue ERASysBio + sous l&#39;UE ERA-NET Plus dans le 7e PC.

1. Isolement des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) Les deux étapes suivantes sont effectuées dans des conditions non aseptiques conditions. <ol><li> Sacrifiez une souris enceinte (CF1, Harlan, USA) à 13 ou 14 dpc (jours post-coïtum) par dislocation cervicale. </li><li> Disséquer les cornes utérines, rincer rapidement à 70% (v / v) d&#39;éthanol et de le placer dans un tube falcon contenant du PBS sans Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> Les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte de culture tissulaire dans des conditions aseptiques et en utilisant des instruments stérilisés. <ol start="3"><li> Placez cornes utérines dans une boîte de Petri et séparer chaque embryon à partir de son placenta et le sac embryonnaire. </li><li> Disséquer la tête et les organes rouges, se laver dans du PBS et placer tous les embryons dans un boîte de Petri propre. Émincer finement le tissu en utilisant une lame de rasoir stérile jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne possible de pipeter. </li><li> Ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine / EDTA (Gibco, Invitrogen), yDing 100 unités Kunitz de DNase I (USB), par l&#39;embryon. </li><li> Transfert le tissu dans un tube Falcon de 50 ml et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Après chaque 5 min d&#39;incubation, les cellules se dissocient par aspiration et refoulement à fond. </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant environ 1 volume de milieu MEF fraîchement préparée. Milieu de culture MEF (composants pour obtenir 500 ml de milieu, mélanger tous les composants et filtres): 450 ml de DMEM, 50 ml de FBS (10% (v / v)), 5 ml de 200 mM de L-glutamine (1/100 (v / v)), 5 ml de pénicilline-streptomycine (1/100 (v / v)). </li><li> Centrifuger les cellules à faible vitesse (300 xg), 5 min, retirer délicatement la cellule surnageant et remettre en suspension dans un milieu à granulés MEF chaud. </li><li> Plaque d&#39;environ un certain nombre de cellules qui est équivalent à 3-4 embryons dans chaque T150 (PPT) flacon recouvertes avec de la gélatine de 0,2% (gélatine de la peau de bovin, de type B, Sigma) pendant 2 heures. Les fibroblastes (P0, le passage 0) sont les seules cellules qui ont la capacité de se fixer des flacons de gélatine enrobés. </li&gt; <li> Idéalement, les cellules sont de 80-90% de confluence après 24 h et à ce stade une partie importante de cellules P0 est gelé pour un usage futur. </li><li> Développer le reste T150 flacon (s) de cellules P0 jusqu&#39;à P3 ou P4, alors inactiver et utiliser que les mangeoires à replate CSEh ou de produire un milieu conditionné (CM). </li></ol> 2. L&#39;inactivation et placage MEF (chargeur cellules Préparation) Toutes les étapes sont réalisées dans un capuchon de culture tissulaire dans des conditions aseptiques. <ol><li> Manteau T150 flacons avec de la gélatine de 0,2% et incuber à température ambiante pendant au moins 2 h. </li><li> Diluer la mitomycine C dans du PBS (1 mg / ml) et le filtre. </li><li> Aspirer les médias de les FAE et laver avec du PBS sans Ca 2 + Mg 2 +. </li><li> Placer 20 ml de milieu contenant 10 ug / ml de mitomycine C sur la MEF. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 37 ° C avec de la mitomycine C contenant un milieu, puis laver deux fois avec du PBS, trypsiniser, centrifugeuse (5 min à 300 xg) et remettre les cellules en milieu chaud. </li><li>Et compter les cellules de plaque à une densité de 56.000 cellules / cm 2 dans des flacons et T150 utiliser pour la production CM pour les 6 jours suivants. </li></ol> 3. Milieu conditionné (CM) Préparation Toutes les étapes sont réalisées dans un capuchon de culture tissulaire dans des conditions aseptiques. <ol><li> Le jour après étalement inactivé MEF à une densité de 56.000 cellules par cm 2 remplacer le milieu MEF avec le milieu de CSEh (UM, milieu non conditionné) (0,5 ml / cm 2) complétée fraîchement avec 4 ng / ml de FGF2. </li><li> Recueillir CM de flacons d&#39;alimentation après 24 h d&#39;incubation et ajouter du milieu frais contenant CSEh 4 ng / ml de FGF2 aux mangeoires. </li><li> Répétez cette procédure pour les 6 prochains jours. Chaque magasin jours recueillies CM à -20 ° C. </li><li> Après 6 jours mélanger tous les aliquotes de milieu et d&#39;un filtre (Corning, 0,22 um, PAS). Faire des aliquots de 50 ml et conserver à -80 ° C. </li><li> Supplément CM avec supplémentaire de 4 ng / ml de FGF2 avant d&#39;ajouter à CSEh cultivées sur Matrigel. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Mesure de l&#39;activine A dans les médias conditionnés (ELISA) 15 <ol><li> Apportez tous les échantillons et les réactifs à température ambiante. </li><li> Diluer anticorps de capture (de l&#39;homme \ Mouse \ Rat activine un anticorps monoclonal, la R &amp; D Systems) dans du PBS avec 1% de BSA, ajouter à microplaque (100 pl / puits) et incuber une nuit à température ambiante. </li><li> Après 24 h laver les puits trois fois avec du PBST (PBS avec 0,05% de Tween 20) (300 pl / puits) puis bloc (1% de BSA / PBS, 300 pl / puits) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> En ce temps préparez un A activine (R &amp; D Systems) courbe standard, y compris 7 dilutions (concentration inférieure à 30 ng / ml) et l&#39;échantillon vierge. La gamme de travail linéaire de l&#39;activine A est compris entre 0,25 et 32 ​​ng / ml. </li><li> Ajouter les doublons des normes et des échantillons dans les puits (100 pl / puits) et incuber pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Laver les puits trois fois (300 pi de PBST). </li><li> Ajouter le secondaire (biotinylé) antibody (Human / souris / rat biotinylé activine A AcM, R &amp; D Systems) (0.25 pg / ml dans 1% de BSA / PBS) et incuber pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Laver les puits trois fois (300 pi de PBST), ajoutez streptavidine-HRP (dilué dans 1% de BSA / PBS, R &amp; D Systems) et incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver les puits trois fois (300 pi de PBST), ajouter 100 ul de solution de substrat (Quantikine, R &amp; D Systems) et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 100 ul de solution d&#39;arrêt (Quantikine, R &amp; D Systems) à chaque puits et mélanger doucement. </li><li> Ensemble Lecteur de microplaques (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc, Minnesota) à 450 nm, avec une correction de longueur d&#39;onde à 540 ou 570 nm, pour déterminer la densité optique de chaque puits. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Le schéma global de la procédure d&#39;isolement est présenté dans la Figure 1. La morphologie typique de CSEh et hiPSCs cultivées dans des conditions différentes est présentée à la Figure 2. La morphologie de la<html> MEF et des cellules nourricières inactivés utilisés pour préparer CM est présenté dans la Figure 3. En général, les cellules doivent être confluentes 24 heures après l&#39;isolement et prêt à être congelé ou élargi. Cependant, il peut parfois prendre 2-3 jours avant l&#39;obtention de cultures confluentes. Le CM doit être préparé à partir de cellules à passage 4 et au plus tard. Ceci est crucial parce que les cellules primaires ne peuvent être étendus pour 4-5 passages avant le début de la sénescence. La cytokine, activine A, est considéré comme le facteur le plus critique sécrétée par les cellules nourricières pour le soutien de la croissance indifférenciée de cellules pluripotentes 14. La mesure du niveau de l&#39;activine A CM (figure 4) est un test très pratique quantitative pour contrôler la qualité de la FAE. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> Figure 1. Une représentation schématique de la procédure d&#39;isolement MEF. ontenu &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> Figure 2. La morphologie typique de CSEh indifférenciées cultivées en présence de cellules nourricières (A), (B) un milieu conditionné et moyennes (C) défini. La morphologie typique de hiPSCs cultivées en présence de cellules nourricières (D, E). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> Figure 3. La morphologie typique de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). (A) Passage 0 (P0), deux jours après placage / isolement, (B) couche nourricière inactivé à une densité de 56.000 cellules / cm. 2 <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> Figure 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) basés sur des mesures de la concentration de l&#39;activine A dans un milieu conditionné (CM) prepared avec des fibroblastes embryonnaires de souris dérivées de la souche de souris CF1. CM ont été recueillies pendant 6 jours, puis regroupés. CM &quot;1&quot; et CM &quot;2&quot; se réfèrent à des lots différents de médias et de messagerie unifiée aux médias conditionnés. Comme la fonction du processus de conditionnement est l&#39;activine A la sécrétion dans le milieu par MEF, activine A est presque indétectable en UM.

<ol>
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Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La procédure d&#39;isolement MEF présentée ici permet la mise en place d&#39;une condition de culture normalisée pour les CSEh et hiPSCs. En outre, le système ELISA basé utilisé pour évaluer la production de cytokines par les cellules nourricières est un indicateur utile de la qualité des médias MEF dérivés climatisées. L&#39;entretien de routine de la souche de souris (CF1) fournissant des fibroblastes de soutien est nécessaire pour éviter de lot à lot variation de milieux de culture. En outre, il est recommandé d&#39;isoler les embryons de souris plusieurs simultanément pour obtenir une qualité constante des cellules. Certes, fraîchement isolés MEF peut être conservé congelé à P0 et P1. En outre inactivé MEF peut être conservé congelé en aliquots de quantités appropriées en fonction des exigences pour la culture cellulaire. Habituellement environ 250.000 cellules devraient être étalées dans un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits à la culture et les CSEh cellules iPS. La méthode établie et peut être optimisé régulièrement utilisé pour minimiser la variabilité entre les diffélouer expériences.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM (glycémie élevée) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Aspirateur filtre de système de </td><td> Corning </td><td> 431097 </td><td> 500 ml, 0,22 um, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> Ser Knockouteuh remplacement </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> bêta-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycine C </td><td> Roche </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> Basic Fibroblast Growth Factor </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé Anti-human/mouse/rat activine A Anticorps </td><td> R &amp; D Systems </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> Homme / souris /Rat activine A AcM </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Supplémentaires minces Ciseaux Iris </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Supplémentaires Forceps Graefe Beaux- </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pince de fixation Pierse </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells

En général, cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) 1 peuvent être cultivées dans des conditions variables. Toutefois, il n&#39;est pas facile d&#39;établir un système efficace de culture de ces cellules. Étant donné que les conditions de culture peuvent influencer l&#39;expression des gènes qui confère pluripotence dans les CSEh et hiPSCs, l&#39;optimisation et la standardisation de la méthode de culture est essentiel. La création de lignées de CSEh a été décrite pour la première en utilisant les FAE comme cellules nourricières et sérum de veau fœtal (FBS) contenant un milieu de culture 2. Ensuite, FBS a été remplacé par le remplacement du sérum KO (KSR) et FGF2, qui augmente la prolifération des CSEh 3. Enfin, les systèmes de culture d&#39;alimentation sans permettre la culture de cellules sur des plaques revêtues Matrigel dans l&#39;affaire KSR-contenant un milieu conditionné (milieu conditionné par les MEF) 4. Par la suite, les conditions de culture des CSEh ont évolué vers d&#39;alimentation sans culture dans Defin chimiquementconditions éd 5-7. En outre, pour éviter la contamination potentielle par des agents pathogènes d&#39;origine animale et les méthodes de culture des protéines en utilisant la xéno-libres les composants ont été mis en place 8. Pour obtenir de meilleures conditions les cellules nourricières de souris ont été remplacés par des lignées cellulaires humaines (par exemple muscle fœtal et les cellules de la peau 9, cellules cutanées adultes 10, fibroblastes de prépuce 11-12, amniotique des cellules mésenchymateuses 13). Cependant, l&#39;efficacité du maintien de CSEh indifférenciées en utilisant prépuce humain couches nourricières de fibroblastes dérivés n&#39;est pas aussi élevée que celle à partir de cellules nourricières de souris en raison de la faible niveau de sécrétion de l&#39;activine A 14. Évidemment, il ya une différence évidente dans la production de facteur de croissance par la souris et des cellules nourricières de l&#39;homme. Les analyses des transcriptomes de la souris et des cellules nourricières de l&#39;homme ont révélé des différences significatives entre les cellules de soutien et non de soutien. Exogène FGF2 est cruciale pour entretenir cetNing auto-renouvellement des CSEh et hiPSCs, et a été identifié comme un facteur clé dans la régulation de l&#39;expression de Tgfβ1, activine A et Gremlin (un antagoniste BMP) dans des cellules nourricières. Activine A a été montré pour induire l&#39;expression de OCT4, SOX2, et NANOG en CSEh 15-16. Pour culture à long terme, les CSEh et hiPSCs peut être cultivé sur mitotiquement inactivé MEF ou sous alimentation sans conditions dans MEF-CM (MEF milieu conditionné) sur Matrigel plaques enduites de maintenir leur état indifférencié. Le succès des deux conditions de culture dépend entièrement de la qualité des cellules nourricières, car ils affectent directement la croissance des CSEh. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour l&#39;isolement et la culture de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), la préparation de milieu conditionné (CM) et de l&#39;enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) afin d&#39;évaluer les niveaux de l&#39;activine A dans les médias.

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Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

La qualité de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est dicté par la souche de souris droit tel que CF-1. Pluripotence-soutien MEF et des milieux conditionnés (CM) obtenu à partir de ceux-ci devraient contenir des concentrations optimales de l&#39;activine A, Gremlin et Tgfβ1 nécessaires pour la activine / Nodal et des voies FGF à la co-opératoire de maintenir l&#39;auto-renouvellement et la pluripotence.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

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90.4K vues.  Max Planck Institute for Molecular Genetics. La qualité de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est dicté par la souche de souris droit tel que CF-1. Pluripotence-soutien MEF et des milieux conditionnés (CM) obtenu à partir de ceux-ci devraient contenir des concentrations optimales de l'activine A, Gremlin et Tgfβ1 nécessaires pour la activine / Nodal et des voies FGF à la co-opératoire de maintenir l'auto-renouvellement et la pluripotence.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Recherche

Biologie

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...