Nous remercions les Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris et Olga Chumakova pour leur soutien. Le système est Flexstation 3 cadre de la Facilité d&#39;imagerie Cytodynamic UTHSC. Nous remercions également les docteurs. Ardem Patapoutian et Michael Bandell du Scripps Research Institute et l&#39;Institut de génomique de la Fondation Novartis pour la recherche (GNF) pour fournir la lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable. La recherche est financée en partie par des subventions du NIH (GM081658 à MXZ) et le Texas Medical Center Digestive Diseases Center (à HH) et la Mission Connect / TIRR Fondation (à HH).

1. Les préparations de cellules dans des plaques 96 puits Pour les cellules HEK293 transitoirement trasfected avec TRPA1 ADNc humain <ol><li> HEK293 cellules sont cultivées pendant un à deux jours dans Dulbecco Minimal Essential Medium (DMEM) contenant 4,5 mg / ml de glucose (Thermo Scientific, SH3002201), complétée par inactivé à la chaleur 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen, 16000-044), 50 unités / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine (Invitrogen, 15140-163). Le jour de la transfection, la densité cellulaire devrait atteindre 70-90%. </li><li> Manteau plaques à 96 puits par pipetage 50 ul de poly-L-ornithine (Sigma P3655, 20 pg / ml en eau distillée stérile) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant au moins 15 min. Rincez chaque puits une fois avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) sans Mg 2 + et Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La plaque peut être laissé dans la hotte de culture cellulaire pour quelques heures. </li><li> Pour chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits, diluer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf 0,2 pg d&#39;ADNc dans 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Intensifier proportionnellement selon le nombre de puits à être transfectées par l&#39;ADNc mêmes. Aussi diluer dans un séparées de 1,5 ml tube Eppendorf 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) dans 25 ul OPTI-MEM pour chaque puits à transfecter. Échelle de cette place en fonction du nombre total de puits à transfecter. </li><li> Brièvement au vortex de 2000 diluée ADNc et Lipofectamine et laissez-les reposer à la température ambiante pendant environ 5 min. </li><li> Transférer un volume égal de la Lipofectamine diluée 2000 sur le tube qui contient l&#39;ADNc dilué, vortex et laisser reposer le mélange à la température ambiante pendant 15 min à 2 heures. Pendant ce temps, le transfert de l&#39;ADNc / Lipofectamine 2000 mélange à 49 ul / puits de la plaque de poly-L-ornithine couché. </li><li> Trypsiniser les cellules HEK293 (étape 1.1), comte de densité cellulaire à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou contre la comtesse de cellules automatisé (Invitrogen, C10227), et de transférer une quantité désirée de cellules (généralement environ ~ 125,000-150,000 cellules / puits) d&#39;une solution stérile de 15 ml tube à centrifuger conique à fond. Centrifuger à 1000 RPM x pendant 5 min. Resuspendre les cellules à ~ 1,250,00-1,500,000 cellules / ml dans le milieu de culture DMEM, supplémenté avec 10% inactivés par la chaleur du sérum de veau fœtal, mais sans antibiotiques. </li><li> Distribuer 98 suspension cellulaire ul à chaque puits qui contient l&#39;ADNc-Lipofectamine 2000 en utilisant un mélange de pipetteur multicanaux ou le distributeur de microplaques MicroFill (Bio-Tek). Laissez reposer la plaque dans la hotte pendant au moins 30 min avant de le placer à l&#39;humidifié incubateur de culture cellulaire. Incuber à 37 ° C CO, 5% pour les 20-44 2 heures. </li></ol> Pour les cellules HEK293 exprimant de façon stable TRPA1 <ol start="8"><li> Suivez l&#39;étape 1.2 pour enduire les plaques 96 puits. </li><li> La ligne inductible de cellules HEK293-hTRPA1 a été généreusement fourni par le Dr A. Patapoutian (Le Scripps Research Institute) et maintenu dans le même milieu que les HEK293 cellules de type sauvage (étape 1.1), mais supplémenté avec 5 pg / ml blasticidine (Invitrogen, A1113902) et 50 pg / ml d&#39;hygromycine B (Invitrogen, 10687010). Lorsque la densité cellulaire atteint environ 90%, trypsiniser cellules, comptez densité cellulaire, et centrifuger la quantité désirée de cellules à 1000 x RPM pendant 5 min. Resuspendre les cellules à une densité de ~ 1.000.000 cellules / ml dans le même milieu de culture complété par la doxycycline (Fisher, BP26535, 0,25 pg / ml). </li><li> Répartir la suspension cellulaire à la poly-L-ornithine plaques revêtues à 100 l / puits en utilisant un pipetteur multicanaux ou l&#39;MicroFill (Bio-Tek). Laissez reposer la plaque dans la hotte pendant au moins 30 min avant de le placer à l&#39;humidifié incubateur de culture cellulaire. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pour 16 - 24 heures. </li></ol> 2. Solutions <ol><li> Une solution de Hank saline tamponnée (HBSS) est utilisé comme la solution extracellulaire. Il contient (en mM): 137 NaCl, KCl 5,4, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, CaCl 2 1,3, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 de glucose, 10 HEPES, avec un pH ajusté à 7,4 en utilisant NaOH 1N). </li><li> Fluo-4 contient un tampon d&#39;essai de 2 mM de probénécide dans HBSS. Faire 250 mm Stock probénécide (Sigma, P8761) dans NaOH 0,5 N. Diluer à HBSS à un ratio de 1:125. Réajuster le pH à 7,4 à l&#39;aide du HCl 1 N. </li></ol> 3. De chargement cellulaire avec Fluo-quatre heures <ol><li> Dissoudre 1 mg Fluo-quatre heures (Invitrogen, F14202) dans 912 ul de DMSO anhydre pour faire une solution de réserve de 1 mM. Le Fluo-quatre heures solution stock peut être conservé à -20 ° C pendant au moins un mois. </li><li> Mélanger 10 ul 1 mM Fluo-quatre heures avec 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (p / v) solution dans le DMSO), puis transférer le contenu entier de 5 ml Fluo-4 tampon de dosage (étape 2.2) supplémenté avec 0,1% de sérumalbumine bovine (Sigma, A9418). </li><li> Laver les cellules cultivées en plaques 96 puits (étape 1.7 ou 1.10) avec HBSS à 80 ul / puits 2 fois en utilisant un laveur de microplaques (comme ELx405TM de Bio-Tek). </li><li> Ajouter le Fluo-4 AM chargement solution (étape 3.2) à 50 pl / puits en utilisant un pipetteur multicanaux ou l&#39;MicroFill (Bio-Tek) et incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver les cellules trois fois avec le tampon de dosage Fluo-4 (étape 2.2.) En utilisant le laveur de microplaques ELx405TM. Après le dernier lavage, laisser 80 ul du tampon de dosage Fluo-4 dans chaque puits. </li></ol> 4. Préparation de la plaque de composés <ol><li> Pendant la période de 1 heure de chargement de cellules, de préparer une série de dilutions 3x d&#39;agonistes (ou antagonistes) de 3x de la concentration finale souhaitée dans la mémoire tampon de Fluo-4 dosage. </li><li> Pipeter 250 à 300 pl de la solution diluée composé d&#39;une plaque composé de 96 puits. Arrangez-vous pour avoir le dilutions en série d&#39;un composé et les contrôles positifs et négatifs correspondants dans la même colonne de la plaque composé chaque fois qu&#39;il est possible parce que Flexstation 3 lit une seule colonne à la fois. </li></ol> 5. Lecture des plaques dans les trois Flexstation <ol><li> Allumez le système (Flexstation 3, l&#39;ordinateur et le logiciel de SoftMax Pro 5.2) </li><li> Enregistrer l&#39;expérience avec un nouveau nom. Lors de la mise en place, choisissez le mode FLEX et entrez les valeurs suivantes: </li></ol> Protocole n ° 1, l&#39;effet agoniste <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Protocole n ° 2, effet antagoniste <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tableau 2" /><ol start="3"><li> Placez une zone nouvelle astuce, plaque composé et la plaque de lecture pour les bacs appropriés dans Flexstation 3 et cliquez sur &quot;lire&quot; le bouton. Le Flexstation 3 va lire une colonne à la fois et d&#39;ajouter des composés au niveau des points de temps préprogrammés sans interrompre la lecture. Il faut environ 3 minutes (5 min pour le protocole n ° 2) pour terminer la lecture d&#39;une colonne et la machine va continuer à lire la colonne suivante avec des ajouts effectués composé tel que programmé par l&#39;utilisateur dans l&#39;étape 5.2 jusqu&#39;à ce que toutes les colonnes sont lues. </li></ol> 6. L&#39;analyse des données <ol><li> Les données expérimentales peuvent être traitées directement en utilisant les SoftMax Pro 5.2 logiciel ou copié et collé dans n&#39;importe quel tableur comme Microsoft Excel. Courbe concentration-réponse d&#39;un acide TRPA1 agoniste flufénamique (FFA) est construit en utilisant la routine d&#39;ajustement suivant les moindres carrés. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> , Où Y est la réponse observée, Y max est la réponse normalisée maximale, C est la concentration du médicament correspondant, CE 50 est la concentration qui évoque une réponse semi-maximale, et n H est le coefficient de Hill apparente. Concentration d&#39;inhibition de la courbe pour une putative TRPA1 composé antagoniste A est obtenu en utilisant une concentration fixe de la FFA (100 uM), et en augmentant progressivement la concentration du composé A. CI 50 du composé A est calculé par moindres carrés montage de ce qui suit équation. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Équation 2" /> , Où Y est la réponse observée et Y max est normalisé la réponse maximale, [Ant] est le composé correspondant Une concentration, IC 50 est la concentration antagoniste qui produit des demi-inhibition maximale de la FFA-réponse évoquée, et n H est la Colline apparente coefficient. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: TRPA1 est un canal Ca 2 + cation-perméable, l&#39;activation de ce qui conduit à un afflux de calcium qui peuvent être détectés par le Ca 2 + sensibles au colorant, Fluo-4 (1-2). Une lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable a été utilisé pour étudier les relations concentration-réponse de TRPA1 agonistes et antagonistes. Les cellules ont été chargées avec Fluo-quatre heures, placées dans 80 ul du tampon de dosage, et lire l&#39;aide Flexstation 3. Après l&#39;enregistrement de la fluorescence de base pour 30 s, 40 pi d&#39;une dilution en série de l&#39;agoniste TRPA1, FFA, chacun à 3x sur la concentration finale désirée, ont été ajoutés à des cellules à travers un pipetteur multicanaux inclus comme une partie du module fluidique des Flexstation 3. Les changements de fluorescence ont été suivis pendant une supplémentaire de 180 s. Les changements relatifs Fluo-4 de fluorescence de chaque puits ont été exprimés en AF = (F - F 0), où 0 F et F sont des valeurs de fluorescence à la fois de l&#39;intérêt et le début de la lecture, respectivement. Représentant des traces des cours du temps pour les changements de fluorescence en réponse à une série de concentrations FFA sont présentés sur la Fig. 1. Note pour les concentrations dernière FFA quatre, bien que les niveaux de réponse maximal sont similaires, la cinétique d&#39;activation est nettement plus rapide à la plus élevée que pour les concentrations inférieures FFA. Par conséquent, pour distinguer ces différences, la concentration - relation dose-réponse a été construite en mesurant les taux initiaux (pente) de l&#39;augmentation de fluorescence lors de l&#39;addition de concentrations variables de la FFA (Fig. 2). L&#39;effet maximal moitiéla concentration IVE (CE 50) de la FFA a été établi à 55,4 uM (n = 3). Pour tester la putatifs TRPA1 antagoniste, le composé A, nous avons réalisé une expérience similaire en utilisant le protocole n ° 2 (étape 2). Dans ce cas, une série de dilutions de l&#39;antagoniste ont été ajoutés à 30 s (40 pi de 3x désiré concentrations finales) et la FFA a été ajouté plus tard, 180 s (60 pi à 300 uM pour une concentration finale de 100 uM). Composé A dose-dépendante réduit la réponse de l&#39;TRPA1 cellules à la FFA avec une concentration maximale moitié inhibitrices (CI 50) de 4,3 uM (n = 3) (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Concentration-dépendante l&#39;activation de TRPA1 humaine par la FFA. Les traces sont plus évoqués FFA de la fluorescence au cours du temps (réponses uniquement dans les 60 premières secondes sont présentés pour mieux illustrer la cinétique rapide de la FFA-réponses évoquées). S&#39;il vous plaît noter que des concentrations plus élevées FFA évoqué augmentation de fluorescence avec un. Beaucoup plus rapide que les cinétiques des concentrations plus faibles, même si les niveaux de crête de fluorescence ont été similaires <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2 Concentration -. Relations de réponse pour le changement induit par la FFA fluorescence et composé A induit une inhibition de la réponse de la FFA dans le TRPA1 humaine exprimée de façon stable dans les cellules HEK293. Δ, la concentration - relation dose-réponse du FFA a été déterminée en mesurant le taux initial (pente) de l&#39;augmentation de la fluorescence normalisée lors de l&#39;addition de concentrations variables de la FFA. O, relation concentration-réponse de l&#39;inhibition de la FFA-réponse évoquée du calcium par une putative TRPA1 antagoniste, composé A.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Intracellulaire de Ca 2 + joue un rôle important dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, tels que libération des neurotransmetteurs (3), le potentiel d&#39;action cardiaque (4), la contraction des cellules musculaires (5), la transduction du signal cellulaire (6-7), et la mort cellulaire excitotoxique ( 8). Mesure de Ca 2 + intracellulaire niveaux aide à élucider les changements fonctionnels de Ca 2 +-canaux perméables dans la membrane plasmique ou organites i...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Flexstation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> Flex3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Eh bien, embouts de pipettes Flexstation </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 96 puits </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Eh bien clair plaques à fond plat </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-quatre heures </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-ornithine </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probénécide </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

Flexstation La Molecular Devices &#39;3 est une paillasse multi-mode lecteur de microplaques capable de mesure de la fluorescence automatisé plaques multi-puits. Elle est idéale pour les moyennes et à haut débit écrans dans les milieux universitaires. Il dispose d&#39;un module de transfert de fluide intégré équipé d&#39;un pipetteur multi-canal et la machine lit une colonne à la fois de surveiller les changements de fluorescence d&#39;une variété de réactifs fluorescents. Par exemple, Flexstation 3 a été utilisé pour étudier la fonction de Ca 2 +-perméable canaux ioniques et G récepteurs couplés aux protéines en mesurant les changements de libre intracellulaire de Ca 2 + niveaux. Transitoire des récepteurs potentiels (TRP) des canaux sont une grande famille de canaux cationiques non sélectifs qui jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques et physiopathologiques. La plupart des canaux TRP sont perméables de calcium et d&#39;induire l&#39;influx de calcium lors de l&#39;activation. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;application de Flexstation 3 pour étudier le profil pharmacologique de la voie TRPA1, un capteur moléculaire pour de nombreux stimuli nocifs. Cellules HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire humaine TRPA1 canaux, cultivés dans des plaques 96 puits, sont chargés avec un Ca 2 + sensibles au colorant fluorescent, Fluo-4, et en temps réel les changements de fluorescence de ces cellules sont mesurés avant et pendant l&#39;application de la un agoniste TRPA1 utilisant le mode FLEX de l&#39;Flexstation 3. L&#39;effet d&#39;une putative TRPA1 antagoniste a été également examiné. Les données sont transférées à partir du logiciel Pro SoftMax de construire des relations concentration-réponse du TRPA1 activateurs et inhibiteurs.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour l&#39;étude du profil pharmacologique de canaux à l&#39;aide humaine TRPA1 Flexstation 3. Le protocole couvre les détails de préparation de cellules, le colorant de charge et le fonctionnement du lecteur de microplaques, Flexstation 3.

Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K vues.  The University of Texas Health Science Center at Houston. Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour l'étude du profil pharmacologique de canaux à l'aide humaine TRPA1 Flexstation 3. Le protocole couvre les détails de préparation de cellules, le colorant de charge et le fonctionnement du lecteur de microplaques, Flexstation 3.

Vidéo: Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) pour criblage à haut débit des médicaments antifongiques

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Génération des solutions évolutives de métal de très haute-Aspect Ratio nanocomposites dans un milieu liquide biologique

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Optimisation des processus à l’aide de micro-bioréacteurs automatisés à haut débit dans la culture chinoise de cellules d’ovaires de Hamster

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...