Aujourd’hui, nous allons démontrer une méthode pour filtrer une bibliothèque de peptides, contre un récepteur maître récemment découvert, qui est le récepteur X2 de la protéine G lié à Mas, également connu sous le nom de récepteur MRGPRX2. Les mastocytes font partie intégrante du système immunitaire et jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les mastocytes sont activés soit par le récepteur Fc epsilon R1 lié à l’antigène, soit par le récepteur X2 récemment découvert.
L’activation du récepteur X2 lié à la surface a été liée à plusieurs maladies immunologiques et enflammées et, par conséquent, il est important de comprendre le mécanisme de liaison de ce récepteur à ses ligands. Pour ce faire, nous avons développé une bibliothèque de petites molécules peptidiques, et les avons filtrées contre les récepteurs X2 sur-exprimés sur hexis. Dans l’étude, une bibliothèque de peptides a été construite en utilisant des techniques simples et polyvalentes de balayage de l’alanine et des troncations d’acides aminés.
Heck293 dit, l’expression des récepteurs X2 lorsqu’ils sont activés avec les peptides et l’hexis de type large ont été utilisés comme contrôle. Dans la libération de troncature lors de l’activation a été surveillé pour étudier l’activation basée sur X2. Expérimentalement, fura-2 AM Calcium Sensitive Dye est excité à 340 et 380 nanomètres, tandis que l’émission est enregistrée à 510 nanomètres.
Lors de la liaison au calcium, l’intensité de fluorescence à 340 augmente, tandis que celle de 380 nanomètres diminue. Le colorant est ensuite déposé au rapport de l’intensité de fluorescence à 340, à celle de 380 nanomètres. Le 340 d’un rapport 380, est proportionnel au calcium intracellulaire, la valeur de celui-ci, peut être calculée, par l’équation de Grynkiewicz.
Le rapport de tabulation de deux intensités de fluorescence, l’effet de facteurs expérimentaux tels que la dilution, le photobleaching, les fuites de colorant et les densités d’odeur sont détectés. Alors, sans plus attendre, commençons l’expérience. Identifier les ligands du récepteur MRGPR X2 des mastocytes, générateur N-tronqué, C-tronqué et N+C-tronqué de la bibliothèque peptidique, en tronquant les acides aminés N-terminaux, C-terminal et N+C-terminal de la mauvaise proctivité pam-12.
Utilisez la synthèse peptidique en phase solide pour synthétiser les peptides. Modifiez la borne terminale en un groupe de marée défini et la borne C en groupe amide. Générer et les alanines peuvent bibliothèque de peptides, en remplaçant les acides aminés respectifs de pam-12 par Alanine, un à la fois.
Modifiez la borne terminale en groupe setide et la borne C en groupe amide. Préparer le milieu de culture en complétant le DMEM à haute teneur en glucose, avec 10% de sérum bovin fœtal, deux millimolaires L-Glutamine, cent unités par ml de pénicilline et cent microgrammes par ml de streptomycine. Outre les cellules de la culture tee sue, 375 flacons de culture à 37 degrés Celsius, 5% co2, jusqu’à ce qu’ils soient confluents à 75 à 80%.
Une fois confluent à 75%, lavez les cellules et ajoutez deux à trois ml de Proof-C, pour détacher les cellules. Une fois que les cellules se sont détachées, collectez les cellules dans Proof-C. Ajouter six à neuf ml de milieu frais.
Centrifuger les cellules à 1620g pendant trois à cinq minutes. Après centrifugation, jeter le surnageant pour recueillir la pastille. Resuspendez les cellules dans un milieu de culture frais.
Diluer les cellules, selon la concentration souhaitée. À 200 microlitres de la suspension cellulaire avec une concentration de 200 000 cellules, versez l’ambon dans chaque puits pour rechercher 40 000 cellules par puits. Gardez les cellules pendant 24 heures dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5% CO2.
Utilisez le colorant Fura-2 AM pour l’expérience. Ajouter 50 microlitres de DMSO dans 50 microgrammes de Fura-2 AM, pour préparer une solution millimolaire de colorant Fura-2 AM. Ajouter un microlitre d’un colorant millimolaire Fura-2 AM par ml de milieu frais pour préparer le milieu diluant d’une concentration de colorant micromolaire.
Retirez la plaque de 96 puits de l’incubateur et jetez le milieu. Remplacer le milieu par un milieu diluant frais. Ajouter 200 microlitres de milieu diluant dans chaque puits.
Incuber les cellules pendant 30 à 40 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% CO2. Pendant l’incubage des cellules, réglez le lecteur de plaques. Réglez la température à 37 degrés Celsius.
Dans les paramètres, sélectionnez Flex. Réglez le mode de lecture sur Fluorescence et Lecture inférieure. Dans Longueurs d’onde, définissez le nombre de longueurs d’onde sur deux.
Réglez l’excitation sur 340 nanomètres et 380 nanomètres. Réglez l’émission sur 510 nanomètres. Laissez la sensibilité sur Par défaut.
Dans Timing, définissez l’intervalle sur 3,9 secondes. Définissez la durée d’exécution sur 94 secondes pour obtenir 25 nombres de lectures. Ensuite, sélectionnez le type de plaque d’essai.
Ensuite, sélectionnez les puits à lire. Dans Transfert composé, définissez les transferts sur un et le volume initial sur cent microlitres. Réglez la hauteur de la pipette sur cent microlitres, le volume sur 50 microlitres et le point temporel sur 36 secondes pour ajouter le composé et tenir la lecture.
Ensuite, sélectionnez le type de plaque Source composée. Laissez Triturate ne pas utiliser. Sélectionnez la disposition Conseils et embouts de pipette.
Pour les colonnes composées et tip, le composé sera transféré dans la première colonne de la plaque composée. Définissez la colonne d’embout sur une et la colonne composée sur une. Laissez Le écalibrer automatique sur Activé.Cliquez sur OK. Après 40 minutes d’incubation, retirer le milieu.
Lavez les cellules avec le tampon XDB. Ajoutez cent microlitres de tampon XDB pour la lecture de fluorescence. Prenez la plaque pour la lecture de fluorescence.
Lorsque le pritchett a atteint 37 degrés Celsius, appuyez sur la chambre de lecture pour placer la plaque d’essai dans le lecteur de plaque de fluorescence. Appuyez sur la source pour placer la plaque composée. Préparez la plaque composée en ajoutant 200 microlitres de peptides respectés ionomysine et EGTA pour transformer les solutions X.
Appuyez sur le pratt de pointe pour mettre la boîte à pourboires. Utilisez une pointe noire pour éviter l’autofluorescence de la pointe. Une fois les plaques conservées, et si vous utilisez les paramètres du logiciel et appuyez sur Lire.
Déterminer la concentration de calcium à partir du rapport de fluorescence par l’équation de Grynkiewicz. Les données de fluorescence du bon peptide pam sont montrées. Comme on peut le voir, après l’ajout de peptides à 36 secondes, la fluorescence à 340 nanomètres qui est tiède augmente de celle de 380 nanomètres enregistre des diminutions.
Les données sont représentées comme le rapport de 340, à celui du signal 380. Ils montrent que les signaux augmentent après l’ajout de peptides. Cette figure est la donnée représentative d’un peptide activateur.
La figure A montre les signaux de fluorescence d’un peptide activateur. Les données représentatives correspondent au peptide cram12 ajouté après avoir créé une base de référence pour les cycles d’appel d’offres, comme le montre l’ado. La figure B montre le rapport entre l’émission de fluorescence après excitation à 340 nanomètres et celle de l’émission de fluorescence après excitation à 380 nanomètres.
Cette figure est la donnée représentative pour le blanc. La figure A montre les signaux de fluorescence pour l’ébauche. HTB a été ajouté après dilution d’une ligne de base pour 10 cycles d’alimentation, comme le montre l’ado.
La figure B montre la ration de l’émission de fluorescence après excitation à 340 nanomètres à celle de l’émission de floraison après excitation à 380 nanomètres. Cette figure est la donnée représentative des étalons d’étalonnage des colorants. La figure A montre que l’ionomycine a été ajoutée aux 10e lectures, comme le montre l’ado pour obtenir une fluorescence maximale dans l’état lié au cashem.
EGPA Triton X cent a été ajouté après 20 lectures comme le montre l’ado qui obtient un signal minimum. La figure B montre le rapport entre l’émission de fluorescence après excitation à 340 nanomètres et celle de l’émission de fluorescence après excitation à 380 nanomètres. Ces valeurs sont ensuite mises dans l’équation de Grynkiewicz pour obtenir le cache intracellulaire de concentration.
Cette figure montre la caractérisation d’un peptide représentatif pour confirmer la séquence et la pureté. La figure A montre que la masse verticale de la séquence peptidique représentative WNK WAL était de 857,90 éclaircies. Ce qui est montré par le rapport N sur Zed en spectroscopie de masse.
La figure B montre une pureté peptidique de 99%, confirmée par hpLC. Ce peptide appartient à la bibliothèque de peptides tronqués N+ C. En conclusion, la méthode décrite ici est une méthode facile et polyvalente qui peut être efficace et brillante pour le dernier criblage à base de calcium.
Cependant, plusieurs facteurs déterminent la qualité des données et, par conséquent, la composition doit être optimisée pour un système d’instrument cellulaire donné. Merci.
