Nous démontrons d’innombrables méthodes pour tout le contrôle optique et l’observation de l’activité cellulaire déclenchée dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC pour le dépistage de médicaments à haut débit et les tests de toxicité. Permet une quantification multiparamétrique des modèles phénotypiques dans le temps et l’espace, permet d’observer l’effet des médicaments sur des heures ou des jours. Cette méthode peut être appliquée à différents types de cellules, telles que les neurones ou les cellules bêta, pour le dépistage fonctionnel et les tests de toxicité.
La démonstration de la procédure sera assurée par Wan-Chi Su, un ingénieur en bio-imagerie de mon laboratoire. Préparez la plaque multipuits avant que les cardiomyocytes iPSC ne soient retirés de l’entreposage frigorifique pour la décongélation. Enduisez chaque puits de la microplaque de 96 puits avec 100 microlitres de solution de gélatine à 0,02% avec 50 microgrammes par millilitre de fibronectine pour couvrir toutes les surfaces en profondeur.
Transférer les cardiomyocytes iPSC du réservoir de stockage d’azote liquide au bain-marie de 37 degrés Celsius. Apportez le flacon dans une enceinte de biosécurité de classe deux et transférez délicatement le contenu dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de milieu à température ambiante. Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes à température ambiante.
Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre doucement les cellules en suspension dans un millilitre de milieu avec 10 micromolaires inhibiteurs de ROCK Y27632. Les cellules à plaques ont encodé 96 plaques de puits à la densité de 100 000 à 150 000 cellules par centimètre carré, conformément aux instructions du fabricant. Après 24 heures, assurez-vous que les cellules fixées à la surface de la plaque sont en contact avec d’autres cellules.
Après avoir plaqué les cellules pendant 72 heures, décongelez les kits viraux GECI sur de la glace. Préparez une solution de souche de kit viral à double concentration avec le milieu d’entretien. Préparez les cellules à l’infection en ajustant le volume moyen à 100 microlitres par puits.
Ajouter 100 microlitres de la solution virale prémélangée dans les puits et incuber pendant huit à 16 heures à 37 degrés Celsius. Après incubation, remplacer par 200 microlitres de milieu préchauffé. Visualisez l’expression des GECI 24 heures après la transduction à l’aide d’un système d’imagerie.
Maintenir les cellules dans l’incubateur humidifié avant d’effectuer des tests fonctionnels. Allumez tous les appareils du système d’imagerie à contenu élevé. Vérifiez que la température de la chambre atteint 37 degrés Celsius avec une supplémentation en dioxyde de carbone de 5%.
Ouvrez le logiciel d’imagerie et choisissez le réglage de la plaque pour une plaque de 96 puits. Placez une plaque de 96 puits sans couvercle dans la chambre et chargez l’anneau d’étanchéité de la cellule sous tension sur le dessus. Choisissez l’objectif d’immersion dans l’eau 20X, 60X et 20X, en fonction de la résolution spatiale requise.
Ajustez la mise au point pour prendre des images claires avant l’acquisition expérimentale. Sélectionnez trois à cinq régions au hasard par puits pour l’enregistrement de l’activité calcique. Choisissez des filtres appropriés pour différents indicateurs.
Réglez la puissance de la diode électroluminescente appropriée pour chaque canal d’imagerie utilisé. Réglez le temps d’exposition de la caméra sur un maximum de 40 millisecondes ou 25 hertz, et une durée d’enregistrement de 30 secondes pour l’acquisition du flux afin d’observer les transitoires calciques, rapportés par les sondes MNG-GECO et K-GECO exprimés en cardiomyocytes. Augmentez la puissance de la LED si le rapport signal sur bruit est inférieur à deux à des fréquences d’images plus élevées.
Pour la stimulation optogénétique, optimisez la puissance et la fréquence de la lumière bleue à un hertz et commencez l’acquisition. Suspendez à nouveau le dofestilide E4031 et le vérapamil dans du DMSO et diluez-les avec le tampon de Tyrode. Disposer les composés sur le puits cible correspondant.
Ajoutez 100 microlitres du composé à double résistance via le système micro-fluidique automatique dans les puits et commencez l’acquisition après la période d’incubation souhaitée. Isolez la zone du signal de l’arrière-plan en détectant automatiquement la fonction d’impulsions, au fil du temps, avec le logiciel. Utilisez le logiciel d’analyse des pics de calcium pour analyser la fréquence de battement, le signal de pointe, la durée transitoire du calcium 50% de la durée transitoire du calcium 90% du temps de montée et le temps de désintégration.
L’observation de l’oscillation spontanée du calcium dans NMG-GECO exprimée par des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC avec ou sans traitements médicamenteux est démontrée dans la vidéo. Les traces cinétiques obtenues à l’aide de MNG-GECO ont montré que les petits inhibiteurs moléculaires des canaux ioniques vérapamil, dofétilide et E4031 affectaient les transitoires calciques comme prévu. Pour évaluer la relation dose-réponse de E4031 dans des conditions normalisées et rythmées, les CM de la cPSC exprimant la rhodepsine-2 et K-GECO ont été contrôlées optiquement à l’aide d’impulsions lumineuses d’un hertz et de 470 nanomètres, et observées à l’aide du signal rouge K-GECO.
Des réductions progressives de l’amplitude maximale et une augmentation du temps de désintégration des transitoires calciques se produisent avec l’augmentation des concentrations de E4031. Un effet dose-dépendant de E4031 était le plus apparent pour les réductions de l’amplitude de crête. Les transitoires de calcium clair restent visibles un mois après la transduction virale, ou sans la lumière supplémentaire utilisée pour la stimulation optique.
Le graphique représente un médicament qui semble augmenter le taux de battement, régulariser l’intervalle de contraction et augmenter l’amplitude transitoire du calcium, en mode LVNC iPSC CM. La variabilité de la fréquence des battements et l’impact subséquent sur la durée transitoire du calcium changent également à mesure que les CM des CSPi sont maintenues en culture. Plusieurs GECI, y compris ER LAR-GECO, MTG-SÉPIA et NIR-GECO, ont été développés pour l’expression seule ou en combinaison dans des modèles cellulaires pour la mesure en temps réel de l’activité calcique dans le réticulum endoplasmique, le réticulum sarcoplasmique, les mitochondries et le cytosol, respectivement.
Les GECI peuvent être combinés dans le modèle CM iPSC pour étudier différentes réserves intracellulaires de calcium. Les cardiomyocytes exprimant K-GECO ont montré un comportement de battement constant au fil du temps. Cependant, la charge de Fluo-4 a eu un impact à la fois sur la fréquence des battements et sur le CTD dans ce modèle, ce qui suggère que Fluo-4 lui-même pourrait influencer les résultats de telles expériences.
Nous offrons un moyen simple d’étudier les profils phénotypiques des cellules témoins et des cellules dérivées des patients, tandis que l’intermédiaire iPSC peut faire la lumière sur la découverte de médicaments dans diverses maladies.
