Le test de double addition de fluorescence calcique à haut débit permet d’identifier de nouveaux ligands à petites molécules d’un récepteur couplé à la protéine G qui signale à travers la cascade de calcium intracellulaire. Le principal avantage du test à double addition est la détection de l’agoniste et de l’antagoniste HTS dans un seul test avec les mêmes cellules à condition que le signal de fluorescence dure deux minutes. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel RCPG qui signale à travers la cascade de calcium, qui comprend la plupart de la famille des peptides neuronaux arthropodes, un RCPG.
Pour la reproductibilité du test, il est important d’optimiser la densité cellulaire, la vitesse d’injection et la concentration de l’agoniste connu pour la deuxième édition. La démonstration de la procédure sera assurée par Bianca Henriques-Santos, associée de recherche postdoctorale dans mon laboratoire. Commencer l’essai de fluorescence calcique en retirant le milieu usé du ballon T-75 contenant de 70 à 90 % de BMLK confluents à trois cellules.
Lavez les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco ou DPBS. Après avoir retiré le DPBS, détacher les cellules à l’aide de deux millilitres d’acide éthylènediaminetétraacétique à 0,25% de trypsine ou EDTA et incuber pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter huit millilitres de milieu sélectif et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.
Avant de centrifuger la suspension cellulaire à 1000 x g pendant trois minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu F-12K contenant 1% de sérum bovin fœtal ou FBS et 400 microgrammes par millilitre de sulfate G418. Pour déterminer la densité cellulaire de la suspension pour une dilution ultérieure, mélangez 20 microlitres de suspension cellulaire dans 20 microlitres de bleu de trypan à 0,4%, puis chargez 20 microlitres de mélange dans une chambre de comptage de cellules à lire par un compteur de cellules pour la densité cellulaire.
Diluer la suspension cellulaire en utilisant le même milieu F-12K et compléter le volume final à 15 millilitres à une densité de quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Pour ensemencer les cellules dans la plaque de puits 384 codée Poly-D lysine ou PDL. Ajouter 25 microlitres de la suspension cellulaire diluée dans 384 puits de la plaque à l’aide d’un système de manipulation des liquides.
Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans l’incubateur humidifié. Le lendemain, inverser rapidement la plaque de puits 384 confluents à 90%. Retirer le milieu usé et éponger doucement sur des serviettes en papier stériles deux à trois fois pour retirer tout le liquide de la plaque.
Effectuez les étapes suivantes dans la faible lumière à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de colorant de chargement dans chaque puits à l’aide d’un système de manipulation de liquide en distribuant 12,5 microlitres dans chaque puits avec une vitesse d’aspiration et de distribution de 3,8 microlitres par seconde. Répétez cette étape de pipetage pour atteindre un volume final de 25 microlitres dans chaque puits.
Une fois cela fait, couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière ambiante et incuber à 37 degrés Celsius dans l’incubateur humidifié au dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après avoir équilibré la plaque couverte pendant 30 minutes supplémentaires, les cellules sont prêtes pour le criblage à haut débit ou HTS. Ensuite, centrifugez la plaque de médicament à 1200 x g dans une centrifugeuse à plaques pendant une minute.
Transférer la solution peptidique agoniste 10x de Rhimi-K-1 dans un réservoir auto-friendly de 150 millilitres. Dans le lecteur de plaques, cliquez sur Gérer les protocoles. Ensuite, dans le protocole d’intensité fluorescente du point de terminaison, sélectionnez Flow Forte pre-read, cliquez sur Démarrer la mesure pour mesurer le signal de fond pour l’ensemble du test HTS.
Insérez la plaque cellulaire dans le lecteur de plaque. Dans le tableau de bord, cliquez sur un puits aléatoire sur la plaque, puis cliquez sur une nouvelle hauteur de mise au point. Cliquez sur réglage de la mise au point.
Cliquez sur Réglage du gain. Attribuez-lui entre 5 % et 10 % de la valeur de fluorescence maximale mesurable. Cliquez sur Démarrer le réglage.
Cliquez sur Démarrer la mesure pour lire la plaque entière pour le signal de fluorescence de fond en unités de fluorescence relative ou RFU. Pendant la lecture de la plaque, cliquez sur l’état actuel pour voir la valeur de lecture en temps réel. Pour le test à double addition, pipeter 10 microlitres de la solution médicamenteuse de haut en bas trois fois en utilisant le système de manipulation du liquide et aspirer 1,5 microlitre de chaque puits de la plaque de médicament à une vitesse d’aspiration de 1,0 microlitre par seconde.
Distribuer 0,5 microlitre des composés dans le test cellulaire pour atteindre une concentration finale de deux micromolaires dans 0,2% de diméthylsulfoxyde ou DMSO. Après avoir ajouté les composés de criblage, placez immédiatement la plaque de dosage dans le lecteur de plaques. Cliquez sur le programme de lecture prédéfini et lisez la plaque dans les directions de lecture avant et arrière.
Éliminez un microlitre de solution médicamenteuse restant dans les embouts en immergeant les embouts dans un réservoir de déchets de 150 millilitres contenant environ 50 millilitres de DPBS. Incuber les composés de criblage avec les cellules pendant un total de cinq minutes, y compris le temps à l’intérieur du lecteur de plaques dans l’armoire de biosécurité avec les lumières éteintes. Ensuite, ajoutez trois microlitres du peptide agoniste Rhimi-K-1 du réservoir dans la plaque de dosage en utilisant le système de manipulation des liquides à l’aide de 384 pointes de 12,5 microlitres.
Placez immédiatement la plaque dans le lecteur de plaques. Cliquez sur le programme de lecture prédéfini et lisez la plaque dans les directions de lecture avant et arrière. Une fois terminé, calculez manuellement le facteur Z pour le contrôle de la qualité de chaque essai sur plaque.
Sélectionnez manuellement les molécules de hit à partir des cartes thermiques sur la plate-forme de données HTS en ligne et calculez le pourcentage normalisé d’activation ou NPA et activité inhibitrice, ou I0 pour les hits agonistes et les hits antagonistes. Une plaque médicamenteuse interne SAC2-34-6170 composée de 320 petites molécules aléatoires a été utilisée pour démontrer ce test HTS. Le HTS avait une excellente qualité de dosage avec un facteur Z de 0,7 reflétant que la qualité du test était indépendante des composés testés.
Il est essentiel de lire la plaque immédiatement après l’ajout de l’agoniste car le signal de fluorescence est de courte durée. Après cette procédure, la molécule de résultat identifiée doit être validée par des dosages dose-réponse et testée dans des cellules qui n’expriment pas le RCPG cible pour exclure les résultats hors cible.
