Ce travail a été financé par des subventions aux SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Un appui supplémentaire a été fourni par: DW: NIH RO1DK075013, DDK et la Fondation Kleberg; le Core flux CVUC cytométrie (NIH 5 P30 CA 46934-15), la CVUC Microarray de base (NCI P30 CA 46934-14).

1. Isolement du poumon <ol><li> Sacrifice souris adultes (8-10 semaines d&#39;âge; 18-20 g; C57Bl6J) des souris avec une surdose d&#39;isoflurane suivi par exsanguination utilisant une technique stérile. Profils varient légèrement entre les souches. </li><li> Enlever chirurgicalement le diaphragme, d&#39;ouvrir la cavité thoracique en coupant la cage thoracique latéralement de chaque côté de la souris. Rincer le sang des poumons en perfusant le ventricule droit du cœur doucement à l&#39;aide de 3 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Disséquer les lobes pulmonaires enlever la trachée les bronches et les grands et les placer dans une boîte de Pétri remplies de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS). Après la collecte des lobes pulmonaires tous les forceps sont utilisés pour placer le tissu sur le couvercle du plat. Tissu est ensuite hachée en petits morceaux à l&#39;aide de scalpels jetables avec assez de liquide pour les garder humides, mais pas tant qu&#39;elles flottent et se déplacent. </li><li> Disséquer une patte arrière d&#39;une des souris et d&#39;isoler la moelle osseuse pour l&#39;utiliser comme un contrôle pour régler la coloration flow cytométrie portes. Tache de la moelle osseuse (BM), comme décrit précédemment 1. </li></ol> 2. Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique des tissus pulmonaires <ol><li> Chaque poumon est digérée en utilisant un poids optimisé pour les tissus rapport en volume de 0,2 g: 5 ml de pré-chauffé à 0,2% Worthington type 2 collagénase (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissous dans du HBSS stérile. Le mélange est immergé dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30 min 2,3. </li><li> Triturer échantillon bien digérer jusqu&#39;au tissu pulmonaire s&#39;écoule facilement par une pipette de 10ml (environ 10 répétitions). Incuber pendant 15 min supplémentaires à 37 ° C pour compléter le tissu digère et assure une suspension cellulaire plus uniforme unique. </li><li> Diluer la suspension de cellules de poumon avec HBSS et triturer avec une pipette de 5 ml pour disperser des fragments de tissu résiduel. </li><li> Filtrer la suspension cellulaire à l&#39;aide d&#39;une passoire pour enlever 70μM fragments de tissus non digérés. L&#39;échantillon peut être divisé en multipltubes coniques e à ce point pour éviter la surcharge des cellules et une crépine de diminuer le temps. </li><li> Pellet la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 rpm et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire en douceur en utilisant la température ambiante RBC tampon de lyse (eBiosciences, San Diego, CA; # cat 00-4333-57) et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter un volume égal de HBSS pour inactiver le tampon de lyse et de filtrage de la suspension cellulaire à l&#39;aide d&#39;une passoire cellules 40μM pour enlever les débris et les agrégats cellulaires. </li><li> Pipeter 10 ul de chaque échantillon à être colorées et de compter le nombre de cellules à la fois pour le poumon et les échantillons de BM en utilisant un hématimètre. Remarque: enregistrer le volume total des cellules. </li><li> Pellet la suspension cellulaire unique de cellules pulmonaires par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min. </li><li> Resuspendre deux poumons et les cellules BM au 1x10 6 cellules / ml dans préchauffé (37 ° C) DMEM + (milieu de Dulbecco modifié Eagle, élevée en glucose (Gibco, Carlsbad, CA; # cat 11965-092) contenant 2% de fœtus BoviNE sérum (FBS) et HEPES 10 mM. </li><li> Préparer une solution stock de 1mg/ml de Hoechst 33342 colorant (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; # cat B2261) dans l&#39;eau et stériliser par filtration 1,4. Le colorant Hoechst peuvent être stockées sous forme d&#39;aliquots à -80 ° C. </li><li> Ajouter Hoescht 33342 teinture à une concentration finale de 5μg/ml (une dilution 200x d&#39;un stock 1mg/ml) à la suspension cellulaire unique. </li><li> Mélanger délicatement les cellules par l&#39;inversion et incuber à 37 ° C l&#39;eau de bain pour exactement 90 minutes. </li></ol> 3. Coloration et préparation de la suspension cellulaire du poumon pour l&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> Après 90 minutes toutes les étapes avec les cellules des poumons tachés Hoechst doit être exécuté à 4 ° C ou sur la glace pour empêcher l&#39;efflux de teinture. Pellet les cellules par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans tampon glacé coloration (PBS 2% de FBS). </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration ne dépassant pas 1x10 7 cellules / tube à l&#39;aide de 300 600μl de PBS contenant 2%FBS et HEPES 10 mM. </li><li> Ajouter suffisamment ricanait CD45 (généralement 1:200 dilution du CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; # cat 559864) dans les poumons et les échantillons BM Incuber sur la glace pendant 10-15 minutes incluant un contrôle sans tache lors de la.. procédure expérimentale est utile de définir les portes d&#39;analyse. </li><li> Pellet cellules à 4 ° C pendant 5 min à 1500 rpm. Décanter le surnageant et les cellules remettre en suspension dans 500 pl de tampon de coloration glacée (PBS 2% de FBS). Transfert à prechilled tubes pression bouchon en polypropylène (Fisherbrand, Schaumburg, IL, chat N ° 14-956-1D). </li><li> Ajouter l&#39;iodure de propidium (PI, le stock 200μg/ml dans le PBS) pour les échantillons pour une concentration finale de 2μg/ml d&#39;exclure les cellules mortes. PI doit être utilisé en combinaison avec le colorant Hoechst 33342 pour atteindre le bon profil de fluorescence lors de l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li><li> Conserver les tubes sur la glace, abri de la lumière jusqu&#39;à l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 4. Cytométrie en flux pour définir et isolerUne cellule souche du poumon mésenchymateuses (CSM poumons) Population utilisant colorant Hoechst Efflux pour détecter une population Side (SP) <ol><li> Ce test a des exigences instruments suivants: </li><ul><li> 488 nm et UV (350-355 nm) lasers </li><li> 2 détecteurs sur le chemin de laser UV avec du bleu (450/65) et rouge (675/50) filtres. </li><li> Le détecteur UV rouge doit avoir une sensibilité élevée pour le signal rouge. Cela peut être un problème avec les trieurs de cellules plus âgées. </li><li> Unité de refroidissement pour maintenir l&#39;échantillon à 5-10 ° C. </li></ul><li> Aligner les lasers et mis en place pour le tri des cellules selon le protocole du fabricant. </li><li> Recueillir le rouge (axe x) et bleu (axe des y) en utilisant des signaux Hoechst une échelle linéaire. </li><li> Ajustez les tensions tube photomultiplicateur de placer le pic G0/G1 en haut à droite du centre de la parcelle pour permettre l&#39;affichage adéquate de la population côté arrière. Une partie de la phase S et l&#39;ensemble du G2 du cycle cellulaire peut être hors-échelle sur la droite supérieure de la parcelle. Le SIG bleuenal est relativement lumineux tandis que le signal rouge est sombre. Typiques MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) les tensions sont 425 pour le bleu et 650 pour le rouge. </li><li> Les cellules mortes sont déclenchées à l&#39;aide de PI. La voie standard IP (excitation 488nm, émission 630 nm) peuvent être utilisés. Alternativement, le PI est aussi excité par le laser UV et la population de cellules mortes se trouve au large échelle sur le côté droit du côté de la population (SP) intrigue. Cela allège le besoin de compenser le signal PI de tout autres fluorochromes tels que le FITC et PE. La méthode originale Goodell a suivi les procédures dernière 5-7. </li><li> Maintenir une pression différentielle relativement faible en cours d&#39;analyse et de tri pour assurer la résolution de la population serrée côté. </li><li> Le SP apparaît comme un bras latéral en dehors de la principale population de cellules du poumon. Cette population est appelée Hoechst faible. </li><li> Le faible Hoechst / SP est analysé pour séparer les populations CD45 positifs et négatifs en utilisant un histogramme 2,3 (Figure 1). </li><li> Après sélection et gating des Hoechst faible CD45 neg population pulmonaires MSC les cellules peuvent être recueillies par le tri soit comme une population mixte dans un tube ou des cellules individuelles pour isoler les clones dans une plaque de 96 puits 3. </li><li> Pour la plaque de tri la déviation flux de tri est ajusté à 25% pour créer un flux de tri plus verticale que celle habituellement utilisée pour le tri des tubes. </li><li> Viser le flux de tri en envoyant une impulsion sur le flux de test en haut à gauche puis en bas à droite des puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Réglez le plan de la plaque trieuse logiciels de déposer le nombre souhaité de cellules dans chaque puits. </li><li> Pour isoler des clones de cellules unique un seul poumon MSC est trié dans le puits d&#39;une plaque de 96 puits dans 150μl de la culture médiatique (α-MEM additionné de SVF 20%). Après le tri supplémentaire de 100 ul une moyenne est ajoutée. </li></ol> 5. L&#39;isolement, la culture et de caractérisation des poumons MSC et clones <ol><li> Culture et l&#39;expansion de la population des poumons MSC mixtes et des clones de cellules unique à la suite de tri est identique en utilisant les conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 et de l&#39;humidité&gt; 95%). Les cellules sont admises à adhérer l&#39;isolement pendant 16 heures suivantes. Media est remplacé toutes les 48 heures (α-MEM additionné de SVF 20%). Quand les cellules commencent à proliférer plus rapidement et atteindre entre 75-80% de confluence sont repiquées (figure 2). </li><li> Les cellules sont rincées avec HBSS préchauffée et incubées avec 0,5% de trypsine / EDTA (Cellgro, Manassas, en Virginie, cat # 25-053-Cl) à 37 ° C pendant moins de 2 min. Les cellules sont surveillées en utilisant un champ inversé pour confirmer l&#39;apparition d&#39;une suspension cellulaire. </li><li> Lung MSC sont ensuite divisées au ratio de 1:2 ou 1:3 en fonction du taux de prolifération actuelle de la culture. </li><li> La capacité des poumons CSM à se différencier en lignées mésenchymateuses traditionnelle des ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes et de leur expression à la surface des cellules mésenchymateuses du acceptées marqueurs is évaluée pour chaque préparation cellulaire. L&#39;analyse cytogénétique de bandes est également effectuée pour confirmer l&#39;absence d&#39;anomalies chromosomiques 2,3,8-11 brute. </li></ol> 6. Énumération des MSC pulmonaires en utilisant un dosage formant colonies (UFC-F) <ol><li> Diluer les cellules dans un milieu de MesenCult complet (Stem Cell Technologies, Vancouver, C.-B.) à une concentration finale de 1x10 6 cellules / ml. </li><li> Effectuer des dilutions en série pour obtenir des concentrations finales dans un plat de 100mm de 6x10 4 cellules, 3x10 4 cellules, 1,5 x10 4 cellules et 0,75 x10 4 cellules dans 10 ml de médias. Les analyses sont effectuées en triple double ou pour chaque concentration de cellules et peut être adapté pour les petites surfaces. </li><li> Cellules en culture pendant 10 jours dans des conditions standard. Le jour 10 cellules sont rincées avec du PBS et fixées avec du méthanol à 100% pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Détecter les colonies CFU-F par coloration avec 0,4% p / v de solution de coloration de Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluée 1:20 avec de l&#39;eau déminéralisée. Laisser les échantillons sécher à l&#39;air et de quantifier le nombre de colonies contenant plus de 25 cellules par colonie (Figure 3). </li></ol> 7. L&#39;analyse des propriétés immunomodulatrices des CSM sur les poumons des cellules T-prolifération et l&#39;apoptose <ol><li> 6.25x10 4 cellules par puits MSC pulmonaires sont étalées dans des plaques 96 puits et on laisse reposer deux pendant la nuit. </li><li> Cellules CD4 + à partir de rates de récepteur des cellules T (TCR) de souris transgéniques, l&#39;OT-II avec des cellules T qui reconnaissent l&#39;ovalbumine 323-339 peptide, sont purifiés par appauvrissant CD8 +, CD19 +, CMH-II + et CD25 + avec une trieuse de cellules Miltenyi Automacs (Miltenyi, Auburn, CA). Cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) sont isolés par tri positif du CMH-II + 12 cellules. </li><li> APC sont fixés dans du paraformaldéhyde 4%, lavé 3 fois en PBS / EDTA 5% BSA/2mM, et chargé avec 0.5μg/ml ou 5 ug / mL OVA323 peptide. </li><li> Simulés, la croissance arrêtée APC sont ajoutés à la MSC du poumon chez les plaques à 96 puits. </li><li> Plus de 95 CD4 + 1x10% pur 5 cellules sont marquées avec 5 um carboxyfluorescéine ester succinimidyle (CFSE; Sigma, St.Louis MO) dans du PBS et incubées pendant 5 min dans le noir, lavé avec du PBS-BSA 5%, et ensuite ajouté à la APC et les cellules du poumon chez MSC DMEM 5% FBS médias. Les cellules sont ensuite incubées pendant 96 heures. </li><li> Les cellules T sont ensuite colorées avec des anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) et analysés en utilisant un Miltenyi MacsQuant 7 cytomètre en flux de canal (Miltenyi, Aurburn, CA) et Flojo logiciel d&#39;analyse (Treestar, Ashland, OR). La prolifération est mesurée comme la diminution de l&#39;intensité moyenne de fluorescence CFSE par rapport à l&#39;arrière-plan, les cellules T étiquetés avec CFSE et non exposés à l&#39;APC (figure 4). T-cellules sont comptées à cette époque et la viabilité évaluée avec exclusion du bleu trypan. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: L&#39;analyse des flux Figure 1. Cytométrique et définition des MSC du poumon. Suspensions cellulaires simples de tissu pulmonaire digérer sont colorés avec Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux pour détecter des différences dans A. diffusion vers l&#39;avant (FSC) et le côté scatter (SSC) et B. Hoechst bleu et rouge de fluorescence. La présence d&#39;une population de côté (SP) est visible dans la porte. Le Hoechst faible SP est ensuite analysé pour séparer les C. CD45 négative de la population de MSC du poumon. Le CD45 positive à négative des ratios de cancer du poumon SP sont généralement 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Isolement et culture de MSC du poumon. Après la collecte du MSC poumon par tri cellulaire, les cellules sont étalées dans les plats de 30mm en utilisant α-MEM Supplémented avec du FBS à 20%. Une. Fraîchement cellules triées apparaissent petit, rond et lumineux. B. Après environ 2-3 semaines colonies avec un phénotype mésenchymateux devenu évident et la prolifération est plus évidente. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Dénombrement des MSC par Colony Forming-Assay fibroblastes. Pulmonaires élargi MSC sont plaquées par le protocole décrit pour le dosage de CFU-F. A. Après 10 jours et les colonies Giemsa sont évidents. Colonies B. sont grandes et composé d&#39;un quelques centaines de cellules. C. Les cellules présentent un phénotype mésenchymateux. A &amp; B, barre d&#39;échelle = 0,5 cm; barre d&#39;échelle C = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. CFSE dosage basé T prolifération cellulaire. En l&#39;absence de MSC pulmonaires et la présence de antigen cellules présentatrices d&#39;(APC) + / - ovalbumine (OVA) CD40 des cellules T effectrices positifs démontrent une diminution de l&#39;intensité CFSE qui indique la prolifération (cercle rouge). L&#39;intensité de fluorescence CFSE de la membrane des lymphocytes T diminue avec chaque stoechiométrique soit la division cellulaire. avec chaque division. En présence de cancer du poumon MSC, APC + / - OVA, le CD40 des cellules T effectrices positifs démontrent aucun changement significatif dans l&#39;intensité CFSE qui indique une absence de prolifération (cercle rouge).

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons adapté une méthode initialement utilisée pour identifier BM cellules hématopoïétiques à isoler une population spécifique de MSC poumon résident. En raison de la reproductibilité de l&#39;isolement de ces cellules ont ensuite été bien caractérisés comme MSC. Leur origine a été définie en tant que résident dans les poumons de souris adulte (par opposition aux dérivés BM) et un profil phénotypique et moléculaire documentée 2. La capacité d&#39;isoler plusieurs reprises cette population caractérisée permet une étude plus approfondie de l&#39;importance biologique et le rôle du CSM du poumon au cours homéostasie tissulaire et la maladie. La définition récente de cette population in vivo dans les tissus pulmonaires à la fois humain et murin facilite le développement d&#39;une stratégie thérapeutique visant à la rescousse des cellules endogènes pour faciliter la réparation du poumon au cours blessures et des maladies.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks solution saline tamponnée (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% de type 2 Worthington collagénase </td><td> Biochimiques Worthington </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Rouge tampon de lyse des globules </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 colorant </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> L&#39;iodure de propidium </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% de trypsine / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Medium MesenCult complète </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% p / v de solution de coloration de Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> Paraformaldéhyde à 4% </td><td> Services de microscopie électronique </td><td> 15710 </td><td> Paraformeldehyde 16% est dilué à 4% en utilisant PBS </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

Tissu cellules résidentes souches mésenchymateuses (CSM) sont des régulateurs importants de réparation ou de régénération tissulaire, la fibrose, l&#39;inflammation, l&#39;angiogenèse et la formation de tumeurs. Prises ensemble, ces études suggèrent que les MSC pulmonaires résidents jouent un rôle lors de l&#39;homéostasie tissulaire pulmonaire, une lésion et de réparation au cours des maladies comme la fibrose pulmonaire (PF) et l&#39;hypertension artérielle (HPA). Nous décrivons ici une technologie de définir une population de MSC poumon résident. La définition de cette population dans le tissu pulmonaire in vivo utilisant un ensemble de marqueurs définissent facilite l&#39;isolement répété d&#39;une population de cellules souches bien caractérisées par cytométrie en flux et l&#39;étude d&#39;un type cellulaire et la fonction spécifiques.

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Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Dans cet article, nous démontrons l&#39;isolement des souris des cellules pulmonaires souches résidentes mésenchymateuses (CSM poumons), leur expansion, la caractérisation et l&#39;analyse des propriétés immunomodulatrices.

Isolement et caractérisation de Hoechst Faible CD45 Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K vues.  University of Colorado Denver. Dans cet article, nous démontrons l'isolement des souris des cellules pulmonaires souches résidentes mésenchymateuses (CSM poumons), leur expansion, la caractérisation et l'analyse des propriétés immunomodulatrices.

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Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

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Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

L&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Analyse de Flux extracellulaire isolement, caractérisation et un débit élevé de souris primaire tubulaire les cellules épithéliales rénales

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques du coeur de souris adulte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...