Les auteurs remercient Katharina Schallmoser pour fournir pHPL, Eva Rohde et Nicole Hofmann pour les commentaires utiles pour le manuscrit, Daniela Thaler et Margaretha Fr hwirth d&#39;assistance technique, Monica Farrell pour révision linguistique, Uwe Lang, Margit Holzapfel et Sandra Eppich au Département d&#39;obstétrique pour fournir les cordes. Ce travail a été soutenu par l&#39;Austrian Research Foundation (FWF, accorder N211-NAN à la DS), l&#39;Agence autrichienne de promotion de la recherche (FFG, accorder N200 à DS) et par les cellules souches adultes de la Fondation de recherches (AR). AR est un membre de la Médecine Moléculaire programme de doctorat de l&#39;Université médicale de Graz.

Partie 1: Mise en place 1. Préparation du milieu de culture cellulaire Avant de commencer la préparation moyennes rassembler tous les matériaux et les outils dont vous aurez besoin. Dégel 2 x 56 ml de mise en commun des aliquotes lysat plaquettaire humain (pHPL, self-made: la référence 1 &amp; JoVE # 1523), 10 ml d&#39;une pénicilline 100x / solution de streptomycine, 2 x 5 ml de L-glutamine (Sigma fois). Décongeler les cytokines et les aliquotes facteur de croissance vasculaire (VEGF, bFGF, l&#39;EGF, l&#39;IGF, l&#39;hydrocortisone, l&#39;acide ascorbique, l&#39;héparine, à condition que l&#39;amphotéricine &#39;quots unique ») ajusté pour compléter 1 bouteille (500 ml) de l&#39;AGE-2 moyennes (Lonza). Du réfrigérateur prendre une bouteille de 500 ml chacune des (i) l&#39;alpha-modifiés milieu essentiel minimal (MEM a-) et (ii) moyenne endothéliales basale (EBM). Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire de culture de tissus dans des conditions stériles. Préparer l&#39;héparine sans conservateur (par exemple, Biochrom) en dissolvant la poudre à une concentration finale de 1000 UI / mL avec de l&#39;eau stérile. MSC-Medium: Utiliser 500 mL d&#39;une MEM-, ajoutez 56 ml d&#39;décongelés pHPL (voir aussi la référence 1 pour plus de détails) et 2 UI / ml (= 224 pi de solution de stock) de l&#39;héparine sans conservateur (évite la coagulation du milieu par l&#39;agglutination des le fibrinogène dans le plasma) pour atteindre une concentration finale de 10% pHPL. De plus ajoutez la pénicilline (100U/mL) / streptomycine (100μg/mL) solution et 2mM de L-glutamine (Sigma fois). Filtrer le support grâce à un 20-um des pores du filtre à vide de taille (Millipore). Étiquette de la bouteille de façon appropriée (contenu, date). ECFC-Medium: Utilisez une bouteille (500 ml) de l&#39;EBM, ajouter les parties aliquotes de cytokine, 56 ml de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl de solution mère) de l&#39;héparine sans conservateur, la pénicilline (100U/mL) / streptomycine (100 g / ml) de solution et 2mm de la L-glutamine au milieu de base et le filtre avec un 20 ul-pores sous vide taille du filtre (Millipore). Étiquette de la bouteille de façon appropriée (contenu, date). 2. Stérilisation des instruments chirurgicaux Pince, paire de ciseaux chirurgicaux et détenteur de bistouri doit être la chaleur de minerai jetables stérilisés stérile. 3. Préparation des tubes de collecte de cordon Ajouter 500 UI de conservateur - sans héparine à 50 tubes en polypropylène ml (Falcon) et ajuster à un volume final de 20 ml avec du PBS. Transférer les tubes dans la salle d&#39;accouchement. 4. Le consentement éclairé (confirmé par votre comité d&#39;éthique local ou IRB). Demandez aux parents avant la livraison s&#39;ils souhaitent faire don d&#39;un morceau de la corde et de les informer adéquatement sur les fins il servira. 5. Don de moelle Après la livraison et l&#39;inspection du placenta et le cordon coupé un morceau de 10 cm et immédiatement le transférer sur votre tube de pré-remplie avec de l&#39;héparine pour éviter la coagulation du sang restant à l&#39;intérieur des vaisseaux du cordon. Continuer sur l&#39;isolement cellulaire dès que possible. Partie 2: Isolement cellulaire <ol><li> Préparer un écoulement laminaire de culture de tissus capuche en nettoyant les surfaces avec Incidin ou 70% EtOH. Placez stériles de 150 cm 2 plaques de culture cellulaire, 75 flacons de culture cellulaire cm (deux Corning), PBS, des instruments chirurgicaux stérilisés, grattoirs cellulaire, porte-tube, 25 ml et stripettes seringues de 5 ml muni d&#39;aiguilles extrémité émoussée appropriée dans votre hotte nettoyé. </li><li> Pré-chauffer votre prêt α-MEM et EGM-2 milieu de culture cellulaire à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Porter le cordon d&#39;alimentation de la salle d&#39;accouchement à votre laboratoire équipé de la hotte de culture cellulaire. Après le transfert du cordon dans l&#39;écoulement laminaire le laver deux fois dans du PBS (en transférant à une nouvelle plaque) pour se débarrasser de contaminer les cellules sanguines. Rincer la veine ombilicale après canulating sur un côté avec une seringue stérile de 5 ml équipée d&#39;une aiguille extrémité émoussée avec PBS jusqu&#39;à ce que le fluide sortant de l&#39;autre bout de la corde devient complètement transparente (rougeâtre indique une contamination du sang). </li></ol> CPEF: <ol start="4"><li> Préparer un flacon de 75 cm2 (Corning), l&#39;étiqueter et remplissez 15-20 ml de pré-chauffé EGM-2 moyennes. </li><li> Placer le cordon dans une assiette remplie de nouvelles PBS stérile. Prenez les ciseaux chirurgicaux et couper le cordon ombilical en deux morceaux d&#39;environ 5 cm de longueur (courtes pièces sont plus faciles à traiter, parce que les vaisseaux ombilicaux sont tordus sur leur axe). </li><li> Essayez de trouver la veine ombilicale (grand récipient), insérer une lame de votre ciseaux chirurgicaux et couper la veine longitudinalement. À ce point il pourrait être utile si un assistant peut tenir la veine déjà réduit par deux pinces pendant que vous découpez supplémentaires. </li><li> Placer la tarte cordonCE avec la veine coupée dans une nouvelle plaque sans PBS, prendre le grattoir à cellules et gratter de l&#39;intérieur (endothélium) de surface de la veine ombilicale par frottages d&#39;un bout à l&#39;autre. Transférer les cellules de votre flacon préparé par le nettoyage de la pointe de la raclette dans le milieu. Répétez cette procédure au moins 10 fois. </li><li> Fermez votre flacon et le mettre dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO 2, 95% d&#39;humidité). </li></ol> MSC: <ol start="4"><li> Préparer une plaque de 150 cm 2 de culture (Corning) et l&#39;étiquette. </li><li> Prenez le morceau de cordon (après grattage de la couche endothéliale) et couper le cordon tout en très petits morceaux en utilisant des ciseaux stériles et scalpel stérile. La taille maximale des pièces cordon devrait être de 1-2 mm. </li><li> Transférez vos morceaux cordon avec la pince stérile dans votre assiette de la culture pré-étiquetés. En laissant ouverte la plaque pendant 5 minutes avant de remplir avec le milieu, l&#39;attachement des pièces à la surface du plastique est renforcée. </li><li> Une fois les morceaux de cordon sont connectés de façon appropriée à la matière plastique, ajouter doucement dans les 30 à 35 ml de la pré-alpha réchauffé modifiés MEM. Essayez d&#39;utiliser la vitesse la plus basse pour être sûr que tous les morceaux restent attachés. </li><li> Refermez la plaque et le mettre dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO 2, 95% d&#39;humidité). </li></ol> Partie 3: l&#39;expansion des cellules immunitaires et la confirmation de phénotype par cytométrie en flux L&#39;expansion des cellules EFCFs: <ol><li> Vérifier la fixation des cellules endothéliales, le lendemain sur un microscope inversé et d&#39;échanger ensemble EGM-2 moyennes pour se débarrasser de toutes les cellules non-inscrits et les particules. </li><li> Développer les cellules jusqu&#39;à confluence et l&#39;échange d&#39;un tiers des moyennes deux fois par semaine. Lorsque la confluence est atteinte, détacher les cellules avec 0,05% Trypsin/0.7 mM d&#39;EDTA et de les transférer à des navires nouvelle culture. Selon le nombre de cellules dans votre flacon T75, vous devez choisir la taille et le nombre de vos nouveaux flacons pour garantir la densité de semis faible pour poursuivre son expansion. </li><li> Bourse un tiers de la moyenne deux fois par semaine pendant l&#39;expansion des cellules. </li></ol> MSC: <ol><li> L&#39;excroissance de cellules souches mésenchymateuses de la moelle prendra plus de temps, vous pouvez donc attendre au moins 3-4 jours jusqu&#39;à ce que vous vérifiez sur un microscope inversé à l&#39;apparition de cellules fusiformes dans les environs des morceaux de tissu attaché. Quand il ya suffisamment de cellules hors de croissance, les morceaux ont tendance à se détacher, car ils perdent le contact avec le plastique. </li><li> Après 10-12 jours enlever les morceaux de tissu, détachez les MSC de la matière plastique avec 0,05% Trypsin/0.7 mM d&#39;EDTA et de les transférer à des navires nouvelle culture. Selon la quantité de cellules dans votre assiette, vous devez décider de la taille et le nombre de vos nouveaux flacons pour garantir la densité de semis faible pour poursuivre son expansion. </li><li> Bourse un tiers de la moyenne deux fois par semaine pendant l&#39;expansion des cellules. </li></ol> La cytométrie en flux Équipement nécessaire: Cytomètre en flux (BD FACSCalibur), microniques tubes (Corning), porte-tube, moutons sérum (réactif de blocage), Eppifuge (Eppendorf), les anticorps monoclonaux MSC: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, les contrôles isotype CPEF: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, les contrôles isotype <ol><li> Après avoir atteint la confluence, détachez la cellule avec 0,05% Trypsin/0.7 mM d&#39;EDTA et centrifuger à 300g pendant 7 min à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration de 1x10 6 cellules / ml dans PBS modifiés et contraignant bloc d&#39;anticorps non spécifiques avec 10% v / v de sérum de moutons pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Etiqueter les tubes microniques et ajouter la concentration appropriée de fluorescence des anticorps marqués. </li><li> Ajouter 50 ul de suspension cellulaire (bloqué) à chaque tube et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules modifiées par l&#39;ajout du PBS pour éliminer les anticorps non contraignant. </li><li> Allez avec votre cellulaire étiquetés pour le cytomètre de flux et d&#39;effectuer l&#39;analyse. </li></ol> Partie 4: ECFC croissance de la colonie, la fixation, coloration et analyse la hiérarchie <ol><li> Graines du CPEF pratiquement pure récoltés à densité de placage très faible de 3 ou 10 cellules par centimètre carré de plaques de culture cellulaire pour permettre la croissance seule colonie. </li><li> Bourse un tiers de la moyenne deux fois par semaine. </li><li> Après 14 jours (fin de la culture) éliminer le milieu, se laver deux fois avec du PBS et fixer les colonies avec une solution de fixation de la glace froide (acétone: méthanol = 3: 2) pendant 15 minutes au réfrigérateur. </li><li> Jeter la solution de fixation et de laisser les plaques ouvert à sécher pendant 10 minutes. </li><li> Réhydrater les cellules avec de l&#39;eau distillée pendant 10 minutes. </li><li> Ajouter Harris solution d&#39;hématoxyline et tacher les colonies fixes pendant 12 minutes. </li><li> Retirer H matoxylin solution et rincer les plaques avec de l&#39;eau du robinet pour se débarrasser de la solution de coloration restant. </li><li> Prenez des photos de chaque colonie par desl&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope et d&#39;importation *. jpg ou *. tif fichiers sur votre ordinateur. </li><li> Ouvrez les photos avec le logiciel ImageJ et d&#39;analyser le nombre de cellules précises de chaque colonie comme décrit dans l&#39;animation. </li><li> Ouvrez le logiciel ImageJ et importer une image de colonies en utilisant le menu «Fichier \ Ouvrir&quot; fonction dans le menu déroulant. </li><li> Procédez en utilisant le «Processus \ Contexte Soustraire« fonction </li><li> Utilisez la fonction «sélection * * elliptiques ou une brosse» dans le menu de ImageJ pour marquer la marge colonie. </li><li> Effacer l&#39;image environnante à l&#39;aide &quot;Modifier \ extérieur Clear &#39;fonction et recadrer l&#39;image en sélectionnant« Crop Image \&#39;. </li><li> Ajustez le seuil manuellement en utilisant le &quot;Image \ Réglage Seuil \ &#39;fonction, de sorte que toutes les cellules sont complètement colorés en rouge. </li><li> Comptez le nombre de cellules de la colonie en sélectionnant «Analyser \ analyser des particules». Choisissez les paramètres appropriés (optimisé pour chaque type de cellule) et sélectionnez «OK». La boîte de résultats, y compris le nombre de cellules et une nouvelle image contenant les grandes lignes correspondantes des cellules compté apparaîtra. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="Figure 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont pas de conflits d&#39;intérêts financiers à déclarer.

Il ya une variété de sources à partir duquel obtenir MSCS ou CPEF notamment la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang de cordon, etc Il est nécessaire d&#39;obtenir deux types de progéniteurs de la même source de comparer directement l&#39;implication des différents types de cellules dans des procédés tels tissus et la régénération des navires ou de contribution à la progression tumorale. La facilité avec laquelle d&#39;isoler et d&#39;étudier l...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>alpha modified MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-GLutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EBM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single cytokine quots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75 cm2 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 cm2 plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell scraper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin/EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoclonal antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL filter 20 &mu;m pore size </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Preservative free heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

Le cordon ombilical est une source riche pour les cellules progénitrices avec un potentiel prolifératif élevé, y compris les cellules stromales mésenchymateuses (appelé aussi les cellules souches mésenchymateuses, cellules souches mésenchymateuses) et des cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF). Les deux types de cellules sont des acteurs clés dans le maintien de l&#39;intégrité des tissus et sont probablement également impliqués dans les processus de régénération et de la formation de tumeurs. Pour étudier leur biologie et leur fonction de manière comparative, il est important d&#39;avoir les deux types de cellules disponibles à partir du même donneur. Il peut également être bénéfique à des fins de régénération pour dériver MSC et CPEF du même tissu. Parce thérapies cellulaires devrait finalement trouver leur chemin à partir du laboratoire au chevet, nous avons établi une nouvelle méthode pour isoler et d&#39;élargir les cellules progénitrices sans l&#39;utilisation de protéines animales. Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) a remplacé le sérum fœtal bovin dans toutes les étapes de notre protocole d&#39;éviter complètement de contact des cellules aux protéines xénogéniques. Cette vidéo montre une méthode pour l&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules souches d&#39;un cordon ombilical. Tous les matériaux et les procédures seront décrites.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Ce protocole décrit l&#39;isolement et à l&#39;expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l&#39;utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.3K vues.  Medical University of Graz, Austria. Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Vidéo: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Recherche

Biologie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

L&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules de rat souches mésenchymateuses (CSM) et de séparation des mono-colonie Dérivé MSC

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

L&#39;isolement de l&#39;homme de l&#39;artère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...