Les auteurs tiennent à remercier Julia Hatler et Martin Ramsden (R &amp; D Systems) pour une discussion utile et évaluation des manuscrits.

Une. L&#39;induction de l&#39;EMT <ol><li> Des milieux de culture chaud à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Le milieu de culture utilisé est le même que les supports utilisés pour la culture standard de vos cellules d&#39;intérêt. Par exemple, la ligne de poumon de cellules de carcinome humain A549 est cultivé en F12 de Kaighn supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et de la glutamine 2 mM. </li><li> Récolte de cellules d&#39;intérêt en utilisant une solution de dissociation (par exemple TrypLE Express). </li><li> Suspendre les cellules dans un milieu de culture préchauffé dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 400 xg pendant 5 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant en le versant dans un conteneur à déchets. </li><li> Suspendre le culot cellulaire dans un milieu de culture préchauffé. </li><li> Compter les cellules viables à l&#39;aide au bleu Trypan. Suppression d&#39;un échantillon de la suspension cellulaire et diluer dans 0,4% solution bleu Trypan. Placer 10 ml de l&#39;échantillon dilué sur un hémocytomètre et compter les cellules viables (cellules qui ne se transforment pas en bleu). Utilisez le nombre de cellules pour déterminer la cellule densité dans votre solution. </li><li> cellules de plaque sur la culture de tissus traités plaques ou flacons de 0,9 à 1,0 x 10 4 cellules par cm 2. Par exemple, 0,5 x 10 6 cellules étalées dans une plaque de 100 mm dans des milieux de culture contenant 1X Supplément EMT induisant Media (6 ml de milieu par plaque de 100 mm). </li><li> Cellules plaqué Culture dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 °. Surveillance de la morphologie des cellules quotidien. </li><li> Trois jours après l&#39;étalement, retirer le support et la remplacer par un milieu de culture préchauffé frais contenant Supplément 1X EMT induisant des médias. Continuer de culture dans un rapport C / 5% de CO 2 incubateur à 37 °. </li><li> Cinq jours après l&#39;étalement, les cellules sont prêtes pour l&#39;analyse. La morphologie cellulaire est visualisé par microscopie optique inversé. </li></ol> 2. Analyse de l&#39;expression des protéines par immunocytochimie <ol><li> Préparer des lamelles stériles de 12 mm pour une plaque de 24 puits en plaçant des lamelles dans une boîte de Pétri contenant 95% d&#39;éthanol. Retirez délicatement les lamelles dans de l&#39;éthanol nousment une aiguille et pince courbe et flamme stériliser. Placez lamelle stérile dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits. Répéter l&#39;opération avec les lamelles restantes. </li><li> Préparer la suspension cellulaire comme décrit dans la section 1.1 à 1.7. </li><li> Plate 1,6 x 10 4 cellules / puits dans 0,5 ml de milieu de culture préchauffé contenant Supplément 1X EMT induisant des médias. </li><li> Développer et nourrir les cellules comme décrit dans les sections 1.9 à 1.11. </li><li> Cinq jours après l&#39;étalement, retirer le support et fixer les cellules avec 300 pl / puits de 4% de paraformaldéhyde dans 1X tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Retirer fixateur et rincer les cellules 2x avec du PBS 1X, 500 pl / puits. </li><li> Incuber les cellules dans 400 ul / puits de tampon de blocage (PBS 1X contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), 10% de sérum d&#39;âne normal, et 0,3% de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps primaire aux fabricants recommandé concentration dans 400 pl / puits de tampon de blocage pendant 3 heures à la salle température ou une nuit à 4 ° C. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un anticorps primaire directement conjugué à un fluorochrome, incuber les échantillons à l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules trois fois dans 500 pl / puits de PBS 1X contenant 0,1% de BSA pendant 5 minutes à chaque lavage. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un anticorps primaire directement conjugué à un fluorochrome, passez directement à l&#39;étape 2.12. </li><li> Incuber les cellules à un anticorps secondaire à la concentration recommandée par le fabricant dans 400 pl / puits de PBS 1X contenant 1% de BSA pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules trois fois dans 500 pl / puits de PBS 1X contenant 0,1% de BSA pendant 5 minutes à chaque lavage. </li><li> Si vous le souhaitez, les noyaux avec DAPI contre-colorer. </li><li> Rincer les cellules dans de l&#39;eau déminéralisée et de montage des lamelles face vers le bas sur une lame en utilisant les médias de montage. </li></ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc. est une société publique à but lucratif. La production et le libre accès à cet article est parrainé par R &amp; D Systems, Inc.

Les méthodes précédentes pour EMT induction ont généralement utilisé stimulation TGF-β ou de la modification génétique. Bien que le TGF-β seul a été représenté pour induire EMT dans certains types cellulaires, il a maintenant été démontré que le TGF-β est nécessaire pour EMT, mais elle n&#39;est pas suffisante dans tous les types cellulaires 6,14. Utilisation de la modification génétique pour EMT induction prend du temps et de main-d&#39;œuvre. La méthode décrite ici utilise une combinaison de facteurs, y compris, la E-cadhérine anti-humain, sFRP-1 anti-humain, DKK-1 anti-humain, Wnt-5a humaine recombinante, et TGF-β1 humain recombinant pour induire de manière fiable EMT. Cette combinaison de facteurs est conçu pour bloquer l&#39;adhésion sur la base E-cadhérine, une étape cruciale pour EMT induction 4, et d&#39;améliorer la signalisation Wnt en ajoutant la protéine Wnt-5a ainsi que l&#39;utilisation des anticorps bloquant les inhibiteurs de Wnt, sFRP-1 et Dkk -1. Wnt et la signalisation du TGF-β se sont révélés agir dans une boucle autocrine pour induire et maintenir la stat des cellules mésenchymateusese 6. Cette méthode permet d&#39;éviter l&#39;induction d&#39;une manipulation génétique et est plus efficace que d&#39;utiliser le TGF-β seuls. Fait important, nous sommes en mesure d&#39;observer l&#39;induction de l&#39;EMT dans des types cellulaires, y compris les cellules MCF7 et des cellules PANC-1, qui ont été précédemment montré non seulement de répondre à la stimulation de TGF-β (figure 5) 14. Les cellules traitées avec le Supplément spectacle EMT induisant Media morphologie fusiforme moins compact et augmenté (figure 1). En outre, il existe une diminution de l&#39;expression de surface E-cadhérine concurrente avec une augmentation de l&#39;expression de la fibronectine, qui sont caractéristiques d&#39;EMT (figures 2 et 3). Marqueurs mésenchymateuses supplémentaires tels que des escargots et vimentine sont également régulés à la hausse dans les cellules induites EMT que par rapport aux témoins non induites (figure 4). Migration et l&#39;invasion des capacités accrus sont les principales caractéristiques fonctionnelles des cellules mésenchymateuses. Dans in vitro </em&gt; Migration et l&#39;invasion des essais, les cellules traitées avec le supplément EMT induisant médias ont démontré une capacité accrue de manière significative à migrer et envahir (Figure 6). Cette méthode simple pour EMT induction est utile pour l&#39;étude de la signalisation EMT comme démontré à l&#39;aide des données d&#39;expression de matrice d&#39;anticorps présentés dans la figure 7. Différents types de cellules peuvent être comparées pré-et post-EMT induction pour obtenir les signatures d&#39;expression communs associés à EMT, comme l&#39;augmentation de la CREB phosphorylée et ERK1 / 2 vu dans les deux cellules MCF7 et induit EMT-A549. S133 phosphorylation de CREB et stimule la liaison de l&#39;ADN a été montré à agir en aval de TGF-β1 induit par EMT-15. ERK1 / 2 phosphorylation a également été montré à agir en aval de TGF-β1 induit par EMT-16. Les différences dans les voies de signalisation entre les différents types de cellules peuvent aussi être élucidées comme on le voit avec l&#39;augmentation de la GSK-3β phosphorylation dans les cellules A549 par rapport p70S6K phosphorylation in MCF7. GSK-3β phosphorylation sur la serine 9 diminue elle fonction, et GSK-3β a été montré pour inhiber le facteur de transcription pro-EMT, Snail 17. En revanche, p70S6K induit une activité d&#39;escargot et sa phosphorylation est associée à l&#39;activation de cette protéine 18. Dans l&#39;ensemble, l&#39;induction simple et fiable de EMT, en particulier dans les cellules précédemment indiquées ne pas répondre uniquement à TGF-β, est utile pour comprendre la biologie des EMT, l&#39;identification des signatures d&#39;expression communs pour une utilisation en tant que marqueurs pronostiques, et le développement et l&#39;évaluation de nouveaux traitements pour le cancer et les maladies fibrotiques.

Épithéliales de transition mésenchymateuses (EMT) est le processus par lequel une cellule épithéliale polarisée subit une série de changements résultant dans une cellule très mobiles fibroblaste mésenchymateuses. Ce processus se produit, en partie, par des changements d&#39;expression génique et de la dégradation des jonctions adhérentes, ce qui entraîne une plus grande capacité à migrer et à envahir. Physiologiquement, EMT joue un rôle important au cours du développement embryonnaire et la cicatrisation des plaies. Perte de contrôle adéquat sur ​​EMT peut conduire à la fibrose et les métastases des cancers 1,2. La réduction de la E-cadhérine à la surface des cellules épithéliales est une étape critique dans la progression d&#39;une cellule dans EMT 3,4. La E-cadhérine est une protéine transmembranaire à passage unique qui interagit directement avec les protéines de cadhérine sur les cellules adjacentes. En plus de son rôle dans l&#39;adhésion cellulaire, la E-cadhérine influences de signalisation cellulaire par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions entre la queue cytoplasmique de la E-cadhérine unda variété de protéines régulatrices, notamment β-caténine. β-caténine joue un rôle dans la stabilisation des jonctions adhérentes. Au cours de la signalisation Wnt canonique, β-caténine est libéré de la E-cadhérine et de translocation vers le noyau où elle agit comme un facteur de transcription en aval dans la voie Wnt 3,4,5. Dans le noyau, β-caténine a été démontré que l&#39;augmentation de la transcription de plusieurs facteurs liés à l&#39;EMT-torsion notamment, Slug, la fibronectine, et une variété de métalloprotéases matricielles 3,6. En plus de Wnt, la signalisation du TGF-β a été montré à jouer un rôle important dans l&#39;induction EMT fois au cours du développement normal et dans les Etats malades 7,8,9. TGF-β est impliqué dans l&#39;EMT qui se produit pendant la formation du voile du palais et dans le cœur en développement 10. Il a également été impliquée dans la fibrose et à la progression du cancer à métastases 7. La procédure décrite ici provides induction uniforme des EMT dans une variété de types de cellules, sans la nécessité d&#39;une manipulation génétique. Cette procédure utilise un cocktail de la E-cadhérine, sFRP-1, et Dkk-1 anticorps bloquants et Wnt-5a et protéines recombinantes TGF-β1. Ce cocktail est conçu pour bloquer E-cadhérine sur la base d&#39;adhérence tout en améliorant Wnt et la signalisation du TGF-β. La capacité de robuste EMT induction est essentiel pour la compréhension de la biologie de ce processus et comment le manipuler à des fins thérapeutiques. Marqueurs communs actuels de EMT, la E-cadhérine (downregulated dans EMT) et la vimentine (régulés à la hausse dans EMT), peuvent être trouvés co-exprimé dans les cancers et donc ne fournissent pas les meilleurs marqueurs de diagnostic de cellules métastatiques potentiels 12. Fait important, l&#39;analyse d&#39;une variété de types de cellules qui ont subi EMT est utile de développer des signatures d&#39;expression des gènes communs qui peuvent être utilisés à des fins diagnostiques dans le cancer et la fibrose 11. En outre, des études récentes ont démontré que EMT peut jouer un rôle dans la formation des cellules souches cancéreuses, ce qui suggère que les cellules qui ont subi EMT peuvent être utiles pour le criblage de médicaments pour identifier des composés qui peuvent cibler ces cellules 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Épithéliales de transition mésenchymateuses (EMT) est essentiel pour la morphogenèse correcte au cours du développement. Une mauvaise régulation de ce processus a été impliqué comme un événement clé dans la fibrose et la progression des cancers à un état métastatique. Comprendre les processus qui sous-tendent EMT est impératif pour le diagnostic précoce et le contrôle clinique de ces états pathologiques. Fiable induction de EMT in vitro est un outil utile pour la découverte de médicaments, ainsi que d&#39;identifier des signatures d&#39;expression génique communes à des fins de diagnostic. Ici, nous démontrons une méthode simple pour l&#39;induction de l&#39;EMT dans une variété de types de cellules. Méthodes d&#39;analyse de cellules pré-et post-EMT induction par immunocytochimie sont également inclus. En outre, nous démontrons l&#39;efficacité de cette méthode à travers l&#39;analyse de réseau à base d&#39;anticorps et des essais de migration / invasion.

. L&#39;EMT induisant des conditions de culture décrites ici fournissent une méthode robuste pour l&#39;induction de l&#39;EMT dans une variété de types de cellules figures 1 et 2 montrent la morphologie et les niveaux d&#39;expression de marqueur de 4 lignes cellulaires humaines: cellules de glioblastome T98G, des cellules HT29 d&#39;adénocarcinome du côlon , des cellules de carcinome du poumon A549 et MCF10A cellules épithéliales mammaires. Les cellules qui ont été traités avec le supplément EMT induisant médias ont changé de morphologie classique épithéliale (Figures 1A - 1D) à un mésenchymateuses, morphologie fusiforme (figures 1E - 1H). Cellules EMT-induites sont apparus moins dense en colonies serrées par rapport aux cellules non induites. Échantillons non induit MCF10A contenues grappes serrées entourées par des cellules plus tassées. Ces grappes serrées étaient la E-cadhérine positif (figure 2D) et ont disparu lors d&#39;un traitement avec l&#39;EMT induisant médias Supplement (figure 2H). EMT a également été évaluée par la régulation négative de marqueurs épithéliaux et la régulation positive des marqueurs mésenchymateuses. La régulation à la baisse de l&#39;expression de la E-cadhérine est typiquement observée après EMT induction dans des types 3,4 cellulaires différentes La figure 2 montre l&#39;expression de surface de la E-cadhérine dans la majorité des cellules non traitées (figures 2A - 2D; rouge). Par rapport à son absence, après induction EMT (figures 2E - 2H, rouge). Une lignée cellulaire, T98G, s&#39;est révélé avoir un très faible niveau de base de la E-cadhérine avant EMT induction, ce qui a empêché son analyse. La régulation positive du marqueur mésenchymateuses, fibronectine, est également visible après induction avec le supplément EMT induisant Media (Figures 2A - 2D par rapport figures 2E - 2H; vert). Les niveaux de la E-cadhérine et la fibronectine expression vus par immunocytochimieont en outre été confirmée par Western blot de lysats de cellules totales (Figure 3). Le western blot a confirmé la régulation négative de la E-cadhérine et de la régulation positive de l&#39;expression de la fibronectine vu par immunocytochimie. Les bandes ont été quantifiés par densitométrie et normalisée de GAPDH à déterminer par rapport facteur de variation suivant EMT induction. Niveaux E-cadhérine ont été réduits de 6,4 et 3,4 fois en A549 et les cellules MCF10A, respectivement. niveaux de la fibronectine ont été augmenté de 4,6, 4,1, et 2,3 fois dans T98G, A549, et les cellules MCF10A, respectivement. Bien que le transfert de western ne montre pas de réduction significative des niveaux de protéine E-cadhérine dans les cellules HT29 à induction post-EMT, les résultats d&#39;immunocytochimie démontrent une réduction de l&#39;expression de surface de la E-cadhérine (Figure 2B par rapport à 2F), qui est incapable de se distinguer en Western blot de lysats de cellules totales. Pour mieux évaluer l&#39;état de EMT, marqueur connue supplémentairess pour EMT ont été analysés avant et après-EMT induction. En accord avec les résultats précédents, la E-cadhérine a été régulée à la baisse dans toutes les lignées cellulaires examinées, ce qui indique que EMT a été induite. En outre, les marqueurs mésenchymateuses, vimentine et escargot, ont été régulés à la hausse dans A549, T98G, et les cellules MCF10A après un traitement avec supplément EMT induisant Media (Figure 4). La lignée cellulaire HT29 n&#39;a pas montré d&#39;expression de ces marqueurs mésenchymateuses, avec ou sans induction EMT (données non présentées), ce qui pourrait indiquer que ces cellules utilisent des voies alternatives pour EMT induction. Bien que le TGF-β est suffisante pour induire EMT dans certains contextes 7,8,9 cellule, d&#39;autres types de cellules ne répondent pas à la seule addition de TGF-β 14. MCF7 cellules de cancer du sein humaines PANC-1 et des cellules de carcinome pancréatique humain sont tous deux signalés ne pas répondre à la signalisation du TGF-14 seul β. Pour déterminer si les deux lignes pourraient subir EMT dans vitro, les cellules ont été cultivées en présence du supplément EMT induisant des médias. Les cellules ont été stimulées avec du TGF-β1 recombinant seul, à la concentration dans le supplément EMT induisant des médias. Ces cellules conservent leur morphologie épithéliale, composée de colonies serrées de cellules (données non présentées) et les niveaux E-cadhérine surface ont été similaires à ceux observés dans les cellules témoins (figures 5C et 5D contre les figures 5A et 5B). En revanche, les cellules stimulées par le supplément EMT induisant médias ont montré une diminution drastique des niveaux E-cadhérine surface (figures 5E et 5F). Ces cellules ont également obtenu une morphologie plus mésenchymateuses, les cellules sont devenues moins compact et plus broche-like (données non présentées). Ces résultats démontrent que la méthode EMT induire décrit ici est capable de promouvoir l&#39;expression EMT morphologie et des changements des marqueurs dans les cellules en général résistants à TGF-β-iEMT nduced. En plus des changements dans l&#39;expression des marqueurs, une autre caractéristique des cellules mésenchymateuses est leur capacité à migrer et envahir. Migration et l&#39;invasion des cellules cultivées avec ou sans le supplément EMT induisant des médias ont été analysées en utilisant le 96 et BME invasion cellulaire dosage selon les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits (50 000 cellules / puits) contenant des inserts de filtres avec 8,0 um pores. Après 48 h, la migration a été évaluée par calcéine AM coloration des cellules qui avaient migré à travers le filtre. Chaque échantillon a été testé en trois exemplaires deux fois avec des résultats similaires. Des résultats représentatifs de l&#39;une expérience sont présentés sur la figure 6A. Augmentation statistiquement significative (valeur p &lt;0,003) dans la migration cellulaire ont été observés avec les deux A549 et PANC-1 cellules après induction EMT. Pour évaluer la capacité de ces cellules à envahir (c.-à migrer à travers la matrice extracellulaire), le même essai a étéeffectuée avec un filtre de l&#39;extrait revêtu membrane basale. EMT-induite des cellules ont montré une (valeur P &lt;0,001) augmentation statistiquement significative des capacités d&#39;invasion par rapport aux cellules non traitées comme on le voit sur ​​la figure 6B. L&#39;induction robuste de EMT est utile pour l&#39;analyse des changements d&#39;expression des gènes et la signalisation qui ont lieu dans ces cellules. L&#39;analyse de la matrice à base d&#39;anticorps en utilisant des lysats de cellules à la fois traitées et non traitées est une méthode pour analyser les niveaux d&#39;une variété de molécules d&#39;expression dans un seul échantillon. A titre d&#39;exemple, nous avons analysé les niveaux de membres de la famille MAPK phosphorylée dans des lysats de non-induite et EMT induite cellules MCF7 et A549 en utilisant le kit de tableau du protéome humain Profiler Phospho-MAPK. La matrice a été exécutée deux fois à partir de traitements EMT-induction indépendantes avec des résultats similaires. Figure 7 montre les données représentatives d&#39;une matrice. Les deux types de cellules présentaient une augmentation de la phosphorylation de la protéine CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), et ERK2 (T185/Y187) dans des cellules EMT-induites comparées à des témoins. Les différences dans les événements de signalisation ont été observées entre les deux types cellulaires aussi bien. Les cellules A549 ont montré une augmentation de la GSK-3 β (S9) la phosphorylation, alors que les cellules MCF7 ont montré une augmentation p70S6K (T421/S424) phosphorylation. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figure 1. Mésenchymateuses morphologie induction après stimulation par le supplément EMT induisant Media (A - D). Morphologie épithéliale dans les types cellulaires quatre indiquée ci-dessous 5 jours de culture dans des milieux de culture standard sans supplément EMT induisant Media (E - H). Morphologie mésenchymateuses dans le quatre types de cellules indiqué cultivées avec le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. nt &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figure 2. La régulation négative de l&#39;expression du marqueur épithélial et la régulation positive de l&#39;expression du marqueur mésenchymateux dans des cellules EMT-induits. Cellules ont été colorées par immunofluorescence pour détecter l&#39;expression du marqueur épithélial, la E-cadhérine (rouge), et le marqueur mésenchymateux, la fibronectine (vert). (A - D) des cellules cultivées sans supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours de contrôle (E - H.) Les cellules cultivées avec le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. Toutes les cellules sont DAPI (bleu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Confirmation de l&#39;expression du marqueur épithélial et mésenchymateuses avec un Western blot<html> . alysis Western blot de lysats totaux de cellules de types cellulaires quatre indiqué, traité avec (EMT) ou sans (-) le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. Bandes pour la E-cadhérine, la fibronectine, et le contrôle GAPDH de chargement sont indiquées sur la gauche. Le marqueur de taille est indiquée sur la droite. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. La régulation positive des marqueurs mésenchymateux, la vimentine et Snail dans les cellules EMT-induits. Cellules ont été colorées par immunofluorescence multicolore pour détecter l&#39;expression du marqueur épithélial, la E-cadhérine (gris), et les marqueurs mésenchymateux, la vimentine (vert) et d&#39;escargot (rouge) Les cellules témoins cultivées sans le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. - (C A). (D - F) Les cellules cultivées avec le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. oujours &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figure 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figure 5. L&#39;induction de l&#39;EMT dans des cellules non sensibles au TGF-β1. (A et B) Les cellules cultivées avec le milieu seul pendant 5 jours. (C et D) Les cellules cultivées dans un milieu contenant 10 ng / ml de TGF-β1 pendant 5 jours. (E et F) les cellules cultivées en supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. Toutes les cellules sont colorées pour l&#39;expression E-cadhérine (rouge) et DAPI (bleu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Cellules induite EMT-ont augmenté les capacités de migration et d&#39;invasion. A. Nombre moyen de cellules qui ont migré à travers un filtre de pores de 8 pm après incubation pendant 48 heures. B. Effectif moyen decellules qui étaient capables d&#39;envahir à travers un filtre à pores de 8 um revêtue d&#39;un extrait de la membrane basale après une incubation de 48 h. Les barres d&#39;erreur indiquent l&#39;écart-type sur trois puits. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Base-Anticorps Figure 7. Tableau analyse de l&#39;expression des EMT induction. Lysats de A549 (A et C) et MCF7 (B et D) des cellules en culture avec ou sans supplément EMT induisant des médias ont été utilisés pour l&#39;analyse de réseau en utilisant le kit de tableau du protéome humain Profiler Phospho-MAPK. Spots mis en évidence dans A et B ont ensuite été quantifiés par densitométrie. Les comparaisons des lysats à EMT-induites non induits sont présentés dans les graphiques à barres correspondant ci-dessous (C et D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure &lt;</a>/ A&gt;.

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Une méthode simple est décrit pour l&#39;induction de la transition épithélio mésenchymateuse (EMT) dans une variété de types de cellules. Méthodes d&#39;analyse de cellules dans les Etats EMT par immunocytochimie sont inclus.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

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Research

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Biology

35.5K vues.  R&D Systems, Inc..  Une méthode simple est décrit pour l'induction de la transition épithélio mésenchymateuse (EMT) dans une variété de types de cellules. Méthodes d'analyse de cellules dans les Etats EMT par immunocytochimie sont inclus. 

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Test de transition clair / foncé pour souris

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Recherche

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipuler le murin Glande lacrymale

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...