Cette recherche a été financée par des subventions non. 0723341 (à KGL) de la National Science Foundation. Nous sommes également reconnaissants pour les contributions fournies par le Programme de bourses de recherche Schapiro premier cycle et au département de psychologie au Randolph-Macon College. Enfin, nous apprécions les contributions de collaboration Craig Kinsley dans cette recherche et d&#39;aider Amanda Rzucidlo dans la préparation du laboratoire de R-MC pour cet article la vidéo.

1. Identification du modèle animal <ol><li> La souris sylvestre Californie (Peromyscus californicus) est un modèle idéal pour explorer les réponses paternelle. Comme vous le voyez, cette souris palefreniers les chiots comme les mamans font - ils ont même s&#39;accroupir sur eux de sorte qu&#39;il ressemble à des chiots sont des soins infirmiers. Le comportement de la souris par rapport à la Californie est une espèce du même genre, la souris sylvestre commune (Peromyscus maniculatus) qui présente peu d&#39;intérêt pour les chiots, souvent essayant de s&#39;échapper, ou même les attaquer. (Voir Figure 1 pour des photos de ces espèces en interaction avec les chiots.) </li><li> Une fois le modèle des espèces a été identifié, puis les différents groupes doivent être établis. Dans cette étude, les pères biologiques, les vierges qui n&#39;ont aucune expérience parentale, et vierges avec l&#39;exposition des petits limitée (pup-exposées ou les pères d&#39;accueil) des deux espèces sont utilisées afin que les deux prédisposés et a acquis des caractéristiques paternelles peuvent être évalués. Dans cette étude particulière nous avons aussi tous les groupes exposés à une souris jouet chiot pour s&#39;assurer que les interactions sociales étaient spécifiques à un chiot et non une réponse à tout représentant placé dans la cage (voir Figure 2). </li><li> Avant d&#39;enquêter sur des facteurs neurobiologiques, il est important de confirmer que les espèces sélectionnées présentent de nettes différences dans le comportement de l&#39;intérêt. Dans cette étude, les mâles sont placés dans une cage avec un chiot pendant cinq minutes et un éthogramme comportement paternel (voir le tableau 1, par exemple des éthogramme) est utilisé pour marquer les comportements tels que la latence d&#39;approche du chiot et la quantité de temps passé en contact avec le chiot. Si des réactions agressives sont observées, le chiot est immédiatement supprimé. Ces sessions sont souvent filmées afin d&#39;une analyse minutieuse du comportement peut ensuite être réalisée. </li></ol> 2. Préparation des tissus du cerveau <ol><li> Après une perfusion standards de chaque souris (protocole ci-joint), les cerveaux sont prélevés afin qu&#39;ils puissent être sectionné dans le domaine d&#39;intérêt spécifique (cerveau spectacle). </li><li> Une norme de cerveau de souris atlas (montrer atlas) est utilisé pour localiser le noyau paraventriculaire de l&#39;hypothalamus, une région connue pour être riche en cellules produisant le neuropeptide d&#39;intérêt dans cette étude - vasopressine (AVP). </li><li> Le cerveau est alors bloqué et monté sur un mandrin de congélation de sorte que le tissu se fige avant d&#39;être sectionné avec le microtome. Le cerveau est sectionnée dans un mode de garniture jusqu&#39;au repère spécifiques sont identifiés, puis l&#39;épaisseur spécifique du cerveau, de 30 microns dans ce cas, est prévue pour les sections du cerveau utilisées pour l&#39;analyse. </li><li> Les sections du cerveau sont soigneusement placés dans des assiettes bien remplies avec un tampon phosphate salin (PBS); (protocole d&#39;attachés PBS, s&#39;il vous plaît noter que ce n&#39;est qu&#39;un exemple d&#39;un protocole immunocytochimie standard). </li></ol> 3. Immunocytochimie <ol><li> Tout au long des différentes étapes de ce processus (voir le protocole ci-joint), il est important d&#39;avoir des compétences précises de pipetage pour assurer des mesures précises de produits chimiques et d&#39;autres ingrédients importants pour cette technique (pipetage étudiants spectacle). </li><li> La première étape de ce processus est de se laver les cerveaux, qui consiste à remplacer le CPE dans les assiettes ainsi trois à cinq fois; entre chaque lavage des plaques ainsi sont placées sur une bascule de 10 minutes (montrer aux étudiants remplaçant PBS et en plaçant les plaques bien sur rockers) . </li><li> Les tranches de cerveau sont ensuite exposés à la solution d&#39;anticorps primaire et conservés à 4 ° C pendant la nuit sur la bascule (processus de spectacle). </li><li> Après un autre lavage, les tranches de cerveau sont exposées à un anticorps secondaire pendant une heure sur la bascule à la température ambiante, puis lavés à nouveau. </li><li> Suivant les cerveaux sont exposés à une solution Avitin-biotine pour se préparer à la visualisation des cellules neurochimique-positif. </li><li> Pour l&#39;étape de visualisation finale, les cerveaux sont exposés à la DAB. Ceci est un produit dangereux et devraient toujours être manipulés avec prudence. Comme on le voit ici, les tranches du cerveau commencent à s&#39;assombrir devant vos yeux (montrer des processus). </li><li> Suite à l&#39;exposition DAB, le cerveau passent par la dernière série de lavages et sont ensuite soigneusement placés sur des lames de microscope subbed et laisser sécher durant la nuit (montrer le placement d&#39;une tranche de cerveau sur une lame; voir la pièce jointe pour le protocole de diapositives subbed). </li><li> Les lames sont ensuite compensées par une série de lavages à l&#39;eau et de l&#39;alcool distillé, d&#39;être finalement submergés dans Citrosolv avant d&#39;être lamelle et stockées dans un Slidebox pour garder sûr (montrer les différents aspects de ce processus, voir l&#39;attachement des processus de compensation). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Après les diapositives ont séché, elles peuvent être évaluées avec le logiciel neuroquantification spécialisés. Voici un logiciel Bioquant est utilisé pour quantifier les cellules vasopressine-positifs et des fibres dans le noyau paraventriculaire du cerveau de souris (montrer le logiciel à l&#39;écran ... et le microscope). </li><li> Le domaine d&#39;intérêt spécifique est identifié en utilisant les options de mesuredu logiciel pour établir le champ visuel pour neuroquantification. Il est important que la taille du champ visuel cohérent est quantifié pour chaque animal (étudiant montrent ce faire). </li><li> Voici les corps colorés en foncé cellules vasopressine-immunoréactive et les fibres sont apparentes. Parce qu&#39;il est difficile de compter ou de trace de ce tissu, une caractéristique particulière de ce logiciel utilise la lumière pour seuillage déterminer le montant total du tissu colorées positivement dans la zone d&#39;intérêt spécifié. Ce seuillage nous indique de combien de la zone spécifiée contenait vasopressine-positif tissus (montrer la valeur des données sur l&#39;écran d&#39;ordinateur). </li></ol> 5. Analyse comportementale <ol><li> Si plus d&#39;un observateur sera notation des bandes vidéo, il est important d&#39;établir fiabilité inter-évaluateurs pour assurer que les observateurs sont marquant le comportement d&#39;une manière cohérente. Pour la session notation réelle, une feuille de pointage de comportement doit être préparé pour permettre notation facile du comportement pendant les séances d&#39;observation (voir le tableau 2 pour exemple de notation tableur). </li><li> Pour les comportements qui ne sont pas rapides réponses épisodique, une analyse peut révéler microséquençage subtilités sur la progression des réponses spécifiques. Par exemple, le comportement de toilettage consiste en une chaîne de réactions très rapides. Bien que d&#39;une option est de simplement enregistrer la présence et la durée de toilettage, une autre est de documenter la chaîne des événements qui accompagne cette réponse. En utilisant ce logiciel microséquençage, les observateurs score de la présence d&#39;un comportement particulier à chaque seconde, comme demandé par le logiciel (software spectacle et vidéo). </li><li> Après la collecte des données, les paramètres d&#39;intérêt sont déterminés et les scores comportementaux appropriés sont analysés. Des exemples peuvent être la durée totale du temps passé en contact avec le chiot, ou le nombre d&#39;interruptions dans la séquence de toilettage (montrer ordinateur avec tableur avec les données saisies pour chaque animal). </li><li> Une fois que le comportement est marqué il est important de confirmer que les deux espèces présentaient des stratégies d&#39;intervention différentes pour le comportement de l&#39;intérêt dans l&#39;étude. Dans ce cas, la souris sylvestre Californie devrait présenter un comportement plus paternel que les souris cerfs communs. De plus, diverses mesures comportementales peuvent être corrélées avec les mesures du cerveau pour obtenir une vision plus éclairée des influences pertinentes. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <ol><li> Pour valider le modèle, les données devraient indiquer clairement que les deux espèces effectué différemment à l&#39;égard du comportement de l&#39;intérêt. Ici vous pouvez voir que le P. mâles californicus passé plus de temps de toilettage et accroupi sur les chiots, deux caractéristiques des réponses paternelle (voir Figure 4). </li><li> Afin de déterminer si la variable d&#39;intérêt est neurobiologial important dans les réactions paternelle, le montant de la vasopressine (AVP)-positifs tissus a été quantifiée pour plusieurs zones du cerveau concernées; comme on peut le voir, le père P. animaux californicus avait plus de tissu immunitaire positive dans plusieurs de ces zones du cerveau. (Voir Figure 5). </li><li> Dans une étude connexe en utilisant l&#39;analyse microséquençage, il a été émis l&#39;hypothèse que la Californie paternelle souris présentent moins d&#39;anxiété que leurs homologues vierge; en conséquence, lorsqu&#39;ils sont exposés à une odeur de prédateurs, les pères exposés moins d&#39;interruptions dans la séquence de toilettage que les animaux vierges (voir Figure 6). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> Figure 1: (A) Des souris mâles présentant des réponses en Californie paternelle envers conspécifiques chiot extraterrestre. (B) la souris sylvestre Homme présentant une approche prudente (étirement participer) et la réaction d&#39;évitement, en présence d&#39;un étranger conspécifiques chiot. Remarque: Dans ces évaluations interaction sociale, si un homme présente des réactions agressives envers le chiot, les expérimentateurs immédiatement frappé le haut de la cage pour distraire le mâle. A ce moment la session est terminée et que le chiot est retiré, inspecté pour déceler toute blessure et est retourné à la mère. Dans notre laboratoire, ce qui est rarement observé avec P. mâles californicus mais il est parfois observé avec P. maniculatus; observation attentive et une intervention immédiate, cependant, prévenir les dommages de se produire pour les animaux. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> Figure 2: Une souris en Californie en interaction avec une souris jouet; les plus essayé de mâcher sur ces stimuli. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> Figure 3: Dispositif expérimental de l&#39;étude, il y avait environ 6 animaux de chaque groupe pour chaque espèce. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> Figure 4: graphique des processus d&#39;immunocytochimie. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> FigLa figure 5 réponses paternel dans la Californie et la souris sylvestre;. réponses plus paternel (marié, s&#39;accroupir, approche plus rapide) ont été observées chez les souris en Californie. Plus étirer assiste (réponse au stress) ont été observées dans les souris sylvestres. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> Figure 6. Immunoréactivité vasopressine dans différentes zones du cerveau des deux espèces. Les souris Californie avait plus de coloration dans les cellules et les fibres PVN. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> Figure 7: paternel souris exposées en Californie moins d&#39;interruptions dans leurs séquences de toilettage, en présence d&#39;une odeur de prédateurs que les groupes exposés chiot et vierge.

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	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cet article traite de trois composantes essentielles pensé pour être critique pour l&#39;exécution réussie des enquêtes comportementales neurosciences: (1) un modèle animal représentatif et valable; (2) un protocole d&#39;immunocytochimie précise et sensible, et (3) la plupart des analyses (observation et statistiques ) à la fois des données comportementales et cérébrales. Erreurs dans une seule catégorie sera très certainement compromettre les résultats de l&#39;étude. Ainsi, après avoir soigneusement le choix du modèle animal approprié, un effort considérable doit être orientée vers des essais pilotes les procédures comportementales et histologiques de s&#39;assurer que le comportement sera fiable observée dans l&#39;étude, suivi par le traitement réussi du cerveau. Comme mentionné précédemment, l&#39;utilisation d&#39;espèces comparative pour identifier les mécanismes neurobiologiques d&#39;une réponse particulière est une approche méthodologique précieux parce que cette technique ne nécessite pas de génie génétique ou douloureuses manipulations chirurgicales. Ainsi, cette approche méthodologique utilise moins menacés, les animaux intacts. L&#39;utilisation de variations naturelles des animaux, cependant, est renforcée par l&#39;incorporation des ressources naturelles-comme les environnements, même si les animaux sont logés dans le laboratoire. En outre, si les études en laboratoire peut être étendu au domaine de continuer à valider l&#39;authenticité de différences dans le comportement des espèces d&#39;intérêt, cette prochaine étape est recommandée. Bien que l&#39;approche comparative offre de nombreux avantages, une limitation est la nature des données corrélatives, par conséquent, des techniques complémentaires telles que les manipulations pharmacologiques doivent être utilisés pour valider davantage le rôle de cible systèmes neurobiologiques dans le comportement de l&#39;intérêt. Une fois les expérimentateurs se sentir confiants au sujet des procédures comportementales, histologiques et statistiques, des précautions doivent être prises afin que les conditions de vie des animaux restent constantes pour tous les groupes, sauf, bien sûr, pour la manipulation expérimentale. Les changements dans les variables telles que les horaires de lumière, le bruit, les concierges, les niveaux d&#39;humidité et les odeurs dans le laboratoire pourrait avoir des effets significatifs sur les réponses des animaux neurobiologiques. Dans cet article, l&#39;anticorps primaire a été utilisé pour la détection de la vasopressine, mais d&#39;autres anticorps primaires peuvent être utilisées pour une multitude de neurotransmetteurs différents centres d&#39;intérêt. Si l&#39;expérimentateur est de travailler avec un nouvel anticorps, il est important de mener des études de titration pour déterminer la dilution optimale de l&#39;anticorps nouveaux. Plusieurs fois, trop d&#39;anticorps est utilisé (comme suggéré par le vendeur), résultant en tissu qui est trop sombre pour distinguer le signal; encore, l&#39;utilisation excessive de l&#39;anticorps est très coûteux. Enfin, si plus d&#39;une seule analyse statistique peut être utilisée pour fournir d&#39;autres vues et les interprétations des données, ils doivent être utilisés. Dans cette étude particulière, des modèles linéaires généraux, corrélationnelles et analyse le positionnement multidimensionnel ont été utilisées pour fournir des vues les plus informative des données.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Microscope composé binoculaire </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> BIOQUANT Software Sciences de la Vie </td><td> BIOQUANT Corporation Image Analysis </td><td> Version 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex console Easy Drive-Charge L / S (pompe à perfusion) </td><td> Instrument Company Cole-Parmer </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Eh bien Cluster culture cellulaire (culture de tissus traités; apyrogène polystyrène; stérile) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope 25x75x1mm </td><td> Globe Scientific, Inc </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> Slip 22x50mm couverture No.1 </td><td> Globe Scientific, Inc </td><td> 1414-1410 </td><td></td></tr><tr><td> Non stérile 3ml Diplômé Grande pipettes de transfert Ampoule </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Poudre de détergent Alconox </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1 kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium monobasique </td><td> Spectrum </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium dibasique dihydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Spectrum </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Fisher </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> Sulfate de potassium Chrome </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol, Bouteilles Den.Poly Haute, 200 preuve, 24 x 1 pinte </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Vecteur </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti réactifs spécifiques d&#39;analyte vasopressine </td><td> Immunostar, Inc </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé anti-lapin IgG (H + L) purifiées par affinité </td><td> Vecteur </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite standard Vectastain ABC Kit </td><td> Vecteur </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Kit DAB substrat de la peroxydase </td><td> Vecteur </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Originale de gélatine sans saveur (4-comptage des enveloppes) 1 oz boîte </td><td> Knox </td><td></td><td> Achat à l&#39;épicerie locale </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène à 3% </td><td> CareOne </td><td></td><td> Achat à la pharmacie locale </td></tr><tr><td> Javellisant </td><td> Clorox </td><td></td><td> Achat à l&#39;épicerie locale </td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

Un but de neuroscience comportementale est d&#39;identifier les facteurs sous-jacents qui régulent neurobiologiques des comportements spécifiques. En utilisant des modèles animaux pour atteindre cet objectif, plusieurs stratégies méthodologiques nécessitent des techniques invasives pour manipuler l&#39;intensité du comportement d&#39;intérêt (par exemple, les méthodes lésion, manipulations pharmacologiques, les techniques de microdialyse, des modèles animaux génétiquement modifiés). L&#39;utilisation d&#39;une approche comparative des espèces permet aux chercheurs de tirer profit des différences naturelles dans les stratégies de réponse existantes dans les espèces étroitement apparentées. Dans notre laboratoire, nous utilisons deux espèces du genre Peromyscus qui diffèrent dans les réponses paternelle. La souris sylvestre hommes Californie (Peromyscus californicus) présente les mêmes réponses des parents comme de la femelle tandis que sa cousine, la souris sylvestre commune (Peromyscus maniculatus) présente pratiquement pas de réponses nourrir / parents dans la présence de ratons. D&#39;un intérêt particulier dans cet article est une exploration des facteurs neurobiologiques liés à l&#39;affiliation des réponses sociales exposées par la souris en Californie cerfs paternelle. Parce que l&#39;approche des neurosciences comportementales est multiforme, les éléments clés suivants de l&#39;étude seront brièvement abordés: l&#39;identification des espèces appropriées pour ce type de recherche, la collecte de données pour l&#39;analyse comportementale, la préparation et le sectionnement des cerveaux; étapes de base de l&#39;immunocytochimie pour la la quantification de la vasopressine-immunoréactivité, l&#39;utilisation de logiciels de neuro-imagerie afin de quantifier le tissu cérébral, l&#39;utilisation d&#39;une analyse vidéo microséquençage au score de comportement et, enfin, les analyses statistiques appropriées pour fournir des interprétations les plus informés des résultats de recherche.

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

L&#39;approche comparative permet espèces neuroscientifiques comportementaux d&#39;explorer différents facteurs neurobiologiques associés à des comportements spécifiques considérés comme caractéristiques d&#39;un modèle animal spécifique. Profitant de naturellement des différences de comportement entre espèces étroitement apparentées, cette technique ne nécessite pas de techniques invasives pour manipuler l&#39;expression du comportement.

En utilisant une approche comparative des espèces pour Enquêter sur la neurobiologie des réponses paternel

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

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JoVE Journal

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Enregistrements tableau multiélectrodes de l&#39;épithélium Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Recherche

Neurosciences

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Enregistrement des réponses comportementales à la réflexion chez les écrevisses

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Mesurer la valeur subjective des options risquées et ambiguës l&#39;aide de l&#39;économie expérimentale et fonctionnels des méthodes d&#39;IRM

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Une nouvelle approche qui élimine la manipulation pour l&#39;étude de l&#39;agression et le «perdant» dans Effet<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Behavioral Assay d&#39;enquêter sur les réponses gustatifs de l&#39;individu, Librement-mobiles Bumble Bees (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...