Nous tenons à remercier BK août de l&#39;Université de Wisconsin-Madison Facilité microscope électronique pour la microscopie électronique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-DA026067 et P30-HD03352 (pour la JSM).

1. Les préparatifs 1-4 <ol><li> Préparer tampon de 500 mL de milieu de gradient (GM) en mélangeant 50 ml d&#39;une suspension de 2,5 M de saccharose, 2,5 mL d&#39;un 1M Tris-HCl, pH 7,5 stock, et 0,1 mL d&#39;une EDTA 0,5 M, pH 8,0 milli-actions avec Q eau au volume. Filtre stériliser la solution, et de stocker aliquot congelé. </li><li> Préparer un stock de 1000x de tétrodotoxine (TTX) en faisant une solution à 1 mM dans milli-Q H 2 O. Des aliquotes de TTX peuvent être stockés à -20 ° C. </li><li> Préparer tampon de stimulation 10x en faisant une solution de Tris 100 mM (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM de KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, et 800 mM de NaCl dans l&#39;eau milli-Q. Stock peut être conservé à 4 ° C. </li><li> Pré-cool centrifugeuses à 4 ° C. </li><li> Préparer une solution stock de isosmotique Percoll (SIP) en ajoutant 9 volumes de Percoll (18 ml) à 1 volume de 2,5 M de saccharose (2 ml) dans de l&#39;eau milli-Q et bien mélanger. </li><li> Préparer les 3, 10, 15, et les couches de gradient de 23% en additionnant les montants respectifs de la SIP à GM de tampon et de mélange de chaque: </li></ol><img alt="Tableau 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" /><ol start="7"><li> Verser couches de gradient par pipetage 2 ml de chacun des 23, 15, 10, et 3% des solutions de Percoll isosmotique dans les tubes avec des bouchons centrifugeuse Beckman utilisant un P1000 Gilson Pipetman. L&#39;interface entre les couches doivent être clairement perceptible sans mélange des couches. Stocker les gradients à 4 ° C pendant au moins 20 min avant utilisation. Les gradients peuvent être stockées pendant jusqu&#39;à 24 heures le même jour bien que l&#39;utilisation est recommandée. [Le personnel de laboratoire inexpérimentés peuvent pratiquer des gradients de la préparation en ajoutant du colorant bleu pour les solutions isomotic Percoll pour la visualisation des interfaces couche.] </li></ol> 2. Une dissection de souris <ol><li> S&#39;assurer que toutes élevage de souris et de l&#39;euthanasie procédures sont exécutées conformément aux directives du NIH et de l&#39;Université. Euthanasier les chiots (âge P13 à P21) par asphyxie de dioxyde de carbone ou par une méthode approuvée par le protocole d&#39;animaux. </li><li> Pin de la souris sur une planche de dissection et de pulvérisation à l&#39;arrière du cou et la tête avec de l&#39;éthanol. En utilisant une paire de ciseaux pointus couper à travers la moelle épinière à la base du crâne, enlever la peau du haut du crâne, le crâne coupé latéralement entre l&#39;os pariétal et l&#39;os interpariétales ou entre le cerveau et les régions du cortex. Ensuite, couper le crâne de la base du nez (long de la suture sagittale), retirer soigneusement les os pariétal douce en tirant chaque hémisphère sur le côté et retirer le cortex avec une spatule. Insérer la spatule dans le cerveau au-dessus du cervelet et le cortex évider et le placer dans tampon glacé GM. Procéder immédiatement à l&#39;étape d&#39;homogénéisation. Ne laissez pas les cortex s&#39;asseoir dans tampon glacé pour très longtemps que ce sera nuire à la formation des SNS. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;homogénat et SN 1-4 <ol><li> Rincez le cortex dans glacée GM tampon et de transfert à deux corticales à un Dounce verre homogénéisateur contenant 5 ml de tampon froid GM. </li><li> Homogénéisé doucement le cortex avec des coups de 5-10 au pilon en vrac (pilon &quot;A&quot;), suivi par des traits de 5-10 au pilon serrés (pilon &quot;B&quot;). Strokes devrait être rapide, mais assez lentement pour ne pas provoquer des bulles d&#39;air. Une photo de l&#39;homogénat après homogénéisation est dans le schéma 1. Le nombre de coups peut varier dépendant de l&#39;homogénéisateur individuelles et pilons qui l&#39;accompagne. Lorsque vous avez terminé les gradients devrait donner une forte bande SN, sinon, ajuster le nombre de coups. </li><li> Transférer le broyat à une conique 15 ml et centrifuger à 1000xg pendant 10 min à 4 ° C dans un rotor swing (Allegra 6KR centrifugeuse) afin de culot cellulaire des débris et des noyaux. Une image de l&#39;homogénat filé est dans le schéma 1. </li><li> Couche 2 ml du surnageant par gradient de Percoll-sucrose, le plafond du tube, et centrifuger à 32 500 xg pendant 5 min à 4 ° C dans un rotor à angle fixe (Beckman J2-21 centrifugeuse, JA-17 du rotor) en utilisant des adaptateurs appropriés ( Voir le tableau Réactifs et équipement). </li><li> Pipette et jeter la solution ci-dessus la bande SN utilisant une pipette Pasteur en verre. Pipette hors du groupe SN à l&#39;interface% 15/23, transfert à une forme conique et de stocker sur la glace. Chaque dégradé ou une corticale va produire 0,9 à 1,1 ml de SN. </li><li> Ajuster la concentration en sel de la SNS en ajoutant un dixième volume de tampon de stimulation 10x, ajouter 1000x CaCl 2 à une concentration finale de 12 nM, et ajouter 1 mM TTX achat d&#39;actions à une concentration finale de 1 uM à supprimer une excitation non spécifiques. (Addition de CaCl 2 est facultative si elle va interférer avec les applications SN en aval). </li><li> Déterminer la concentration en protéines de la SNS en utilisant le kit Micro BCA Protein Assay. (Le dosage des protéines Bradford n&#39;est pas recommandée en raison de l&#39;inférence à partir du Percoll.) </li><li> SN peut être utilisé directement et rapidement pour la protéine traduction des études. Pour d&#39;autres applications SN lysat peut être nettoyé ou concentré en utilisant l&#39;Pierce SDS-PAGE de préparation d&#39;échantillons Kit. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Lorsque la souris du cortex a été homogénéisé et séparé sur discontinu Percoll-sucrose dégradés (Schéma 1), 6 bandes ou des fractions ont été observés (figure 1). Il a été précédemment montré pour le rat cortex cérébral 3,5 que les constituants des bandes de haut poids moléculaire ont été brisées et des membranes de la myéline et que le matériel granulé contient des mitochondries ou des organelles (tableau 1). Les 23% / 15% d&#39;interface (bande 5) contenait le SNS enrichi. La bande à 23% de l&#39;interface / 15%, contenant SN intacte, a été enlevé et examiné par microscopie électronique (EM), comme décrit précédemment. 2,6 ME a montré la présence de vésicules synaptiques et intacte la préservation des éléments pré-et postsynaptiques (figure 2). L&#39;isolement des compartiments pré-et post-synaptiques est important d&#39;examiner de signalisation et de la synthèse des protéines, qui se produit dans les deux compartiments. 7-13 Le gradient de Percoll-sucrose est une purification brut ainsi que nous avons vu mineures cellulaire, la contamination nucléaire et des organites dans la fraction SN, mais le la séparation globale a été bonne. Lorsqu&#39;ils sont examinés par Western blot, les fractions de Percoll contenait les marqueurs protéiques s&#39;attend à une augmentation de la pureté synaptique dans la bande de SN (figure 3, tableau 2). Marqueurs synaptiques et neuronales ont été maintenus dans la bande enrichi SN (bande 5), mais l&#39;abondance des autres marqueurs a été significativement réduit. En particulier, la présence de la GFAP, un marqueur des cellules astrocytaires et néoplasiques d&#39;origine gliale, et Lamin-B1, un marqueur nucléaire, ont été négligeables, alors que les marqueurs structurels et synaptiques ont été maintenus ou améliorés. En outre, il a été rétention des marqueurs pour les organelles, comme la mitochondrie et de Golgi, qui jouent un rôle dans la synthèse protéique. Les rendements typiques de la bande 250-500 ng SN ont été de protéines par ul, tel que déterminé par un dosage de protéines BCA. L&#39;activité du SNS a été déterminée par la quantité de synthèse protéique de novo présenter comme surveillé par [35S]-Met incorporation (figure 4). 2 activité basale translationnelle a été augmenté 1,56 fois quand SN ont été stimulées avec 50 uM glutamate/10 uM de glycine (Glu) ou 5,12 fois quand il est activé avec l&#39;inhibiteur de la juglone Pin1. L&#39;inhibition de Pin1 est connu pour entraîner dans la synthèse de protéine accrue. 2 pour confirmer que l&#39;augmentation de [35S]-Met était due à l&#39;incorporation synthèse protéique de novo, nous avons ajouté 40 anisomycine uM, un inhibiteur de la synthèse des protéines, et a vu une diminution marquée de l&#39;incorporation en présence et en absence de Glu par rapport aux niveaux de base. Aussi, lors de l&#39;addition de 2% de Triton-X 100, ce qui perturbe l&#39;intégrité de la SNS, la traduction a été basale diminué de 75%. 2 En outre, lorsque l&#39;on examine les bandes (B4-B6) qui a montré l&#39;enrichissement marqueur le plus synaptique, Le SNS ou de la bande 5 était la plus forte activité de synthèse protéique de novo (figure 5). Ainsi, le discontinu de Percoll-sucrose gradients produire rapidement une très active et enrichie SN bande qui peut être utilisée pour étudier la traduction des protéines. La procédure de gradient discontinu de Percoll-sucrose est plus avantageuse que d&#39;autres méthodes, car les dommages mécaniques est causée par des conditions plus sévères. Par rapport à la méthode de filtration, dans lequel effacé homogénat cortical est passé à travers une série de filtres qui diminuent en taille, la méthode 3,14-15 Percoll formes plus SN avec une plus grande activité. Comme le montre la figure 6, lorsque une aliquote de SNS préparé par la méthode de filtration a été passée sur un gradient Percoll-sucrose il ya beaucoup moins de SN à l&#39;interface% 15/23 et une plus grande quantité de membranes cassé. Lorsque la synthèse protéique de novo a été mesurée par l&#39;incorporation S35-rencontre, le SNS préparé par la méthode de filtration ont été beaucoup moins actif (figure 7). Afin de maximiser l&#39;activité traductionnelle, nous utilisons des souris qui sont entre l&#39;âge de P14 et P18. SN peuvent être préparés à partir de souris adultes, mais nous avons observé significativement augmenté l&#39;activité traductionnelle avec SN préparé à partir de souris juvénile (figure 8). <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" /> Tableau 1. Constituants des bandes du discontinu de Percoll-gradient fractionnements du cortex de souris homogénéisé. 3,5 <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" /> Tableau 2. Résumé de l&#39;analyse des boulons Ouest du discontinu Percoll-sucrose constituants bande de dégradé. Concentrations de protéines relative pour chacune des fractions bande isolée en utilisant un Percol discontinuL-saccharose gradient ont été déterminées par Western blot. Aucune protéine présente (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), ou&gt; 0,8 fois (+++) = supérieur protéine présente dans le représentant surnageant (S, centrifugé cortex homogénat), de n 3. <img alt="Schéma 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" /> Schéma 1: Schéma d&#39;une préparation de SN utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose cortex cérébral de souris ont été disséqués, homogénéisés et centrifugés à faible vitesse pour enlever non homogénéisé tissus, cellules, organites entiers, tels que des noyaux et des membranes.. Le gradient discontinu doivent être clairement définies couches. La photo en médaillon montre un exemple des couches, qui ont été teints bleus à titre indicatif seulement afin de visualiser les couches. Le surnageant est posée au sommet d&#39;une discontinuité du gradient Percoll-sucrose et centrifugés à vitesse moyenne. Le groupe SN est ensuite récupéré à partir du gradient et est prêt à utiliser. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" /> Figure 1. Fractionnement sur ​​un homogénat discontinu de Percoll-sucrose dégradé. Souris cortex a été homogénéisé et séparé sur un discontinu de Percoll-sucrose gradient donnant lieu à 6 bandes ou des fractions. Le purifiée, actif SN (*) ont été trouvés dans la bande 5. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" /> Figure 2. Les préparations SN donnent un mélange hétérogène de SNS qui conservent des éléments pré-et postsynaptiques. Une micrographie électronique d&#39;une préparation SN préparé à partir de souris C57BL / 6 (âge P13 à P21) a été réalisée comme décrit précédemment et montre avec SN conservé des éléments pré-et postsynaptiques. 2 , 6 points rouges flèches pour les densités post-synaptiques. La barre d&#39;échelle est de 1 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" /> Figure 3. Analyses par Western blot des préparatifs SN a montré que des marqueurs synaptiques et neuronales ont été maintenues dans le SNS purifié (bande 5), mais l&#39;abondance des autres marqueurs a été significativement réduit. Immunoblots de surnageant (S, centrifugé homogénat cortical) et les bandes 1-6 de une discontinus gradient Percoll-sucrose ont été sondées pour β-actine (structurelle, le contrôle du chargement), la GFAP (astrocytes), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmiques et nucléaires), Lamin-B1 (nucléaire), Prohibitin (mitochondrial), PSD95 (densité post-synaptique ), SNAP25 (synaptique), la synaptophysine (synaptique) et β3-tubuline (neurone-spécifique). Les bandes ont été visualisées en utilisant une tempête 860 Phosphorimager, représentatif de n = 3. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" /> Figure 4. SNS sont actifs et présentent la synthèse protéique de novo via [35S]-Met constitution. SN ont été pré-équilibrée à 37 ° C pendant 10 min. Puis la SNS ont été traités ou prétraités pendant 15 min avec 40 uM anisomycine ou 1 uM juglone à 37 ° C suivie d&#39;une addition de [35S]-Met, 20 pl Express Pro label Mix S35 Tag facile, plus ou moins Glu à 37 ° C pendant 30 min. Les échantillons ont été préparés en utilisant l&#39;Pierce SDS-PAGE de préparation d&#39;échantillons Kit, sur un gel de polyacrylamide 15%, séché et quantifiée en utilisant un Dynamique Moléculaire Tempête 860 phosphorimager, représentatif de n = 3, ± SEM. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" /> Figure 5. La bande 5 du discontinu de Percoll-sucrose gradient contenait les plus hauts niveaux de synthèse protéique de novo. Bandes 4, 5 et 6 et le surnageant (S, centrifugé homogénat cortical) ont été pré-équilibrée à 37 ° C pendant 10 min. Ensuite, [35S]-Met, Mix Pro Label express S35 Tag facile, a été ajouté, plus ou moins Glu à 37 ° C pendant 30 min. Les échantillons ont été préparés en utilisant l&#39;Pierce SDS-PAGE de préparation d&#39;échantillons Kit, sur un gel de polyacrylamide 15%, séché et quantifiée en utilisant un Dynamique Moléculaire Tempête 860 phosphorimager, représentatif de n = 3, ± SEM. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" /> Figure 6. SN préparés à partir d&#39;une méthode de filtration des membranes contiennent plus de cassé et SN moins entier que SN préparé à partir de la méthode du gradient Percoll-sucrose discontinu. SN ont été préparés par le passage du cortex homogénéisée par une série de filtres avec la diminution de la taille des pores, comme décrit précédemment. 3,14-15 Une aliquote de la SNS préparé par la méthode de filtration a été centrifugé pendant une discontinu Percoll-sucrose gradient et comparée à un montant équivalent de matériel en utilisant la méthode du gradient discontinu de Percoll-sucrose. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" /> Figure 7. SN préparés à partir d&#39;une méthode de filtration contiennent moins de novo activité de synthèse de protéines que le SN préparés BOFm la méthode du gradient discontinu de Percoll-sucrose. SN ont été préparés par le passage du cortex homogénéisée par une série de filtres avec des pores diminue comme décrit précédemment, 3,14-15 et par les méthodes de gradient discontinu de Percoll-sucrose. SN des deux préparations ont été pré-équilibrée à 37 ° C pendant 10 min. Ensuite, [35S]-Met, Mix Pro Label express S35 Tag facile, a été ajouté, plus ou moins Glu à 37 ° C pendant 30 min. Les échantillons ont été préparés en utilisant l&#39;Pierce SDS-PAGE de préparation d&#39;échantillons Kit, sur un gel de polyacrylamide 15%, séché et quantifiée en utilisant un Dynamique Moléculaire Tempête 860 phosphorimager, représentatif de n = 3, ± SEM. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" /> Figure 8. SN de jeunes souris (P14) ont une plus grande activité translationnelle que les anciennes souris (P85). SN ont été préparés à partir de différentes souris âgées utilisant la méthode du gradient discontinu de Percoll-sucrose, pré-équilibrée à 37 ° C pendant 10 min, traitées ou non traitées avec Glu dans le présence de [35S]-Met (Express Pro label Mix S35 Tag facile) pendant 30 min, snap congelés, et plus tard nettoyé avec le SDS-PAGE Pierce Prep Kit échantillon. Le SNS ont ensuite été exécutés sur un 12% gel SDS-polyacrylamide, séché et imagé sur une tempête de dynamique moléculaire 860 phosphorimager, représentatif de n = 3, ± SEM. SN du P14 souris ont été au moins 3 fois plus actif que P85 souris.

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development.">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li><li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo.">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li><li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses.">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li><li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus.">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li><li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis.">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex.">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li><li>Haj&#243;s, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity.">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li><li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptosome+Proteomics.">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li><li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized:+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes.">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li><li>Pertoft, H., Laurent, T. C., Catsimpoolas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopycnic+separation+of+cells+and+cell+organelles+by+centrifugation+and+modified+colloidal+silica+gradients.">Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients.</a> Methods of Cell Separation. , 25-65 (1977).</li><li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+&amp;gamma;-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster.">High affinity uptake of L-glutamate and &amp;gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li><li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints.">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li><li>Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+composition,+kit+and+method.">Cell separation composition, kit and method.</a> US patent. , (1997).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La préparation gradient discontinu de Percoll-sucrose décrite ici est une méthode rapide et fiable d&#39;isoler actifs SN, qui peut être utilisé dans une variété d&#39;expériences de la transmission synaptique. Cette méthode de gradient, qui est basé sur la méthode développée par Dunkley et al., 3,4 est une procédure cerveau subcellulaire fractionnement qui isole à la fois pré-et post-synaptiques à la membrane des vésicules dérivées qui sont associés à un autre. Sans autre purification d...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Kit Micro BCA Protein Assay </td><td> Pierce </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz CO 2 </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Fisher </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE de préparation d&#39;échantillons Kit </td><td> Pierce </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Fisher </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxine </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Express Pro label Mix S35 Tag Facile </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Des outils de dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homogénéisateur, 7 ml (livré avec deux pilons en verre étiqueté «A» et «B») </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Centrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8 Rotor, rotor swing </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Centrifugeuse </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman tubes avec des bouchons </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Blanc adaptateurs fortifiée </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu adaptateurs fortifiée </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Rotor angulaire </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Table des anticorps utilisés pour Western blot: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom de l&#39;anticorps </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Espèce Hôte </th><th> Facteur de dilution </th></tr><tr><td> β-actine </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> la souris </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> la souris </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> lapin </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-7298 </td><td> la souris </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-6261 </td><td> de chèvre </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> lapin </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> la souris </td><td> 5 ug / uL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> Abcam </td><td> ab5666-100 </td><td> lapin </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Synaptophysine </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> la souris </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubuline </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> la souris </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient

Synaptoneurosomes (SNS) sont obtenus après homogénéisation et fractionnement de cortex cérébral de la souris. Ils sont refermés vésicules ou des terminaux isolés que rompre avec terminaisons axonales lorsque le tissu cortical est homogénéisé. Le SNS conserver des caractéristiques pré-et post-synaptiques, ce qui les rend utiles dans l&#39;étude de la transmission synaptique. Ils conservent la machinerie moléculaire utilisée dans la signalisation neuronale et sont capables d&#39;absorption, le stockage et la libération de neurotransmetteurs. La production et l&#39;isolement de SNS active peut être problématique médias utilisant comme Ficoll, qui peuvent être cytotoxiques et nécessitent une centrifugation prolongée due à haute densité, et la filtration et des méthodes de centrifugation, ce qui peut entraîner une faible activité en raison de dommages mécaniques de la SNS. Cependant, l&#39;utilisation des gradients de densité discontinu de Percoll-sucrose pour isoler SN fournit une méthode rapide pour produire de bons rendements de SNS translation active. La méthode du gradient Percoll-sucrose est rapide et en douceur car il emploie des conditions isotoniques, a fait tourner la centrifugation moins nombreux et plus courts et évite les étapes de centrifugation que les SRS granulés et causer des dommages mécaniques.

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Une méthode pour préparer translation active, synaptoneurosomes intacte (SNS) de la souris cortex cérébral est décrite. La méthode utilise un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose permettant la préparation rapide de SNS active.

Préparation de Synaptoneurosomes de Mouse Cortex en utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.2K vues.  University of Wisconsin. Une méthode pour préparer translation active, synaptoneurosomes intacte (SNS) de la souris cortex cérébral est décrite. La méthode utilise un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose permettant la préparation rapide de SNS active.

Vidéo: Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Recherche

Neurosciences

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Préparation de Synaptic membrane plasmique et de protéines de densité post-synaptique en utilisant un gradient discontinu de saccharose

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

Étude de la fonction de Deep corticale et structures sous-corticales Utilisation stéréotaxique électroencéphalographie: Leçons du cortex cingulaire antérieur

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...