Les préparatifs avant le jour de la culture: <ul><li> Préparer une solution stérile de dissection (DS). </li><li> Préparer NBM/B27 (Mediom Neurobasal avec B27 suppléments). </li><li> Autoclave ddH 2 O et stériliser coversilps verre, si nécessaire. </li><li> Manteau plats de culture de tissu ou de lamelles de verre avec de la poly-D-lysine. </li></ul> Poly-D-Lysine Coating: Préparer la veille de culture dans des conditions stériles. <ul><li> Aliquote de dégel du PDL 10X et le placer sur la glace. </li><li> Ajouter 9 ml stériles ultra-eau filtrée à 1 ml de PDL et bien mélanger (1X). </li><li> Surfaces Manteau avec 1X PDL nuit à température ambiante comme suit: <ul><li> verre de lamelles (Bellco Glass, Inc Cat # 1943-00012.): 75 pl / lamelle OU </li><li> 24 plaques de culture ainsi: 300 pl / puits OU </li><li> Boîte de culture 35mm: 1ml/dish </li></ul></li><li> Rincer à l&#39;eau stérile 5X (utilisation de pipettes Pasteur stériles à aspirer le liquide). </li><li> Retirer de l&#39;eau jusqu&#39;à la surface est complètement sèche. </li></ul> Procédure de culture (réalisée en hotte à flux laminaire dans des conditions stériles) <ol><li> Découpez bloc de gélose et le coller sur le bloc de support de l&#39;Vibraslicer microtome (Campden Instruments Ltd) en utilisant la super glue. </li><li> Lors de l&#39;utilisation tardive stade embryonnaire (E17-18) des fœtus de souris, d&#39;un barrage euthanasier, retirer l&#39;utérus et libre fœtus individu de sac embryonnaire. Fœtus Placer dans une boîte de Petri stérile et continuer comme décrit ci-dessous. </li><li> Fœtus de souris décapiter ou chiot (directives approuvées par votre suivi de protection des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation). </li><li> Enlever la peau et le crâne et le cerveau placer sur le disque de papier filtre Whatman dans un plat de Pétri 60mm rempli DS froid. </li><li> Coupez le cervelet en utilisant une lame de rasoir stérile. </li><li> Ramassez le cerveau à l&#39;aide d&#39;une spatule et égoutter l&#39;excès de liquide sur du papier filtre, puis transférer le cerveau de bloquer le soutien Vibraslicer et le cerveau de la colle en place (côté caudale et la partie ventrale face agar). </li><li> Remplir la chambre froide avec la DS. Réglez le sélecteur de vitesse à 8-9. </li><li> Couper 200-400 um sections, à partir de bulbe olfactif. Une fois que la lame de la Vibraslicer pénètre dans le cortex, commencer à couper 600μm coupes coronales. Un cerveau de souris E17-18 donne typiquement 3-4 tranches utilisable, alors un cerveau de souris P0 rendements 4-5 tranches utilisables. </li><li> Transfert des tranches de cerveau à 35 mm boîte de Petri étiquetés DS 2 en utilisant de fond inverse de l&#39;ONU-branchée verre de 10 ml Pasteur pipette. </li><li> Disséquer le cortex et enlever les méninges en utilisant des aiguilles de verre tiré à partir des tubes capillaires. </li><li> Couper écorces corticale en petits morceaux, 0,5-1 mm de longueur. </li><li> ES Filtrer à travers filtre de 0,2 um attachée à une seringue de 5 cc dans un plat de Pétri de 35 mm. </li><li> Transférer les morceaux de tissu cortical boîte de Pétri contenant ES filtré. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li></ol> Dans l&#39;intervalle: <ol><li> Nettoyer le capot, et les outils Vibraslicer dissection. </li><li> Ajouter 5 ml de NBM/B27 chaud dans un plat de Pétri de 60 mm. </li></ol> Après 30 min. incubation: <ol><li> Transfert des tissus à 10 ml DS. Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Transfert des tissus au premier tube de tourbillons Salut et laisser reposer pendant 2-3 min. </li><li> Transfert à Salut secondes. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert d&#39;abord Li. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert à la seconde Li. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert à des tiers Li. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert des tissus à l&#39;antenne de 60 mm avec les médias. </li></ol> Sous le microscope de dissection: <ol><li> Nettoyer les débris tissulaires et triturer chaque pièce en douceur en passant par une pipette de verre tiré (utilisation décroissante diamètres d&#39;alésage) pour assouplir les tissus. </li><li> Transfert suspension cellulaire à 15 ml tube conique contenant le reste de NBM + B27 (Faire un total de 13 ml pour une plaque à 24 puits ou 11 ml pour 5 -. Plaques de 35 mm Mélanger doucement et attendre que de gros morceaux de tissus à régler). </li><li> Suspension de cellules de transfert (0,5 ml / puits d&#39;une plaque à 24 puits ou 2 ml / boîte de 35 mm de la culture). </li><li> Lors de l&#39;utilisation des lamelles en verre, ajouter 80 ul par suspension cellulaire lamelle et permettre une heure dans la culture des tissus incubateur pour cellules d&#39;adhérer avant l&#39;inondation de la chambre avec plus NBM/B27 médias. </li><li> Maintenir les cultures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> Jour suivant 24 plaques ainsi: Flux chaque puits avec 0,5 ml de cellules non-neuronales conditionnée NBM/B27 moyennes (cNBM/B27; Protocole pour la préparation de cNBM/B27 milieu apparaît ci-dessous) Plats 35mm: Remplacer 0,5 ml avec cNBM/B27 moyenne. Maintenir la culture en remplaçant 0.5ml de milieu avec cNBM/B27 frais tous les 2-3 jours. Bien que les milieux de culture ne favorise pas la prolifération des cellules gliales, les cultures peuvent être traitées avec 5 um FDU (5-fluoro-2&#39;-désoxyuridine, Sigma F0503) au jour 3-5 dans la culture afin de réduire davantage le nombre de cellules gliales, si nécessaire. SET<html> -UP pour la dissection et de la Culture Stériliser les outils de dissection dans EtOH 70% ou les autoclaves: <ul><li> Ciseaux (moyennes et petites) Spatules (moyennes et petites) </li><li> Lame de rasoir Brucelles (moyennes et petites) </li><li> Lame pour le bain de tampon vibraslicer </li><li> Cale métallique pour support de lame pour le cerveau </li></ul> Autres matériaux: <ul><li> Boîtes de Pétri (60 mm) </li><li> Boîtes de Pétri (35 mm) </li><li> Le papier filtre </li><li> Pipette en verre de 10 ml </li><li> Stérile pipettes jetables, 5,10 et 25 ml </li><li> Seringue filtre de 0,2 um </li><li> Seringue 5 cc </li><li> Tubes à centrifuger de 15 ml </li><li> Pipettes Pasteur stérile en verre </li><li> PDL boîtes de culture enduits ou des lamelles de verre </li></ul> Étiquette six tubes de 15 ml centrifugeuse et suivre la préparation: Tube n ° 1: la solution enzymatique: Ajouter 50 U de la papaïne (Worthington LS 03126) à 5 ml contenant DS: <ul><li> 100 pi de L-cystéine (0,8 mg) </li><li> 7 ul NaOH 0,1 N </li><li> 50 ul APV (5mm) </li></ul> Laisser la solution à température ambiante au clair. Notez que la solution d&#39;enzyme apparaîtra «trouble» au début et a besoin d&#39;effacer avant de l&#39;utiliser. Tube # 2 et # 3: Inhibiteur de l&#39;enzyme Salut: 3 ml DS + 300 pl de BSA / Ti + 30 ul APV (5mm). Mélanger doucement pour éviter les bulles, puis diviser en deux aliquotes de 1.5ml. Tube n ° 4 - # 6: Inhibiteur de l&#39;enzyme basse: 8 ml DS + 80 ul de BSA / Ti + 80 ul APV (5mm). Mélanger doucement pour éviter les bulles, la diviser en trois aliquotes 2,6 ml. Placer les tubes numérotés # 2 à # 6 sur la glace. Laisser le tube n ° 1 (solution enzymatique) à température ambiante. SOLUTIONS ET aliquotes <ul><li> Solution A (Buffered Saline) Sigma Formule poids de 500 ml [conc.] </li><li> Chlorure de sodium NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm </li><li> Chlorure de potassium KCl P-4504 74.56 4.0g 5.4mm </li><li> Phosphate de sodium dibasique anhydre Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0,24 g 0.17mm </li><li> Potassium phosphate monobasique anhydre KH 2 PO 4 P-5379 136.09 0.3g 0.22mm </li></ul> Peser tous les ingrédients et mélanger jusqu&#39;à dissoudre avec 400 ml d&#39;eau filtrée ultra. Amener le volume final de 500 ml. Placer dans un flacon propre et autoclave. Conserver à 4 ° C et l&#39;étiquette «Solution DS A». <ul><li> Solution B (HEPES) Sigma Formule poids de 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 mm 20.97g </li></ul> Ajouter ultra-filtrée de l&#39;eau jusqu&#39;à 200 ml. Mélanger jusqu&#39;à dissolution et amener le volume final à 250 ml. Placer dans un flacon propre et autoclave. Conserver à 4 ° C et l&#39;étiquette «Solution DS B». <ul><li> Solution de travail de 500 ml [conc.] </li><li> Ultra eau filtrée 400 ml </li><li> Une solution stock de 25 ml </li><li> Solution mère B 14 ml </li><li> D (+)-Glucose Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Saccharose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM </li></ul> Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N. Amener le volume final à 500 ml avec de l&#39;eau filtrée ultra. Transvaser dans une bouteille en verre propre et autoclave. Conserver à 4 ° C. Label &quot;Solution de dissection». Poly-D-Lysine Préparation: <ol><li> Préparer une solution stock de 10x de poly-D-lysine (PDL; Sigma P-7280) en H 2 O stérile à 1mg/ml. </li><li> Faire aliquotes de 1,0 ml. Cette solution peut être conservée à -20 ° C jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> MEDIA <ol><li> Ajouter 10ml de B-27 Supplément (Gibco 17504-044) à 500 bouteilles NBM ml (milieu Neurobasal, Gibco 21103-049). </li><li> Faire aliquotes de 40 ml et conserver à 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Ajouter 10 ml stériles H 2 O pour flacon de 10 mg APV (2-amino-5-phosphonopentanoic acide, Sigma A-5282) et bien mélanger. </li><li> Préparer 180 aliquotes et stocker à -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Dissoudre 1 g de BSA (albumine bovine. Sigma A-7030) et 1 g d&#39;inhibiteur de trypsine (Sigma T-9253) dans 10 ml DS. </li><li> Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N. </li><li> Stériliser par filtration sur filtre seringue 0,2 um. </li><li> Diviser en 400 aliquotes et stocker à -20 ° C. </li></ol> L-CYSTÉINE Dans un tube Eppendorf dissout 0,6 mg de L-cystéine (Sigma C-7755) dans 200 ul DS. AGAR (4%) <ol><li> Dissoudre 4 g d&#39;agar Bacto (Difco 0140-01) dans 100 ml d&#39;eau stérile. Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire pour la culture. </li><li> Agar à micro-ondes pour faire fondre et de remplir un plat de Pétri de 35 mm. Laisser reposer pour refroidir et polymériser. </li></ol> Papaïne (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; non neuronales CULTURES EN BOUTEILLES DE CULTURE NUNC Flacon de culture REVÊTEMENT (4 bouteilles Nunc) <ol><li> Ajouter 9 mL d&#39;eau stérile pour chacun des 3 tubes de PDL 10X pour rendre PDL 1X. </li><li> Transfert de 30 ml 1X PDL dans la première bouteille. </li><li> Déplacer légèrement jusqu&#39;à ce que toutes les surfaces sont couvertes de croissance. Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Transfert 1x PDL à la deuxième bouteille. Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Répétez l&#39;opération avec les bouteilles troisième et quatrième. </li><li> Rincez tous les quatre bouteilles 2X avec 150 ml stériles H 2 O. </li></ol> PRÉPARER solution enzymatique (ES): <ol><li> Dans un poids de 0,6 ml par tube de centrifugeuse de 0,8 mg de L-cystéine (Sigma C7755), ajouter 150ml et DS vortex jusqu&#39;à cristaux sont dissous. </li><li> Transférer 5 ml DS à un tube de 15 ml conique, puis ajouter 150 ml de L-cystéine. </li><li> Ajouter 50 unités papaïne. (Worthington LS 03126) </li><li> Ajouter 7ml NaOH 0,1. </li></ol> PRÉPARER MEM (Gibco # 11090-081) <ol><li> Retirer 65 ml de la bouteille de 500 ml MEM. Économisez 10 ml pour préparer glucose. </li><li> Ajouter 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> Ajouter 10 ml de glucose 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> Ajouter 50 ml de sérum bovin fœtal (Gibco # 16140-071) ou Bovine sérum de veau (Omega BC-04). </li><li> Mélangez bien, aliquote et conserver à 4 ° C. </li></ol> Neurobasal SUPPLÉMENT MEDIUM/B-27 (NBM/B27) MNB, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Ajouter le contenu entier du flacon B-27 à la bouteille NBM et mélanger. </li><li> Aliquoter et stocker à 4 ° C. </li></ol> DISSECTION du tissu cérébral <ol><li> Dry dissection des outils à partir d&#39;EtOH 70% avant la dissection. </li><li> Transférer 10 ml dans chaque DS de 3-15 ml tube. </li><li> Sélectionnez souriceaux (P0 - P3), vous aurez besoin de trois cerveaux pour 4 bouteilles. </li><li> Ajouter DS à froid de 35 mm boîte de Petri. </li><li> Décapitez souris chiot et disséquer le cerveau. </li><li> Placez le cerveau dans la boîte de Pétri contenant DS froid. </li><li> Hacher les tissus en morceaux, assez petit pour passer à travers une pipette en verre. </li></ol> ENZYME DISSOCIATION <ol><li> Retirez le DS autant que possible de l&#39;antenne avec une pipette Pasteur. </li><li> ES Filtrer à travers une seringue filtre de 0,2 um et 5cc. </li><li> Placez ES dans le plat avec du tissu. </li><li> Incuber les tissus à 37 ° C incubateur (CO 2 gratuits) pendant 30 min. </li></ol> LAVAGE DE TISSUS <ol><li> Tissus de transfert avec pipette en verre pour le premier tube DS, en veillant à obtenir ES peu que possible. </li><li> Centrifuger pendant 30 sec à 1500 rpm. </li><li> Transfert des tissus et la procédure répéter deux fois plus. </li></ol> TRITURATION <ol><li> Placer 38 ml de MEM / FBS dans un tube de 50ml centrifugeuse </li><li> Ajouter 3 ml de MEM / FBS à un plat de 35 mm et le tissu transférer à cette boîte de Pétri. </li><li> Dissocier le tissu par trituration doucement grâce à une astuce eppendorf pipette 1000μl. </li><li> Transfert suspension cellulaire dans le tube contenant 38ml de MEM / FBS et mélangez bien. </li></ol> PLACAGE <ol><li> Placez la bouteille de culture verticale pour obtenir des quantités égales de la suspension cellulaire et des médias dans chaque bouteille. </li><li> Mettez 90 ml de MEM / FBS dans chaque flacon de culture. </li><li> Ajouter 10 ml de suspension cellulaire dans chaque bouteille. </li><li> Label: non-neuronales, les initiales et la date. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> ALIMENTATION <ol><li> Au jour 3 ou 4, les cellules chaudes nourrir avec MEM / FBS (décanter tous les médias et le remplacer par 100 ml de MEM / FBS). Cultures peut prendre 7-10 jours pour devenir confluentes. </li><li> Sur le changement de 7-10 jours les médias pour NBM/B27. </li><li> Le lendemain, recueillir les médias. Filtre avec 0.22μm </li><li> Faire des aliquotes de 40 ml et nourrir la culture avec MEM / FBS. </li><li> Suivant 2 ou 3 jours, le changement des médias pour NBM/B27 </li><li> Le lendemain, recueillir et répéter la procédure. </li><li> Gardez la collecte des médias pour env. 2 semaines. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S9625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibraslicer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassim Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D (+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Media (NBM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invirtogen (Gibco)</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, 1N solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SS266-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0140-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington </td>
<td>LS 03126</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 0.2 &micro;m Syringe Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>DDA02025S0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Coverslips, No1, &#216;12mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bellco Glass Inc.</td>
<td>1943-00012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>11090-081</td>
<td>with Earle's salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>15070-063</td>
<td>for non-neuronal culture</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>16140-071</td>
<td>needed for non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-25</td>
<td>Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass bottom "Imaging dishes"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-10-C</td>
<td>Glass bottomed, &#216;35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures

Cette vidéo va vous guider à travers le processus pour générer des cultures de neurones corticaux de l&#39;embryon et au début de cerveau de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisés pour une variété d&#39;applications, y compris immunocytochimie, biochimie, électrophysiologie, d&#39;imagerie du calcium et de sodium, de protéines et / ou d&#39;isolement d&#39;ARN. Ces cultures fournissent également une plateforme pour l&#39;étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du retard embryonnaire ou postnatale gène létal. La procédure est relativement simple, nécessite une certaine expérience dans la technique de culture de tissus et ne devrait pas prendre plus de deux à trois heures si vous êtes bien préparé. Attention séparation de l&#39;écorce corticale par le tractus de fibres thalamo-cortical permettra de réduire le nombre des grossesses non désirées cellules non-neuronales. Pour accroître les rendements des cellules neuronales triturer les pièces du tissu cortical doucement après l&#39;étape d&#39;incubation enzymatique. C&#39;est impératif car elle prévient les blessures inutiles aux cellules et la mort prématurée de cellules neuronales. Étant donné que ces cultures sont maintenues en l&#39;absence de cellules nourricières glie, ils offrent également un avantage supplémentaire de cultures de plus en plus enrichies en neurones.

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Cette vidéo montre une procédure pour générer cultures de neurones de l&#39;embryon et au début du cortex de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisées pour l&#39;immunocytochimie, la biochimie, l&#39;électrophysiologie, de calcium et de sodium d&#39;imagerie et de fournir une plateforme pour l&#39;étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du gène létal postnatale.

Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

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Biology

43.3K vues.  University of California, Irvine (UCI). Cette vidéo montre une procédure pour générer cultures de neurones de l'embryon et au début du cortex de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisées pour l'immunocytochimie, la biochimie, l'électrophysiologie, de calcium et de sodium d'imagerie et de fournir une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du gène létal postnatale.

Vidéo: Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Recherche

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Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Préparation et entretien des neurones ganglions de la racine dorsale dans les cultures à compartiments

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Préparation des cultures de cerveau de rat d&#39;agrégation pour Neuron et études sur le développement Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Préparation des Aplysie Sensori-motrice cultures de cellules neuronales

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.