Nous remercions le Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) pour son généreux soutien et la supervision de ce travail et M. Kieran Mellody (Université de Manchester, Manchester) pour l&#39;édition critique de ce manuscrit. Ce projet a été soutenu par la recherche au Royaume-Uni (CR-Royaume-Uni) le numéro de subvention C147/A6058 (AO)

1. L&#39;isolement des cultures primaires de fibroblastes humains normaux mammaires Les procédures expérimentales permettant d&#39;isoler cultures primaires de fibroblastes humains normaux mammaires sont décrites dans la Fig. 1A. <ol><li> Préparer le tampon de dissociation cellulaire, comme décrit précédemment 12: Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% sérum de veau foetal (FCS), de pénicilline-streptomycine (200 unités / ml), la collagénase de type I (1 mg / ml) et de l&#39;hyaluronidase ( 125 unités / ml). </li><li> Laver le tissu mammaire disséqué d&#39;une réduction mammaire (~ 0,5 gramme) à plusieurs reprises dans un tampon phosphate salin (PBS). Hacher le tissu en petits fragments (&lt;1,5 mm 3) en utilisant des lames de rasoir stérile. </li><li> Transfert des fragments de tissu dans un tube de 15 ml conique contenant une quantité appropriée de ce qui précède la cellule tampon de dissociation (10 ml par 0,5 gramme de tissu) et le vortex pendant 1 min à vitesse maximale. </li><li> Recueil des fragments de tissu dans la cellule tampon de dissociation fou 12-18 h à 37 ° C avec agitation lente. * Notez que il y aura encore de nombreux morceaux de fragments de tissus non digérés restent dans le tube. </li><li> Incuber le tube pendant 5 min à température ambiante sans agitation. Transférer la résultante cellules stromales enrichi surnageant dans un nouveau tube conique en utilisant une pipette 5 ml sérologique. </li><li> Centrifuger la fraction stroma pendant 5 min à 250 X g et resuspendre le culot cellulaire dans du PBS. Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 250 X g et remettre en suspension les cellules dans du DMEM granulés complété avec 10% de FCS. Culture des cellules dans du DMEM contenant 10% de SVF dans un plat de 15 cm de Pétri à 37 ° C et le dioxyde de carbone de 5%. </li><li> Propager les cellules jusqu&#39;à confluence. Il prend généralement 8-10 jours. Stocker les cellules à -80 ° C en utilisant un milieu de congélation (10% de diméthylsulfoxyde et 20% de SVF en DMEM). Préparer 5 flacons congelés comme un stock initial. Décongelez un flacon et d&#39;élargir les cellules pour préparer 5 flacons pour le stock secondaires contenant des fibroblastes passages dans les 5 de la populationdoublements (PDS) pour les expériences ultérieures. Ces procédures de minimiser la sélection clonale et le stress de la culture qui pourraient survenir pendant la culture de tissus étendus. * Notez que P1.1-7 peut également être utilisé pour isoler les CAF de carcinomes mammaires obtenus par une mastectomie 12. </li></ol> 2. Génération de GFP-étiquetée, puromycine résistant, immortalisée humaine normale fibroblastes mammaires <ol><li> Pour immortaliser le principal fibroblastes humains normaux mammaires isolés dans P1.7), introduire une rétroviraux pMIG (MSCV-IRES-GFP) vecteur 12, exprimant à la fois hTERT et GFP. Culture des cellules pendant 4-5 jours et ensuite trier les cellules positives pour la GFP en utilisant la cytométrie de flux. </li><li> Introduire un rétroviraux pBabe-puro construction codant pour un gène de résistance à la puromycine fibroblastes GFP-étiquetée immortalisé. Culture des cellules pendant 5-7 jours, en présence de puromycine (concentration finale: 1 pg / ml) pour isoler la GFP-positives (GFP +), la puromycine-résistantes (R puro </sup&gt;) humaines immortalisées fibroblastes mammaires. </li><li> Ensuite, pour examiner si ces fibroblastes produisent des virus actifs, ce qui peut conduire au transfert horizontal de gènes codant pour la GFP et résistance à la puromycine, grandir 2.5x10 5 GFP + puro R fibroblastes mammaires humaines immortalisées dans un plat de Pétri de 6 cm pour 2 jours. </li><li> Filtre moyenne conditionnée par ces fibroblastes en utilisant un filtre à seringue (taille des pores: 0,45 um) et l&#39;ajouter sur 10T1 / 2 cellules de souris fibroblastique pour 12h, en présence de sulfate de protamine (5 pg / ml) ce qui augmente l&#39;efficacité de l&#39;infection par le virus. Le milieu est ensuite changé pour 10% de SVF-DMEM pour deux jours supplémentaires. </li><li> Examiner les cellules par un microscope à fluorescence. 10T1 / 2 cellules infectées par le virus de la GFP deviendra GFP-positives. Traiter également les cellules avec puromycine (1 pg / ml) pendant 5-7 jours et observez la plaque le cas échéant puro R 10T1 / 2 sont présents et forment des colonies après le traitement de puromycine. </li><li> Notez que l&#39;horizontal de gènes TRANSFER par des virus actifs produits par la GFP parentale + puro R des fibroblastes mammaires pourrait rendre les cellules environnantes murin et / ou cellules de carcinome GFP + puro R au sein de xénogreffes tumorales. Cela peut entraver le processus d&#39;isolement de la GFP initialement injecté + puro R des fibroblastes mammaires de la xénogreffes tumorales. </li></ol> 3a. Co-injection de fibroblastes humains avec des cellules mammaires carcinome mammaire en une souris immunodéficientes Les procédures expérimentales pour générer des exp-CAF sont illustrés dans la Fig. 1BA. <ol><li> Mélanger 1x10 6 cellules MCF-7-ras des cellules de carcinome du sein et 3x10 6 cellules GFP + puro R, fibroblastes mammaires humaines immortalisées généré en P2.2). Préparer les cellules dans 400 pi de milieu de culture avec 50% (v / v) Matrigel par injection. </li><li> Injecter le mélange cellulaire sous-cutané dans une souris immunodéficientes nude. Lorsque les CAF sont extraites indépendamment par différentstumeurs, l&#39;implant chaque mélange dans les flancs droit et gauche de plusieurs souris. </li></ol> 3b. L&#39;injection de fibroblastes humains mammaires dans une souris immunodéficientes <ol><li> Pour générer les fibroblastes de lutte contre exp-CAF, préparer 3x10 6 cellules GFP + puro R fibroblastes mammaires humaines immortalisées généré en P2.2 dans 400 pi de milieu de culture avec 50% (v / v) Matrigel par injection (fig. 1BB). Ne pas mélanger les fibroblastes avec des cellules cancéreuses. </li><li> Implant des fibroblastes préparés dans des sites sous-cutanés P3b.1 des souris nude. </li></ol> * Notez que les fibroblastes inoculé formeront le tissu fibroblastique tumorale mais pas sous la peau. 4a. Dissection de xénogreffes de tumeurs <ol><li> Euthanasier la souris hébergeant une xénogreffe sous-cutanée humaine de cancer du sein 42 jours post-implantation (Fig. 1BA). * Notez que lorsque d&#39;autres cellules de carcinome et / ou des fibroblastes sont coimplanted, Les fibroblastes peuvent avoir besoin d&#39;être incubé pendant plus de 42 jours dans le xénogreffes de tumeurs de lancer leur phénotype myofibroblastique. </li><li> Récolter les xénogreffes de tumeurs du flanc de la souris par dissection à l&#39;aide de pinces et ciseaux. Immerger le tissu tumoral dans le PBS. </li></ol> 4b. Dissection de xénogreffe fibroblastes <ol><li> Euthanasier la souris porteuse de la xénogreffe fibroblastes 42 jours post-implantation (Fig. 1BB). </li><li> Disséquer la xénogreffe sous-cutanée fibroblastes aide de pinces et de ciseaux. Placer le tissu fibroblastique dans le PBS. * Notez que la xénogreffe fibroblastes, qui apparaît comme un tissu minuscules transparente, peut être difficile à trouver sous la peau. </li></ol> 5. Préparation de cellules primaires en culture à partir xénogreffes <ol><li> Utilisez une armoire stériles biosécurité pour disséquer la tumeur (~ 0,5 gramme) ou d&#39;un tissu fibroblastique (~ 0,1 gramme). Transférer les tissus excisés sur le sommet d&#39;une culture de 15 cm dish avec 1 ml de PBS. Emincez les tissus en fragments de tissu (&lt;1,5 mm 3) en utilisant des lames de rasoir stérile. * Notez que si la xénogreffe fibroblastes pèse moins de 0,1 gramme, de recueillir une xénogreffes quelques fibroblastes supplémentaires et de les mélanger ensemble pour augmenter le nombre de cellules pour l&#39;isolement. </li><li> Transfert des fragments de tissu dans un tube de 15 ml conique contenant la cellule tampon de dissociation (10 ml par 0,5 gramme de tissu) et le vortex pendant 1 min à vitesse maximale. </li><li> Incuber la suspension cellulaire pendant 3 h à 37 ° C avec une agitation lente et continue. </li></ol> 6. L&#39;isolement de la puromycine cellules résistantes à la culture <ol><li> Centrifuger la suspension cellulaire dissociée soit à partir de xénogreffes de tumeurs ou de fibroblastes pendant 5 min à 250 X g et remettre en suspension les cellules dans du PBS à granulés. Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 250 g. X Reprendre le culot dans la cellule résultant 10% FCS-DMEM. Culture des cellules dans un plat de 15 cm de Pétri, en présence de puromycine (1 pg / ml) à 37 ° Cet de dioxyde de carbone de 5% afin d&#39;éliminer tout contaminant cellules de carcinome et / ou les cellules stromales murines. Propager les cellules confluentes jusqu&#39;à (2-4 semaines). Stocker les cellules à -80 ° C en utilisant un milieu de congélation. * Notez que la résultante puro cellules R, désigné 42 jours d&#39;âge exp-CAF1 (fig. 1BA) ou le contrôle des fibroblastes-1 cellules (fig. 1BB), sont immortels et positive pour la GFP. Il est recommandé de vérifier si ces cellules produisent des virus actifs en utilisant 10T1 / 2, tel que décrit dans P2.3-6. </li></ol> 7a. Isolement des exp-CaF2 cellules en culture Pour dynamiser davantage le phénotype activé myofibroblastique du CEFA, mélanger les 42 jours d&#39;âge exp-CAF1 cellules avec MCF-7-ras cellules et les injecter à nouveau sous-cutanée dans une souris nude pour des périodes supplémentaires de 200 jours. Disséquer et dissocier les xénogreffes tumorales dans une suspension mono-culture de cellules et les cellules dans un plat de 15 cm de Pétri avec 10% de SVF-DMEM en présence de puromycine (1 pg / ml), comme indiqué dans P60.1. Propager les cellules confluentes jusqu&#39;à ce (8-10 jours). Stocker les cellules à -80 ° C en utilisant un milieu de congélation. Le résultant R puro cellules sont nommées 242 jours d&#39;âge exp-CaF2 cellules (fig. 1BA). 7b. Extraction de contrôle des fibroblastes-2 de cellules en culture Pour générer les fibroblastes de lutte contre exp-CaF2 cellules, injecter de 42 jours, âgé de contrôle des fibroblastes-1 des cellules seules, sans cellules de carcinome sous-cutanée dans une souris nude de plus de 200 jours. Disséquer et dissocient le tissu fibroblastique dans une suspension cellulaire unique et la culture des cellules dans un plat de 15 cm de Pétri avec 10% de SVF-DMEM en présence de puromycine (1 pg / ml), comme indiqué dans P6.1. Propager les cellules confluentes jusqu&#39;à (3-4 semaines). Stocker les cellules à -80 ° C en utilisant un milieu de congélation. Le résultant R puro cellules sont nommées fibroblastes-2 des cellules témoins (Fig. 1BB). 8. Les résultats représentatifs: Contrôle des fibroblastes-2 et exp-CaF2 cells, qui ont été extraits de xénogreffes de tumeur du sein, teinté fortement positives pour les marqueurs mésenchymateux, y compris les humains spécifiques à la vimentine, prolyl-4-hydroxylase, le collagène 1A, la fibronectine, S100A4, et la protéine de surface des fibroblastes (Fig. 2A) 11, indiquant humaine origine et la nature de ces cellules mésenchymateuses. En revanche, la cytokératine, un marqueur des cellules épithéliales, n&#39;a pas été souillé dans ces fibroblastes GFP + (figure 2B). Ces résultats suggèrent donc que la extraites exp-CaF2 et le contrôle des fibroblastes-2 cellules ont des parents originaires du fibroblastes humains mammaires initialement introduits dans les xénogreffes de souris. Surtout, une proportion plus élevée de exp-CaF2 cellules colorées positives pour α-SMA et de la glycoprotéine de la matrice extracellulaire ténascine-C 5, qui sont tous deux marqueurs de myofibroblastes, comparativement à 42 jours d&#39;âge exp-CAF1 et le contrôle des fibroblastes-2 cellules (Fig. . 2C, D) 11. Ces données indiquent que réside Fibr mammaires humainesoblasts évoluer progressivement en myofibroblastes CAF au sein de xénogreffes tumorales. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> Représentation schématique figure 1 de l&#39;isolement des fibroblastes humains mammaires. A) Le tissu a été haché mammoplastie de réduction en utilisant des lames de rasoir stérile (P1.2) et transféré dans un tube de 15 ml conique (P1.3). Les petits fragments de tissus ont été digérés dans la cellule tampon de dissociation (P1.4) et préparées pour la culture in vitro (P1.5-7). Pour immortaliser l&#39;isolement primaire des fibroblastes mammaires, une pMIG rétroviraux (MSCV-IRES-GFP) vecteur, exprimant à la fois hTERT et la GFP, a été introduit, et la GFP-positives résultant cellules ont été triées par cytométrie en flux (P2.1). Un rétrovirus pBabe-puro vecteur codant pour un gène de résistance puromycine a été ensuite introduit dans ces cellules. Lors du traitement de puromycine, GFP-étiquetée (GFP +) puromycine-résistante (Puro R), immortalised humaine fibroblastes mammaires ont été isolés (P2.2). Ba) Pour générer exp-CAF, la GFP + R puro humaines immortalisées fibroblastes mammaires ont été coinjected avec MCF-7-ras cellules de carcinome mammaire sous-cutanée dans une souris immunodéficientes nude (P3a). La xénogreffe tumorale a été réséqué à 42 jours après l&#39;implantation (P4a) et dissocié en une suspension unicellulaire (P5). Ces cellules ont ensuite été cultivés in vitro en présence de puromycine afin d&#39;éliminer tout contaminant et cellules de carcinome des cellules de souris stromales (P6). Le résultant puromycine cellules résistantes ont été qualifiées expérimentalement généré CAF1 (exp-CAF1) des cellules. Ces cellules, réséqué 42 jours post-implantation, ont été une nouvelle fois mélangé avec MCF-7-ras et les cellules implantées sous la peau dans une souris hôte comme avant (P7A). La tumeur résultant a été autorisé à se développer pour des périodes supplémentaires de 200 jours, puis disséquée, dissocié, et cultivés en présence de puromycine. Les isoléspuromycine cellules résistantes ont été qualifiées de exp-CaF2 cellules (242 jours d&#39;âge). Bb) pour isoler les cellules de lutte contre exp-CAF, la GFP + R puro humaines immortalisées fibroblastes mammaires ont été injectées par voie sous cutanée dans une souris nude comme des cultures pures, sans MCF-7-ras cellules (P3b). Le tissu fibroblastique, disséqués 42 jours post-implantation (P4b), a été dissocié en une seule cellule suspensions (P5) et puromycine cellules résistantes, nommé le contrôle des fibroblastes-1 des cellules, ont été isolés comme décrit précédemment (P6). Ces fibroblastes ont été une nouvelle fois implanté sous la peau dans une souris nude, sans MCF-7-ras cellules de plus de 200 jours (P7B). Le tissu fibroblastique a été disséqué, dissocié, et cultivés en présence de puromycine. Les isolés puromycine cellules résistantes ont été qualifiées de fibroblastes-2 des cellules témoins (242 jours d&#39;âge). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> Figure 2 <strong&gt; Exp-CAF et les fibroblastes de contrôle proviennent des parents humains fibroblastes mammaires. (A) analyses par immunofluorescence de contrôle des fibroblastes-2 (contrôle f.) et exp-CaF2 cellules. Les deux types de cellules positives pour les marqueurs de coloration mésenchymateuses (rouge), y compris les humains vimentine, prolyl-4-hydroxylase, le collagène 1A, la fibronectine, S100A4, et des protéines de surface des fibroblastes. (B) En revanche, le pan-cytokératine, un marqueur des cellules épithéliales , n&#39;est pas détecté dans exp-CaF2 cellules exprimant la GFP (green). Noyaux cellulaires sont colorés avec des 4&#39;-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). La barre d&#39;échelle, 50 um (référés par Kojima et al. 11) (C) par immunofluorescence de cellules exp-CaF2 et le contrôle des fibroblastes-2 des cellules (commande f.) utilisant des anticorps contre α-SMA (rouge) ou la ténascine-C (TN-C) (rouge). Noyaux cellulaires sont colorés au DAPI (bleu). La barre d&#39;échelle, 50 um. (D) 48% des exp-CaF2 cellules positives pour tache de α-SMA, alors une4% de 42-jours-vieille-exp CAF1 et 2,5% des populations de contrôler les cellules de fibroblastes-2 sont positifs pour α-SMA. (Référés par Kojima et al.11)

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le manque de marqueurs spécifiques CAF et le niveau d&#39;hétérogénéité observée entre les CAF rendent la caractérisation de ce type de cellule un défi en soi. CAF étudier in vitro a également été entravée par la complication supplémentaire que ces cellules sénescentes et arrêter la prolifération lorsqu&#39;elles sont cultivées pendant une longue période. Notre tentative précédente pour immortaliser directement CAF primaires en utilisant une construction hTERT rétroviraux ADNc a ...

<table border="1"><tr><td> Nom du produit </td><td> Tapez </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> hyaluronidase </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentine (V9) antibody </td><td></td><td> Laboratoires Novocastra </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> La ténascine C (BC-8) antibody </td><td></td><td></td><td></td><td> un don de Dr <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) antibody </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl-4-hydroxylase </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) antibody </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagène type1 1A anticorps </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-cytokératine d&#39;anticorps </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps fibronectine </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblastes protein-1 spécifiques) antibody </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Protéine de surface des fibroblastes (Clone 1B10) antibody </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP </td><td></td><td></td><td></td><td> Demander aux auteurs de la </td></tr><tr><td> pBabe-puro construire </td><td></td><td></td><td></td><td> Achat à partir Addgene </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tube conique </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Souris nude </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Femme nue RCN </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 cellules </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Les carcinomes sont des tissus complexes composé de cellules néoplasiques et d&#39;un compartiment non cancéreuse appelée la «stroma». Le stroma est constitué d&#39;une matrice extracellulaire (MEC) et une variété de cellules mésenchymateuses, y compris les fibroblastes, les myofibroblastes, cellules endothéliales, les péricytes et les leucocytes 1-3. Le stroma tumoral associé est sensible aux signaux paracrines importante libérée par les cellules de carcinome voisins. Pendant le processus de la maladie, le stroma devient souvent peuplées par un carcinome associé fibroblastes (CAF), y compris un grand nombre de myofibroblastes. Ces cellules ont déjà été extraits de nombreux types de cancers humains in vitro pour leur culture en. Une sous-population des CAF se distingue grâce à leur régulation à la hausse de l&#39;actine musculaire lisse α (α-SMA) l&#39;expression 4,5. Ces cellules sont une caractéristique de «fibroblastes activés» qui partagent des propriétés similaires aux myofibroblastes commonly observée dans les tissus blessés et fibrotiques 6. La présence de ce sous-ensemble myofibroblastique CAF est fortement liée à la haute qualité des tumeurs malignes et associé à un mauvais pronostic chez les patients. Beaucoup de laboratoires, y compris la nôtre, ont montré que les CAF, lorsqu&#39;il est injecté avec des cellules de carcinome dans des souris immunodéficientes, sont capables de promouvoir la tumorigenèse nettement 7-10. CAF préparés à partir de patients atteints de cancer, cependant, subissent fréquemment la sénescence cours de la propagation de la culture en limitant l&#39;ampleur de leur utilisation à travers l&#39;expérimentation en cours. Pour surmonter cette difficulté, nous avons développé une nouvelle technique pour générer des expérimentalement humaines immortalisées lignées cellulaires mammaires CAF (exp-CAF) à partir de fibroblastes humains mammaires, en utilisant un sein coimplantation xénogreffes de tumeurs du modèle. Afin de générer exp-CAF, des parents humains fibroblastes mammaires, obtenues à partir des tissus mammoplastie de réduction, ont d&#39;abord été immortalised avec hTERT, la sous-unité catalytique de l&#39;holoenzyme télomérase, et pour exprimer la GFP et un gène de résistance puromycine. Ces cellules ont été coimplanted avec MCF-7 des cellules de carcinome du sein exprimant un oncogène ras activé (MCF-7-ras cellules) dans une xénogreffe de souris. Après une période d&#39;incubation in vivo, les fibroblastes humains initialement injecté mammaires ont été extraites des xénogreffes de tumeur sur la base de leur résistance à la puromycine 11. Nous avons observé que le résident des fibroblastes mammaires se sont différenciées, en adoptant un phénotype tumoral myofibroblastique et acquis des propriétés favorisant au cours de la progression tumorale. Fait important, ces cellules, définie comme exp-CAF, imitent le phénotype tumoral de promotion de la CAF myofibroblastique isolées de cancers du sein chez des patients disséqués. Notre tumeur xénogreffe dérivés exp-CAF donc fournir un modèle efficace pour étudier la biologie de la CAF dans les Breas humainecarcinomes t. Le protocole décrit peut également être étendue pour générer et caractériser les différentes populations CAF provenant d&#39;autres types de carcinomes humains.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinome associé fibroblastes (CAF) riche en myofibroblastes présents dans le stroma tumoral, jouent un rôle majeur dans la conduite progression tumorale. Nous avons développé un modèle xengraft coimplantation tumeur pour générer expérimentalement CAF à partir de fibroblastes humains mammaires. Le protocole décrit comment établir myofibroblastes CAF qui acquièrent une capacité de promouvoir la tumorigenèse.

Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

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Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K vues.  University of Manchester. Carcinome associé fibroblastes (CAF) riche en myofibroblastes présents dans le stroma tumoral, jouent un rôle majeur dans la conduite progression tumorale. Nous avons développé un modèle xengraft coimplantation tumeur pour générer expérimentalement CAF à partir de fibroblastes humains mammaires. Le protocole décrit comment établir myofibroblastes CAF qui acquièrent une capacité de promouvoir la tumorigenèse.

Vidéo: Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d&#39;ischémie / reperfusion modèle

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

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Médecine

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Human artère mammaire interne (IMA) à la transplantation et stenting: un modèle humain pour étudier le développement de la resténose intra-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Peau biopsie explantation Culture pour la dérivation de fibroblastes humains primaires

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

L&#39;utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Expérimentale transport pneumocoque humaines

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

L&#39;isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Caractérisation des tissus après une nouvelle méthode de désagrégation pour la peau Micro-Greffes Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...