Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Dinman, y compris Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, et Michael Rhodin pour leur aide et leur participation à ce projet. Ce travail a été soutenu par des subventions à l&#39;AM de l&#39;American Heart Association (AHA 0630163N) et à partir du JDD National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL a été soutenue par un réinvestissement américains et Recovery Act de 2009 supplément à la subvention des parents (3R01GM058859-11S1).

1. Préparation d&#39;une cystéine chargé Sulfolink de résine <ol><li> Préparer Sulfolink résine (Pierce) à température ambiante. </li><li> Placer un total de 10 ml d&#39;une suspension de 50% de gel de couplage Sulfolink tel que fourni par le fabricant dans deux flacons de 10 ml en plastique, avec 5 ml distribué dans chaque flacon. </li><li> Centrifuger brièvement flacons à 850 xg et retirez soigneusement surnageants. </li><li> Lavez les trois gel de fois dans le tampon de couplage (50 mM Tris, pH 8,5, EDTA 5 mM) par remise en suspension des billes dans 5 ml, centrifuger brièvement à 850 xg et élimination du surnageant à la pipette. </li><li> Ajoutez cinq ml d&#39;une solution 50 mM de L-cystéine dans le tampon de couplage à chaque tube et mélanger le lisier pendant 1 heure à 25 ° C. </li><li> Enlever le résidu L-cystéine par un lavage comme décrit dans l&#39;étape 1.4 ci-dessus. </li><li> Reprendre le gel dans 10 ml de tampon de liaison [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM de Mg (OAc) 2, 60 mM de NH 4 Cl, 2 mM DTT], et équilibrer la résine par lavage dans 10 ml de tampon de liaison3 fois comme décrit dans l&#39;étape 1.4. Décanter la résine dans une colonne de 10 ml par centrifugation, casquette et conservés à 4 ° C. La capacité de la résine pour la liaison à l&#39;ARN est ~ 20 A 260 unités par ml. </li></ol> 2. Purification chromatographique des ribosomes en utilisant une cystéine chargé Sulfolink de résine Remarque: Si vous travaillez avec une souche où l&#39;activité de la protéase se révèle être un problème, cocktails inhibition des protéases peut être utilisé dans tous les tampons suivants. <ol><li> Maintenir tous les composants sur la glace et préparer toutes les solutions utilisant l&#39;eau sans RNase et la filtration stérile. </li><li> Cultivez les cellules de levure nuit à la mi-phase log (DO 595 = 0,6 - 1,2) dans les médias appropriés. Cellules par centrifugation, et laver les cellules 1 gramme dans le tampon de liaison et centrifuger à 3700 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de liaison à un volume total approximatif de 2 ml, et de perturber l&#39;aide d&#39;un volume égal à 0,5 mm de perles de verre réfrigéré à 4 ° C uchanter une Biospec Mini-perles batteur (Bartlesville, OK). Les échantillons peuvent être divisés en plusieurs tubes, au besoin. </li><li> Retirer les cellules ininterrompue, les organites, et les débris cellulaires par centrifugation à 30000 xg pendant 30 minutes dans une ultracentrifugeuse Beckman-Coulter Optima Max E (Fullerton, CA). </li><li> Immédiatement avant utilisation, granulés de la résine pendant une minute à 1000 xg pour éliminer la solution de stockage. Deux ml de résine est utilisée pour chaque gramme de cellules. </li><li> Retirer surnageants lysat cellulaire de la vrille 30000 xg (S30), en prenant soin de minimiser la contamination soit de la fraction lipidique au sommet ou les débris cellulaires au fond des tubes, et placer directement dans la boue Sulfolink facturés. La couche lipidique peut être évité soit par enlèvement ou en poussant à partir de la pipette, après la pointe a traversé dans le surnageant. </li><li> Incuber le mélange S30/Sulfolink sur la glace sans mélanger pendant 15 minutes. </li><li> Placer les colonnes dans 15 ml tubes coniques et centrifuger à 1000 xg pendantr une minute. </li><li> Placer les fractions accréditives retour dans les colonnes, mélanger à la main, et incuber pendant encore 15 minutes sur la glace. </li><li> Placer les colonnes dans 15 ml tubes coniques et centrifuger à 1000 xg pendant une minute. Jeter les actions accréditives. </li><li> Cap colonnes et ajouter 5 ml de tampon de liaison. Mélanger à la main jusqu&#39;à colonnes resuspendues, enlever les bouchons et centrifuger la centrifugeuse colonnes à 1000 xg pendant une minute. Répétez ce protocole de lavage deux fois plus. </li><li> Ajouter 1,5 ml de tampon d&#39;élution (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM de KCl, 2 mM de DTT, 0,5 mg / ml d&#39;héparine) pour chaque colonne. Mélanger boues à la main, et incuber sur glace pendant 2 minutes </li><li> Placer les colonnes dans de nouveaux tubes coniques de 15 ml et centrifuger à 1000 xg pendant 1 minute. Recueillir l&#39;éluat. Répétez l&#39;étape d&#39;élution fois de plus pour que les derniers volumes de l&#39;échantillon combiné sont ~ 3 ml. Résine utilisée peut être lavée avec un tampon d&#39;élution sans héparine et suivie par équilibration avec Buffe contraignanter, et stockés dans 10 volumes ml de tampon de liaison à 4 ° C pour les réutiliser plus tard. </li></ol> 3. Traitement de puromycine Note: Une méthode alternative pour enlever la contamination des espèces ARNt est de passer d&#39;un glucose riche pour les médias afin de promouvoir le glucose appauvri les eaux de ruissellement des ribosomes. Toutefois, cela ne change l&#39;état métabolique des cellules de levure, ce qui pourrait affecter la fonction du ribosome et la concentration. Pour dépouiller les ribosomes endogènes du peptidyl-ARNt, un traitement avec puromycine est effectuée. <ol><li> Neutraliser à pH 7,5 100 mM solution de puromycine en ajoutant goutte à goutte de KOH 1M à température ambiante. </li><li> Ajouter la solution neutralisée à la puromycine ~ 1 mM concentration finale dans l&#39;éluat. </li><li> Ajouter 100 mM GTP à une concentration finale de 1 mM. </li><li> Incuber pendant 30 minutes à 30 ° C. </li></ol> 4. Purification des ribosomes par sédimentation grâce à des coussins de glycérol <ol><li> Placer un mlde tampon coussin (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM de KCl, 2 mM de DTT, glycérol 25%) dans un tube de 4 volumes ultracentrifugeuse ml en polycarbonate. </li><li> Délicatement la couche puromycine traités fractions d&#39;élution sur le dessus du coussin, et des échantillons de centrifugation à 100.000 xg nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer les tubes de l&#39;rotor de la centrifugeuse, et aspirer surnageants. </li><li> Laver des pastilles contenant des ribosomes purifié deux fois avec 1 ml de tampon de coussin. </li><li> Resuspendre ribosomes dans 100 ul de tampon coussin par des perturbations douces en utilisant une tige de verre. </li><li> Après les perturbations, couvrir les tubes avec du parafilm et agiter à une vitesse modérée dans un tourbillon chambre froide pendant une heure. </li><li> Transférer le contenu dans un tube à centrifuger, centrifuger pendant 5 minutes à vitesse maximale à 4 ° C, et de supprimer les surnageants dans des tubes frais. </li><li> Répétez les étapes 04/01 au 04/07 avec 2 ml de tampon coussin et, sauf que ul 100 de stockage tampon (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM de NH 4 Cl, 5 mM de Mg(OAc) 2, DTT 1 mM, glycérol 25%) est utilisé dans les étapes 4.4 et 4.5 au lieu de tampon coussin. </li><li> Quantifier les ribosomes purifiée par spectrophotométrie (1 A 260 = 20 pmoles de ribosomes de levure), et conserver à -80 ° C. Les résultats typiques d&#39;1 gramme de levure sont de 300 à 400 pmoles de ribosomes. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un exemple d&#39;espèces d&#39;ARN extrait de chacune des trois grandes étapes de ce protocole est montré dans la figure 2. Alors que les ARNr sont les principales espèces présentes dans les lysats cellulaires totaux (T), ces contiennent également un grand nombre d&#39;espèces d&#39;ARN d&#39;autres. Les ribosomes purifiée à partir de la colonne Sulfolink (SL) contiennent également une grande quantité d&#39;ARNt en raison de la forte affinité du lit de la colonne pour ces espèces ainsi. Le traitement de cette fraction avec des résultats puromycine dans l&#39;hydrolyse des peptides issus de la peptidyl-ARNt, et favorise la dissociation de ces espèces de ribosomes. La puromycine échantillons traités (Pm) l&#39;absence de co-purifying espèces ARNt, et représentent donc des ribosomes complètement pur. Comme indiqué précédemment 8, ces ribosomes sont très intact et biochimiquement active, ce qui les rend idéales pour les substrats détaillée des analyses fonctionnelles et structurelles. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Organigramme méthode. Purification chromatographique des ribosomes utilisant la cystéine liée sulfolink résine est représenté. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Représentant l&#39;analyse des préparations ribosome. Espèces d&#39;ARN total ont été extraites à partir de lysats cellulaires totaux (T), Sulfolink ribosomes purifié (SL) et purifiée ribosomes Sulfolink ensuite traité par la puromycine et sédimenté à travers un coussin de glycérol (Pm). Lane M représente la taille des marqueurs ARN. Bandes représentant ARNr 25S et 18S, ainsi que les ARNt et d&#39;autres espèces d&#39;ARN sont indiqués. Tous lesvoies ont été chargées avec 2 ug d&#39;ARN.

<ol>
	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis.">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li><li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system.">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li><li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria.">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li><li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purity,+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method.">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li><li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast:+evidence+for+three+sites.">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis:+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains.">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li><li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells.">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li><li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Protocoles de purification ribosome essentiellement impliquent lyse des cellules, la récolte d&#39;une fraction cytosolique d&#39;une vrille à basse vitesse, puis granulation ribosomes par centrifugation à grande vitesse 1. Bien qu&#39;un peu de nouvelles méthodes ont été utilisées pour la purification de ribosomes bactériens, le même n&#39;avait pas été vrai pour les eucaryotes 2-4. Bien que des mesures supplémentaires ont été ajoutés au fil des années, se lave le sel par exemple, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sulfolink Couplage de résine </td><td> Pierce </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini-batteur billes 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultracentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Légende RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Perles de verre </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> TNT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

Ribosomes eucaryotes sont beaucoup plus labiles par rapport à leurs homologues eubactériennes et archael, posant ainsi un défi important pour les chercheurs. Particulièrement gênant est le fait que la lyse des cellules libère un grand nombre de protéases et nucléases qui peut dégrader les ribosomes. Ainsi, il est important de séparer les ribosomes de ces enzymes aussi rapidement que possible. Malheureusement, les méthodes classiques ultracentrifugation différentielle feuilles ribosomes exposés à ces enzymes pour des périodes trop longues de temps, des répercussions sur leur intégrité structurelle et la fonctionnalité. Pour résoudre ce problème, nous utilisons une méthode chromatographique en utilisant une cystéine chargé Sulfolink résine. Cette application simple et rapide réduit considérablement la co-purifiant activités protéolytiques et nucléolytique, produisant des rendements élevés intacte, les ribosomes levure hautement biochimiquement active. Nous suggérons que cette méthode devrait également être applicable aux ribosomes de mammifères. La simplicité dela méthode, et la pureté améliorée et l&#39;activité des ribosomes purifié par Chromatographie représente un progrès technique important pour l&#39;étude des ribosomes eucaryotes.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l&#39;aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K vues.  University of Maryland. La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l'aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.