LRC-V. souhaite dédier cet article à la mémoire du Dr Adriel Johnson D., un professeur merveilleux, dont la priorité numéro un était toujours à l&#39;éducation des élèves. Tu nous manques, Adriel. Nous sommes reconnaissants à Jacqueline Moreno pour son aide dans l&#39;exécution des expériences décrites dans cette étude. Cette étude a été soutenue par une subvention accordée à CY de la National Science Foundation, MCB-0615390, et par des fonds de démarrage fourni aux voitures LRC-V. de l&#39;Université d&#39;Alabama à Huntsville.

1. Cellule Préparation Extrait gratuit. <ol><li> Deux grammes d&#39;un Escherichia coli sèche culot bactérien obtenu à partir de la mi-log cultures en phase sont lavés, deux fois, avec un demi litre de tampon A contenant 10 mM Tris-acétate, pH 8,0, acétate de magnésium 14 mM, 60 mM d&#39;acétate de potassium et 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride ml (PMSF) par centrifugation à 5000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après le lavage, le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de tampon A. </li><li> Les cellules bactériennes sont perturbés en utilisant une presse française, en appliquant une pression 6000 psi. Cette pression correspond à 600 unités à l&#39;aide d&#39;un piston d&#39;un pouce. La suspension est perturbé recueilli dans un tube de verre propre (50 ml). </li><li> La suspension est traitée perturbé avec 1 mM dithiotréitol (TNT) et est centrifugé à 30000 xg pendant 30 min. La procédure de centrifugation est répétée, en utilisant le surnageant résultant. Le surnageant final est dispensée (1 ml) dans des microtubes. Enfin, les aliquotes sont congelés en utilisant une glace sèche-éthanol ou de l&#39;azote liquide, et sont stockés à -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 2. Préparation des extraits cellulaires gratuit appauvri des RF2. <ol><li> 4,5 ml de billes de protéine A sépharose 4B boue sont mélangés avec 5 ml d&#39;un anti-sérum anti-RF2 utilisant une roue tournant à température ambiante, pendant une heure. Le mélange est centrifugé à 2500 xg pour séparer les perles de l&#39;antisérum. Après élimination du surnageant, ces billes contenant des anticorps anti-RF2 (anti-RF2 perles) sont lavés tard par resuspension dans 1 ml de tampon B contenant 35 mM Tris-acétate pH 7,8, 10 mM d&#39;acétate de magnésium, l&#39;acétate d&#39;ammonium 30 mM, 60 mM de glutamate de potassium et de 5 ug / mL d&#39;inhibiteur de la protéinase leupeptine. Les perles anti-RF2 sont ensuite séparés de tampon B par centrifugation en utilisant les mêmes conditions indiquées ci-dessus. La procédure de lavage est répété deux fois. </li><li> Un ml de l&#39;extrait acellulaire est mélangé avec 150 pi d&#39;anti-RF2 perles en utilisant une roue en rotation, à 4 ° C, pendant deux heures. Le mélange est centrifugé à 10000 xg pour séparer l&#39;extrait acellulaire à partir des perles. Le surnageant est enlevé et traité de nouveau avec une autre uL 150 de l&#39;anti-RF2 perles. Cette procédure est répétée une fois de plus avec la solution d&#39;extrait acellulaire résultant. La solution extrait final sans cellule est dispensé (100 pi) dans des microtubes. Les aliquotes sont congelés en utilisant une glace sèche-éthanol ou de l&#39;azote liquide, et sont stockés à -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 3. Préparation d&#39;une matrice d&#39;ADN. <ol><li> Préparer un 1 mL réaction PCR en mélangeant 600 femtomoles du modèle plasmide contenant les séquences à traduire (Fig 1), avec 0,4 nanomoles de chacun des oligodésoxynucléotides indiqué dans la figure 1, 0,2 micromoles de chaque dNTP et 50 U de Taq- polymérase de l&#39;ADN dans le tampon fourni par Stratagene Co. Effectuer la réaction d&#39;amplification dans les conditions suivantes: 94 ° C pendant 2 min, (94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; pour 30 cycles) et 72 ° C pendant 12 min. </li><li> Purifier le PCR-produits en précipitant l&#39;ADN en ajoutant 1 / 10 volume d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,2, et 2 volumes d&#39;éthanol glacé. Répétez la procédure de précipitation une fois de plus. Resuspendre l&#39;ADN dans 100 ul de diéthyl-pyrocarbonate (DEPC) eau traitée. Typiquement, cette procédure donne 100 ug d&#39;un produit 600 pb d&#39;ADN. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité des produits de PCR par électrophorèse sur gels d&#39;agarose. </li></ol> 4. Préparation de l&#39;ARNm marqué à la biotine. <ol><li> Préparer un uL 100 réaction de transcription in vitro dans l&#39;eau traitée au DEPC en mélangeant 5 ug du fragment d&#39;ADN généré par PCR avec 0,5 micromoles de l&#39;ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de l&#39;UTP, 50 nanomoles de biotine-16-UTP, et 10 pl de mélange de l&#39;enzyme T7 dans le tampon fourni par Promega Co. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 3 heures. Pour quantifier la quantité d&#39;ARNm obtenue, la matrice d&#39;ADN devraient être éliminées en ajoutant sans RNase DNase. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Purifier les produits ARNm en précipitant l&#39;ARN en ajoutant 1 / 10 volume d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,2, et 2 volumes d&#39;éthanol froid. Répétez la procédure de précipitation une fois de plus. Resuspendre l&#39;ARNm dans 100 ul d&#39;eau traitée au DEPC. Habituellement, cette procédure entre rendements 1-2 mg d&#39;une biotine 600 NT étiqueté produit ARNm. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité des produits de la biotine ARNm marqué par électrophorèse sur gels d&#39;agarose. </li></ol> 5. Isolement des ribosomes Traduire Contenant une peptidyl-ARNt. <ol><li> Préparer 500 ul d&#39;un mélange de réaction in vitro de traduction dans l&#39;eau traitée au DEPC en mélangeant 10 à 15 mg de biotine marqué avec 75 nanomoles ARNm de chacune des dix-neuf acides aminés, tous sauf l&#39;acide aminé qui sera remplacé par un acide aminé radioactif , 50 uCi d&#39;un acide aminé radioactif (37MBq), et 20-5<html> 0 ul de RF2 appauvri extrait acellulaire, dans un mélange réactionnel contenant 40 mM tampon Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM d&#39;acétate de magnésium, 175 mM d&#39;acétate de potassium, acétate d&#39;ammonium 10 mM, 2 mM de DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM phosphoénolpyruvate (PEP), 0,3 pyruvate kinase U / ml (PK), le polyéthylène glycol 8000 3,5%, 1 mM spermidine, 20 ug / ml d&#39;acide folinique, et 250 pg / ml d&#39;ARNt de E. coli. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 10 minutes. L&#39;ordre d&#39;addition des composants de la réaction est très important. L&#39;extrait exempt de cellules doit être mélangé d&#39;abord avec la solution tampon contenant les acides aminés et le mélange final incubé pendant 5 min à température ambiante pour permettre l&#39;activation des ribosomes. Plus tard, l&#39;ARNm marqué à la biotine sont ajoutées. Pour les analyses structurelles utilisant les procédures de modification chimique, l&#39;ajout d&#39;un acide aminé radioactif n&#39;est pas nécessaire. </li><li> Ajouter au mélange réactionnel de traduction - 3 mL de billes paramagnétiques de streptavidine (SMB) en suspension dans le tampon C contenant 35 mM Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM d&#39;acétate de magnésium, 175 mM d&#39;acétate de potassium, acétate d&#39;ammonium 10 mM et DTT 1 mM. Incuber la nouvelle suspension à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Séparez les PME à partir du mélange en appliquant un champ magnétique (CM) en utilisant stands séparation magnétique. </li><li> Reprendre le SMB dans le tampon C et séparer les perles à nouveau en utilisant la MF. Répétez cette procédure de lavage deux fois. Resuspendre les perles dans 500 uL de tampon C, stocker la suspension sur la glace, et suivez la procédure suivante immédiatement. </li></ol> 6. Analyse des ribosomes isolé contenant le peptidyl-ARNt. Pour peptidyl-ARNt <ol><li> Mélanger 10 uL de la SMB (en suspension dans le tampon C) avec 10 ul d&#39;un tampon de chargement contenant 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) de glycérol, le sulfate de sodium à 4% de dodécyle, 2 mM de DTT et 0,2 mg / ml de bleu de bromophénol. Résoudre les composants attachés aux billes en exécutant les échantillons dans 10% des gels de polyacrylamide Tris-tricine. </li><li> Sécher les gels d&#39;utiliser un aspirateur de gel-cheveux. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité et la purification du peptidyl-ARNt en exposant le gel séché à un film radiographique. </li></ol> Pour l&#39;ARN ribosomal <ol start="4"><li> Ajouter 190 uL de 2 mM d&#39;éthylènediaminetétraacétate (EDTA) solution préparée avec de l&#39;eau traitée par DEPC, et 200 ul de phénol équilibré avec de l&#39;eau, à 10 ul d&#39;une suspension de billes. Mélanger la suspension par vortex vigoureux et séparer la phase minérale de la phase organique par centrifugation à 10000 xg pendant 3 min à température ambiante. Recueillir la couche d&#39;eau supérieure dans un microtube de nouvelles. </li><li> Précipiter l&#39;ARN à partir de la couche d&#39;eau en ajoutant 1 / 10 volume d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,2, 1 pl de 20 mg / mL de la solution de glycogène, et 2 volumes d&#39;éthanol glacé. Resuspendre l&#39;ARN dans 10 ul de DEPC eau traitée. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité de l&#39;ARN ribosomal par électrophorèse sur gels d&#39;agarose. Habituellement, 50 pl de suspension de billes de rendements 1 pg d&#39;ARN ribosomal. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: La figure 2 présente les résultats d&#39;une série d&#39;analyses de l&#39;évaluation de la qualité et la fonctionnalité des ribosomes traduisant isolé en utilisant la procédure décrite. L&#39;observation d&#39;une bande unique résolus dans des gels de polyacrylamide indique la présence de polypeptides liés à l&#39;ARNm marqué à la biotine attachée à la SMB (figure 2A). La purification de l&#39;ARN ribosomal utilisant cette procédure établit la présence de ribosomes liés à ces ARNm marqué à la biotine, ainsi (figure 2B). Ajout de la puromycine, un antibiotique qui induit l&#39;activité peptidyl-transférase du ribosome, se traduit par le clivage de la naissante peptidyl-ARNt 1. Ceci est observé comme un changement dans le modèle de migration du polypeptide isolé dans des gels de polyacrylamide (figure 2C). Ensemble, ces données indiquent que les ARNm marqué à la biotine attachée à la SMB contiennent des ribosomes fonctionnels avec peptidyl-ARNt. L&#39;isolement des ribosomes traduisant contenant spécifiques peptidyl-ARNt permet l&#39;étude des effets de la peptidyl-ARNt, les antibiotiques et autres molécules, sur la fonction du ribosome (figure 3A), et sur la structure du ribosome (figure 3B). Dans les exemples présentés ici le sparsomycin antibiotiques et l&#39;acide aminé tryptophane (Trp) inhibent le clivage hydrolytique de la naissante CCNT-ARNt peptidyl-ARNt induite par RF2 dans les ribosomes isolés (figure 3A). L&#39;interaction de sparsomycin ou Trp avec le ribosome induit aussi des changements structurels dans certains nucléotides qui constituent l&#39;ARNr 23S du ribosome traduisant (figure 3B). En résumé, le matériel biologique obtenu en utilisant la procédure décrite ici sont utiles dans l&#39;obtention de compréhension supplémentaire des contacts structuraux impliqués dans l&#39;inhibition de la fonction du ribosome lors de son interaction avec divers facteurs moléculaires. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Procédure utilisée pour produire et purifier les ribosomes traduisant contenant peptidyl-ARNt. Fragments d&#39;ADN ca. 650 pb de longueur, contenant le gène CCNT et sa région adjacente, montré dans la figure, sont utilisés comme modèles dans la préparation des ARNm contenant la biotine, [(bio) UMP] ARNm. Ces fragments d&#39;ADN sont produites par des procédures de PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides indiqué en haut de la figure. Les lettres soulignées marquer l&#39;emplacement du promoteur T7 encodés dans l&#39;amorce nucléotidique. Les caractères gras indiquent la séquence de Shine-Dalgarno qui est utilisé dans la traduction de l&#39;ARNm séquences CCNT. Le promoteur T7 dans le fragment d&#39;ADN est reconnue par l&#39;ARN polymérase T7 qui est utilisé pour transcrire (flèche) de la séquence et la CCNT aval séquence non codante. La transcription est terminée lorsque l&#39;ARN polymerase atteigne l&#39;extrémité 3 &#39;du fragment d&#39;ADN, après les séquences de terminaison rpoBC (rpoBC &quot;t&quot;). La structure en tige-boucle du terminateur rpoBC protège l&#39;ARNm de la 3&#39;-5 &#39;activité présente exoribonucléase dans les extraits cellulaires sans utilisé dans les réactions de traduction in vitro. Les isolés [(bio) UMP] ARNm sont utilisés pour générer impasse, les ribosomes traduisant, par des essais de traduction in vitro. La séquence de la CCNT [(bio) UMP] ARNm est traduit par un ribosome qui cale lors du dernier acide aminé est incorporé, en raison de l&#39;absence du facteur de presse (RF2) du mélange réactionnel. Le ribosome [(bio) UMP] complexes ARNm sont isolés du mélange réactionnel total à l&#39;aide de streptavidine magnétique perles (SMB) qui lient les nucléotides marqués à la biotine incorporée dans l&#39;ARNm. Les PME liés au ribosome-[(bio) UMP] complexes ARNm sont extraits du mélange réactionnel total en utilisant un champ magnétique (CM). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Analyses structurales et fonctionnelles des complexes isolés. A) Dans les réactions de traduction in vitro ont été effectués avec [(bio) UMP] ARNm dans laquelle le codon d&#39;initiation du gène de la CCNT a été remplacé par un codon stop. Les produits finaux ont été isolés en utilisant des billes de streptavidine, comme cela est indiqué dans la figure 1. Produits de réaction et des molécules isolées ont ensuite été analysés par électrophorèse sur gels de polyacrylamide. La CCNT-ARNt et des bandes CCNT peptides sont marqués. B) L&#39;ARN total a été isolé à partir des complexes au point mort en utilisant des procédures d&#39;extraction phénol. Chaque ARN isolé a été résolu par électrophorèse en gels d&#39;agarose. ARN ribosomal (ARNr) sont indiqués. C) des complexes isolés contenant CCNT-ARNt ont été incubées avec (+) ou sans (-) 0,02 mM puromycine (Puro) à température ambiante pendant 10 min. Le peptide CCNT étaient étiquetés en cours de traduction en utilisant [35S]-méthionine (A) ou de [3H]-proline (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Analyses structurales et fonctionnelles des ribosomes contenant CCNT-ARNt qui sont liés à l&#39;sparsomycin antibiotiques, ou l&#39;acide aminé tryptophane. A) des complexes isolés contenant CCNT-ARNt ont été incubées avec (+) ou sans (-) sparsomycin (Spar) ou tryptophane (Trp) à température ambiante pendant 5 min. Plus tard, les mélanges ont été mélangés avec RF2 et incubées à 37 ° C pendant 20 min. B) Analyse des changements dans la méthylation de l&#39;ARNr 23S induite par molécules de liaison au sein du ribosome. Complexes isolés ont été pré-incubées avec (+) ou sans (-) 2 mM Trp ou Spar pendant 5 min à 37 ° C. Puis, un agent d&#39;alkylation, le sulfate de diméthyle a été ajouté et le mélange incubé à température ambiante pendant 20 minutes supplémentaires. L&#39;ARN total a été extrait et des dosages d&#39;extension d&#39;amorces ont été effectuées avec un [32P] marquée oligodésoxynucléotide complémentaires aux nucléotides de l&#39;ARNr 23S qui sont espacées de 100 nucléotides en aval du nucléotide modifié. Les produits finaux des essais de vulgarisation ont été résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les nucléotides ARNr 23S affectée par la présence de Trp ou Spar sont indiqués.

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	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

Cette procédure d&#39;isolement décrites dans ce rapport est hautement reproductible. Malheureusement, la présence de courts peptidyl-ARNt produite à partir des séquences mêmes ne peuvent pas être traduits facilement évités; tels peptidyl-ARNt peut correspondre à 15-20% du total des matières isolées (figure 2C). Ces contaminants peuvent augmenter la concentration lors des concentrations plus élevées d&#39;ARNm marqué à la biotine ont été utilisées ou lorsque les extraits acellulaires utilisés sont vieux ou ont été ré-utilisé plusieurs fois. Par conséquent, il est très important de contrôler la qualité et la concentration des composants de la traduction in vitro dans les réactions. Alternativement, une grande efficacité commerciale reconstitué extraits acellulaires sont disponibles qui peuvent être utilisés aux mêmes fins (système PUR) 18. En utilisant cette méthode, la biotine-16-UMP est incorporé au hasard le long de l&#39;ARNm cible. Il ya une possibilité que certains ORF contenant tracts uridine peuvent avoir intégré cette nucléotide modifié dans leurs séquences, affectant leur traduction. Variable concentrations relatives des biotin-16-UTP/UTP doivent être testées lors de la synthèse de l&#39;ARNm en vue d&#39;obtenir la traduction la plus efficace. D&#39;autres méthodes de marquage à la biotine peut être utilisé, en ciblant l&#39;extrémité 5 &#39;, l&#39;extrémité la plus stable de l&#39;ARNm. (I) La biotine peut être attaché à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ARNm en utilisant 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-désoxyadénosine triphosphate) et l&#39;ARN ligase T4 19. (Ii) 5&#39;-end marqué à la biotine oligonucléotide peut être attaché à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ARNm en utilisant l&#39;ARN ligase T4 ainsi 20. (Iii) l&#39;extrémité 3 &#39;marqué à la biotine oligodésoxynucléotides qui correspondent à la séquence complémentaire à l&#39;extrémité 5&#39; de l&#39;ARNm peut aussi être utilisé pour isoler les complexes de traduction. Ces oligodésoxynucléotides biotine pourrait être attachée à la SMB avant l&#39;isolement. Plus tard, le SMB attaché à la marqué à la biotine oligodésoxynucléotides pourrait être mélangé avec le mélange de réaction de traduction pour permettre une interaction avec leurs séquences d&#39;ARNm complémentaires. Après isolement, l&#39;hybride ARN-ADN région - et la région d&#39;hybridation entre les oligodésoxynucléotide marqué à la biotine et la séquence d&#39;ARNm - pourrait être dégradée en utilisant la RNAse H, qui sépare les complexes calé à partir des billes de streptavidine. Cette méthode peut permettre à des complexes d&#39;être employée dans de futures analyses structurelles utilisant les méthodes de résolution plus élevée.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Récemment, des études structurales et biochimiques ont détaillé plusieurs des événements moléculaires qui se produisent dans le ribosome pendant l&#39;inhibition de la synthèse protéique par les antibiotiques et lors de la synthèse polypeptidique naissante. Certains de ces antibiotiques et réglementaires polypeptides naissants principalement sous la forme du peptidyl-ARNt, inhibent la formation soit liaison peptidique ou 1-7 terminaison de la traduction. Ces événements peuvent inhibitrices arrêter le mouvement du ribosome, un phénomène appelé «l&#39;arrestation de translation&quot;. Traduction d&#39;arrestation soit induite par un antibiotique ou un polypeptide naissant a été montré pour réguler l&#39;expression de gènes impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que la croissance cellulaire, la résistance aux antibiotiques, la translocation des protéines et 8-13 métabolisme cellulaire. La connaissance de la façon dont les antibiotiques et réglementaires polypeptides naissants altérer la fonction des ribosomes est essentiel si nous voulons comprendre le rôle complet du ribosome dans la traduction, dans chaque organisme. Ici, nous décrivons une méthodologie simple qui peut être utilisé pour purifier, exclusivement, pour l&#39;analyse, ces ribosomes traduisant un ARN messager spécifique et contenant une peptidyl-ARNt spécifiques 14. Cette procédure est basée sur l&#39;isolement sélectif des ribosomes traduisant lié à un ARNm marqué à la biotine. Ces complexes de translation sont séparés de ribosomes d&#39;autres dans le même mélange, en utilisant des billes paramagnétiques de streptavidine (SMB) et un champ magnétique (CM). ARNm marqué à la biotine sont synthétisés par des analyses de transcription du ruissellement à l&#39;aide de fragments de matrices d&#39;ADN généré par PCR qui contiennent des promoteurs T7 transcriptionnelle. T7 RNA polymérase incorpore biotine-16-UMP de biotine-UTP, dans nos conditions dizaine biotine-16-UMP molécules sont incorporées dans un ARNm NT 600 avec une teneur de 25% UMP. Ces marqué à la biotine ARNm sont ensuite isolés et utilisés dans des essais de traduction in vitro réalisée avec 2 facteur de libération (RF2) appauvri extraits acellulaires obtenus à partir de souches d&#39;Escherichia coli de type sauvage ou contenant des ribosomes mutant. Les ribosomes traduisant l&#39;marqué à la biotine sont des séquences d&#39;ARNm a décroché à la région codon d&#39;arrêt, en raison de l&#39;absence de la protéine RF2, qui accomplit normalement terminaison de la traduction. Bloqués contenant les ribosomes nouvellement synthétisées peptidyl-ARNt sont isolés et retirés de la réactions de traduction en utilisant SMB et un MF. Ces perles ne se lient à la biotine contenant des messages. Les isolés, des complexes de translation, peut être utilisé pour analyser les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de type sauvage ou mutante composants du ribosome, ou peptidyl-ARNt séquences, ainsi que la détermination de l&#39;interaction du ribosome avec des antibiotiques ou d&#39;autres facteurs moléculaires 1,14-16. Pour examiner la fonction de ces complexes isolés ribosome, peptidyl-transférase dosages peuvent être effectués en présence de l&#39;antibiotique puromycine 1. Pour étudier les changements structurels dans les complexes de translation, des procédures bien établies peuvent être utilisées, telles que i) à la réticulation des acides aminés spécifiques 14 et / ou ii) la protection des dosages d&#39;alkylation 1,14,17.

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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d&#39;autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d&#39;ARNm spécifiques en cours d&#39;analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d&#39;intérêt.

Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K vues.  University of Alabama Huntsville. Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

Vidéo: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Recherche

Biologie

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

L&#39;éviscération des corps vitré et la rétine de la souris pour les analyses protéomiques

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.