Nous remercions le Professeur A. Vinogradov et le Dr Vera Grivennikova pour l&#39;introduction des auteurs dans le domaine de la biologie mitochondriale et de nombreuses idées utiles et des conseils dans cette procédure. Les auteurs sont reconnaissants à Mme Amanda McKintock du bureau Université Queens médias pour les aider à la préparation vidéo.

Présentation Les mitochondries du coeur de rat est l&#39;une des préparations les plus courantes pour les études passées et actuelles du métabolisme cellulaire. Ils peuvent être obtenus rapidement et sûrement en grande quantité à partir de type sauvage ou animaux knock-out. La procédure générale se compose de la digestion des tissus par la trypsine, de fractionnement et de centrifugation différentielle. Il ya plusieurs conditions qui doivent être conservés pendant l&#39;isolement des mitochondries de divers tissus, y compris le cœur (fig. 1). <ul><li> Le tissu doit être soigneusement haché, car elle affecte directement le rendement des mitochondries obtenues. Tissu cardiaque est préférable de mâche avec de petits ciseaux courbes et peut être suivie par utiliser un broyeur de tissus Latapie, ou, si un broyeur de tissus ne sont pas disponibles, un presse-ail avec sortie trous d&#39;un diamètre d&#39;environ 1,0 mm de diamètre. </li><li> Il est nécessaire de maintenir la température des solutions à chaque étape. Donc toute la procédure doit être effectuée dans une chambre froide et tous les instruments et les solutions doivent être préparées et refroidies à l&#39;avance. Si les conditions de température ne sont pas restés stables plusieurs propriétés de la préparation peut être perdu. La structure mitochondriale est très sensible à la congélation de sorte overfreezing de la suspension (par exemple lors de la centrifugation) n&#39;est pas permise, surtout si les études de transport actif sont importants. </li><li> Un paramètre important est le temps-durée de la procédure; l&#39;isolement doit être effectuée aussi rapidement que possible et de la préparation obtenue doit être utilisée immédiatement. Par conséquent, des instruments chirurgicaux, des solutions et des appareils doivent être préparés à l&#39;avance. </li></ul> Matériel et instruments Instruments <ol><li> Droit Ciseaux d&#39;exploitation, point pointu </li><li> Ciseaux courbes </li><li> Forceps </li><li> Boîte de Petri </li><li> Petit entonnoir + morceau de filtre en nylon (prélavés) </li><li> 6 béchers de 50 ml </li><li> Deux agitateurs magnétiques et deux bains de glace </li><li> Un grand bain de glace </li><li> 2 petites barres magnétiques </li><li> Spatules à granulés gratter </li><li> Tubes à centrifuger </li><li> Appuyer sur le tissu Latapie (peut être remplacé par presse-ail) </li><li> Téflon-verre homogénéisateurs 20ml et 1-2ml </li><li> Bécher déchets </li><li> Des tubes Eppendorf de suspension mitochondriale finale et des échantillons pour le dosage des protéines </li><li> Bains de glace </li></ol> Solutions (calculé par 2 rats): <ol><li> Tampon de lavage: 0,3 M de saccharose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM d&#39;EDTA (1000 ml) </li><li> Tampons Isolement: 0,3 M de saccharose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (100ml préparés à partir de la mémoire tampon de lavage). L&#39;albumine sérique bovine peut être remplacé par moins chère d&#39;acides gras libres analogues. Le même tampon isotonique ou de ses variations peut être utilisé comme remise en suspension de mémoire tampon. </li><li> La trypsine (Sigma T8003) solution: 2.5mg/ml de 1mM HCl (0,5 mL) </li><li> Inhibiteur de la trypsine du soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de tampon d&#39;isolement </li></ol> Protocole Le régime général de la procédure est indiquée sur la Fig. 1. Coeurs doivent être refroidis et lavés dans laver tissu ventriculaire tampon, excisée, hachée et homogénéisée pendant le traitement à la trypsine photolytique. La suspension est centrifugée à basse vitesse et le surnageant obtenu est centrifugé à nouveau à vitesse plus élevée pour recueillir les mitochondries. Selon les expériences prévues le tampon resuspendant peut être remplacé par n&#39;importe quelle autre solution isotonique. Les animaux ont été résilié en conformité avec le Royaume-Uni &quot;Animals (Scientific Procedures) Act.&quot; par dislocation cervicale suivie par décapitation. Il est nécessaire d&#39;extraire le cœur immédiatement après la décapitation de l&#39;animal, afin qu&#39;il n&#39;y ait aucun délai entre la cessation des animaux et de l&#39;extraction du coeur. Si l&#39;isolement parallèle des mitochondries de foie est attendu, les rats doivent être mis à jeun pendant une nuit avant l&#39;expérience. <ol><li> Préparer trois béchers contenant 40 ml de tampon de lavage. Les refroidir dans le bain de glace-sel pendant 3 à 5 min avant de passer à l&#39;étape suivante. Assurez-vous de ne pas les overfreeze et utiliser immédiatement, juste après les nuages ​​de cristaux de glace commencent à apparaître. </li><li> Ouvrez la cage thoracique du rat décapité et extraire le coeur. Faire de petites incisions et ensuite transférer immédiatement au cœur de la solution glacée dans le bécher d&#39;abord. Presser le coeur d&#39;enlever le sang et le mettre dans le second bécher. Répétez cette opération pour chaque cœur. </li><li> Sécher le cœur sur le papier filtre. Retirez toute la graisse, du sang coagulé, oreillettes et des fascias et la piscine du tissu ventriculaire. </li><li> Emincez les tissus mis en commun avec les petits ciseaux courbes sur le plat de Pétri sur la glace pendant environ 5 min jusqu&#39;à ce que la taille des particules est d&#39;environ 1-2 mm. </li><li> Mettez le tissu hachée dans la presse du tissu et de passerc&#39;est à travers. Soyez conscient qu&#39;une quantité substantielle de la matière peut demeurer dans la presse afin de recueillir tous les tissus du cœur de la parois et le fond de la presse. </li><li> Transférer le matériel dans le bécher avec 50 ml tampon de lavage et remuer. Puis filtrer la suspension à travers un filtre en nylon. Laver les tissus hachés sur le filtre 3 fois avec le tampon de lavage et jeter le filtrat. </li><li> Transfert le tissu lavé dans 20 ml de tampon de lavage et de le placer dans le bain de glace sur l&#39;agitateur magnétique. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine sous agitation constante et lancer le chronomètre. Préparer un autre agitateur magnétique, bain de glace et un second 50 bécher. </li><li> Sur le 4 ème minute brièvement homogénéiser la portion par portion de suspension à l&#39;aide d&#39;un petit vaguement équipée de verre téflon homogénéisateur (10-15ml) avec plusieurs coups de haut en bas pour disperser la suspension. Après homogénéisation de transfert de la suspension dans le second bécher. Répétez la procédure sur la 9 ème minute, de sorte que vous effectuez l&#39;homogénéisation de la suspension de deux fois au total. Après 15 min d&#39;incubation, ajouter 10 ml d&#39;isoler inhibiteur de la trypsine tampon contenant et incuber pendant 1 min. </li><li> Filtrer la suspension à nouveau à travers un filtre en nylon et enregistrez le filtrat. Recueillir la fraction de particules à gauche sur un filtre et homogénéiser pendant 1 min dans 15-20 ml de tampon de lavage. </li><li> Combinez l&#39;homogénat avec le filtrat et centrifuger pendant 15 min à 600g. </li><li> Soigneusement filtrer le surnageant résultant dans un tube de centrifugeuse de nouvelles. Eviter la contamination par le culot et centrifuger à nouveau pendant 15 min à 8500G. </li><li> Après centrifugation à grande vitesse jeter le surnageant et rincer les 2-3 granulés fois avec 1 ml de tampon de l&#39;abandon de la couche blanche duveteuse bord extérieur. Brisez le culot avec la spatule, mais éviter la tache rouge des érythrocytes dans le fond. Si les cellules du sang obtenu Loos, retirez les morceaux rouges de la suspension avant homogénéisation. </li><li> Reprendre le culot avec un homogénéisateur petites ou alternativement par pipetage doux. Diluer la suspension avec plus Isolationbuffer et centrifuger à nouveau pendant 15 min à 8500G. </li><li> Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans du tampon remise en suspension (un tampon isotonique de choix) et centrifuger à nouveau. </li><li> Le brun résultant culot contient lavés mitochondries intactes. Reprendre le culot dans un très petit volume de tampon isotonique de votre choix. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma montrant la procédure étape par étape d&#39;isolement des mitochondries de coeur de rat. Partie supérieure, Étapes 1-9: désorganisation tissulaire, traitement à la trypsine et l&#39;homogénéisation; partie inférieure, les stades 10-15: centrifugation différentielle.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

Détail du protocole rapide pour l&#39;isolement des mitochondries intactes avec un haut degré de couplage est décrit. Préparation obtenue peut être utilisée pour la recherche fonctionnelle ou structurelle sur la bioénergétique cellulaire, les études protéomiques humaines ou des analyses de l&#39;ADN mitochondrial et la teneur en lipides. Des études de biophysique du transport actif des ions et des intermédiaires métaboliques peuvent également être effectuées. Il est possible de continuer à traiter la préparation mitochondriale afin d&#39;isoler les particules submitochondrial, la membrane externe ou purifier des composants séparés de la phosphorylation oxydative. La méthode décrite est une modification du protocole standard de l&#39;isolation par Jacobus et Saks 1. Le rendement attendu de la mitochondrie prêt est d&#39;environ 10-15 mg de protéine mitochondriale par cœur et le rapport de contrôle sur les voies respiratoires malate / glutamate de cette préparation varie entre 8 à 12 ans avec l&#39;État IV de respiration de l&#39;ordre de 0,12 mol O 2 protéines xmin -1 XMG -1 à 23 ° C dans le milieu comprenant 0,25 M de saccharose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM de phosphate de potassium (pH 8,0) avec ADP uM 150 pour l&#39;initiation d&#39;Etat III respiration (pour les conditions exactes d&#39;expérimentation et d&#39;ajouts, voir réf . 2). Une attention particulière devrait être accordée à plusieurs détails techniques avant le départ de la procédure d&#39;isolement. Il est crucial d&#39;utilisation propre polycarbonate ou des tubes à centrifuger en polypropylène, donc les tubes doivent être soigneusement lavés avec un pinceau propre et l&#39;eau chaude, mais le traitement au détergent doit être conservé au minimum. Aussi, il est préférable de prélever toute la verrerie et les instruments nécessaires dans la chambre froide un jour avant l&#39;isolement. Pendant l&#39;isolement lors du transfert des flacons de tampons aux béchers, а une attention particulière devrait être accordée à éviter les chutes d&#39;eau glacée dans les solutions. Lors de la manipulation des tissus, il faut souligner que l&#39;extraction du cœur doit être effectuée dès que possible, car même à court délai entre la décapitation de l&#39;animal et le refroidissement des tissus se traduirait dans les mitochondries partiellement découplées. Le refroidissement rapide et un lavage soigneux des cœurs enlevés est essentiel pour obtenir une préparation standard, libre de l&#39;hémoglobine et des érythrocytes NADase. La trypsine est utilisée pour la dégradation des protéines conjonctif pour augmenter la sensibilité des tissus à force de cisaillement lors de l&#39;homogénéisation. Une exposition prolongée des tissus à la protéase doit être évitée car elle entraîne dans les mitochondries de qualité inférieure. Après centrifugations grande vitesse, les parois des tubes à centrifuger doivent être essuyés avec du papier absorbant pour enlever les dépôts de matériel graisse accumulée sur les murs. Pour la remise en suspension finale, il est préférable d&#39;utiliser un faible volume de la mémoire tampon final, afin de minimiser la perte de fonctions mitochondriales au cours du stockage (150 à 200 pi de la mémoire tampon par cœur). Pour les études du transport des cations divalents chélateurs ne doit être présente dans la préparation finale ainsi mitochondries doivent être lavées plusieurs fois avec EGTA milieu exempt et utilisée dans les premières heures après l&#39;isolement.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

La fonction des mitochondries dans la production d&#39;ATP cellulaire dans le processus de la phosphorylation oxydative est largement reconnue. Durant les dernières décennies il ya eu des avancées significatives dans notre compréhension des fonctions des mitochondries que d&#39;autres la production d&#39;énergie. Il s&#39;agit notamment de leur rôle dans l&#39;apoptose, la signalisation agissant comme des organites, le développement des mammifères et le vieillissement ainsi que leur contribution à la coordination entre le métabolisme cellulaire et la prolifération cellulaire. Notre compréhension des processus biologiques modulés par les mitochondries est basé sur des méthodes robustes pour l&#39;isolement et la manipulation des mitochondries intactes à partir des tissus des animaux de laboratoire. Les mitochondries du coeur de rat est l&#39;une des préparations les plus courantes pour les études passées et actuelles du métabolisme cellulaire, y compris des études sur les animaux knock-out. Nous décrivons ici une méthode détaillée rapide pour l&#39;isolement des mitochondries intactes avec un haut degré de couplage. Une telle préparation du cœur de rat mitochondries est un excellent objet pour la recherche fonctionnelle et structurelle sur la bioénergétique cellulaire, le transport de biomolécules, des études protéomiques et l&#39;analyse de l&#39;ADN mitochondrial, les protéines et les lipides.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Nous décrivons le protocole а pour l&#39;isolement de pur, de coeur de rat fortement couplées mitochondries pour des études fonctionnelles ou structurales de la bioénergétique cellulaire, mesures biophysiques, la protéomique ou l&#39;ADN mitochondrial et l&#39;analyse des lipides.

Préparation de coeur de rat fortement couplées Mitochondries

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

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Research

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Biology

22.7K vues.  University of Manchester. Nous décrivons le protocole а pour l'isolement de pur, de coeur de rat fortement couplées mitochondries pour des études fonctionnelles ou structurales de la bioénergétique cellulaire, mesures biophysiques, la protéomique ou l'ADN mitochondrial et l'analyse des lipides.

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Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantation de l&#39;ingénierie tissulaire dans le coeur de rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Recherche

Biologie

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purification des mitochondries de cellules de levure

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automated Modular High Throughput exopolysaccharide plateforme de criblage Couplé avec très sensible Analyse Glucides d&#39;empreintes digitales

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...