Cette recherche a été soutenue par les subventions des NIH (PN2EY016525 et P41GM103832). SHS a été soutenue par une bourse du Programme du Centre interdisciplinaire de WM Keck Bioscience formation de la Côte du Golfe consortiums (NIH Grant No. T32EB009379) de formation supérieure nanobiologie interdisciplinaire. SHS disséqué, a grandi et DRG et les cellules de l&#39;hippocampe vitrifié; recueilli cryo-EM et données cryo-ET de DRG et les axones de l&#39;hippocampe; reconstruit et couleur annoté de la série d&#39;inclinaison. MRG disséqué et fourni cellules de l&#39;hippocampe dans le laboratoire du MRN. SC assistée en série d&#39;inclinaison annotation. SHS a été formé par CW sur la façon de disséquer et de grandir neurones. SHS, WCM et WC conçus les expériences. SHS a préparé le manuscrit avec la participation d&#39;autres auteurs. Cette vidéo a été filmée au Centre d&#39;imagerie cellulaire et NanoAnalytics (C-CINA) du Biozentrum de til l&#39;Université de Bâle. C-CINA est intégré dans le Département des biosystèmes (D-BSSE) de l&#39;EPF de Zurich, situé à Bâle, en Suisse.

Une. La préparation des plats avec EM grilles pour placage neurones primaires <ol><li> Examiner l&#39;intégrité de carbone troué sur les grilles EM d&#39;or à l&#39;aide d&#39;un microscope optique à un grossissement d&#39;au moins 25X. Assurez-vous que les trous de carbone sont&gt; 98% intact. </li><li> Pour le placage neurones primaires, utiliser un brûleur Bunsen à flamme stériliser les grilles EM et en même temps rendre hydrophile. Utilisez des pinces pour ramasser la grille de EM par son bord, pas la partie quadrillée central. ATTENTION: Ne laissez jamais un brûleur Bunsen allumé sans surveillance, et ne pas utiliser de gants ou des pincettes avec des composants en plastique tout en effectuant les étapes suivantes: <ol><li> Avant d&#39;allumer le brûleur Bunsen, définir les réglages d&#39;air et de gaz à une position d&#39;ouverture minimale. </li><li> Allumer le brûleur Bunsen l&#39;aide d&#39;un silex de l&#39;attaquant ou briquet au butane. </li><li> Modifier les réglages de l&#39;air et de gaz à atteindre une petite flamme intérieure bleue dans un plus grand, plus léger flamme bleue / violette. La pointe de la flamme intérieure est la partie la plus chaude de la flamme. Le bouton sousNeath le brûleur permet de régler la quantité de gaz entrant dans le tube de brûleur, tandis que le canon du brûleur peut être tourné pour ajuster la quantité d&#39;air entrant dans le brûleur. Tourner le réglage de l&#39;air dans le sens horaire diminue l&#39;air (résultant en une flamme violette) et augmente dans le sens antihoraire l&#39;air (résultant en une flamme jaune). </li><li> L&#39;aide de pinces métalliques (pas de pièces en plastique) pour maintenir la grille de EM, passer rapidement à travers la flamme deux fois, face carbone vers le haut. Le côté de carbone apparaît plus mat (moins brillant) et avec plus d&#39;une teinte grisâtre de l&#39;autre côté. </li><li> Transférer immédiatement la grille (carbone vers le haut) dans le centre de l&#39;assiette à fond de verre placé à 10 cm du brûleur Bunsen. Utilisez une grille de EM par plat (figure 1). N&#39;utilisez que des plats à fond de verre qui sont pré-stérilisés, soit par irradiation gamma. </li></ol></li><li> Utiliser un microscope optique pour vérifier l&#39;intégrité de la grille (trous de carbone intact) tout en gardant la grille de EM à l&#39;intérieur du verre Bottplat de l&#39;OM (pour éviter la contamination). Lors de l&#39;application de toute substance sur la grille ou quelque chose qui va entrer en contact avec les neurones, utilisez la procédure stérile et embouts de pipette stériles. </li><li> Dans une hotte de culture de tissu en utilisant la procédure stérile, appliquer 250 ul de la substance d&#39;enrobage approprié lentement et avec précaution à la zone de verre centrale de la boîte de Pétri. Assurez-vous que la substance de revêtement approprié couvre la grille EM entier. <ol><li> Pour les neurones de l&#39;hippocampe, en utilisant la poly-L-lysine (PLL, 1 mg / ml) en tant que la substance de revêtement, préparée comme décrit précédemment 19. Notez que 250 pi sont nécessaires par grille EM, par plat, si l&#39;échelle du lot en conséquence. Pour ganglion de racine dorsale (DRG), utiliser un mélange de protéines gélatineuse sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de la souris (voir le tableau des matériaux et réactifs) que la substance de revêtement, préparer comme suit. Notez que 250 pi sont nécessaires par grille EM, par plat, si l&#39;échelle du lot en conséquence. <ol><li> Décongeler une bouteille dedu mélange gélatineux protéine sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Des cellules de sarcome de souris pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Gardez à froid le mélange de protéines gélatineuse sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de la souris, et tous les composants utilisés pour rendre la solution, c&#39;est à dire en les gardant sur ​​la glace. </li><li> Alors que sur la glace, diluer ce mélange de protéines dans du milieu Neurobasal gélatineux pour obtenir une dilution de 1:20 (à savoir 500 pi de diluer le mélange de protéines gélatineux dans 10 ml de Neurobasal). </li><li> Diviser dilué mélange de protéines gélatineux en aliquotes de 1 ml, et de stocker immédiatement toutes les aliquotes supplémentaires à -20 ° C. </li><li> Appliquer 250 ul par grille EM, par plat, comme décrit à la section 1.4. </li></ol></li></ol></li><li> Couvrir la boîte de Petri avec son sommet et incuber (soit avec PLL pour les spécimens de l&#39;hippocampe, ou avec le mélange de protéines gélatineux pour les spécimens de DRG) pendant 1 heure à la température ambiante sous la hotte de culture de tissu. </li><li> Aspidonner toutes PLL (pour les échantillons de l&#39;hippocampe) ou le mélange de protéines gélatineux (pour les échantillons de DRG) de la vaisselle. Pour ce faire, utiliser le système à vide dans la hotte de culture de tissu. Utilisation d&#39;une pointe de pipette stérile fixé au tube à vide. Eviter le contact direct avec la grille de EM. </li><li> Utiliser une pipette de l&#39;air à déplacement réglable pour appliquer soigneusement 250 ul de PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate) à la grille de EM dans la zone du verre central de chaque boîte de Petri, de telle sorte que la grille EM est entièrement couverte par PBS. Ensuite, aspirer le PBS de chaque plat. Répétez 3x. </li><li> Laissez les plats avec des grilles EM à sécher sous le tissu de la culture capot pendant 15 min. Assurez-vous qu&#39;ils sont complètement secs en cochant au microscope optique dans la chambre de culture de tissus. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;humidité dans la grille. Si c&#39;est le cas, aspirer soigneusement à côté de la grille EM pour éliminer cette humidité supplémentaire. La grille revêtu doit être utilisé immédiatement pour revêtir les neurones. </li></ol> 2. Préparation et PlAting neurones primaires sur EM Grilles <ol><li> Pour plaque neurones primaires, première disséquer, trypsiniser (en utilisant 2,5% de trypsine) et trituration de dissocier l&#39;hippocampe (ou ganglion de racine dorsale des embryons de rat de 18 jours de) dans des cellules individuelles, comme décrit précédemment 19. <ol><li> Triturer est un terme couramment utilisé par les neurobiologistes pour décrire touffes de dissociation de cellules en cellules individuelles, en particulier par l&#39;utilisation d&#39;une pipette en verre avec une pointe polie au feu. Le résultat est obtenu en tirant lentement et avec précaution et la libération des cellules, vers le haut et vers le bas, de multiples fois (~ 30) à travers la pipette. </li></ol></li><li> Suivez procédures décrites précédemment pour DRG dissection et l&#39;isolement cellulaire 24, prenant note d&#39;utiliser 0,25% de trypsine (dans HBSS) pour isoler les neurones DRG de rat, plutôt que d&#39;utiliser les enzymes proposées (papaïne, la collagénase / dispase) qui sont plus adaptés pour la souris neurones de DRG. </li><li> Calculer le nombre de neurones isolés (c&#39;est à dire en utilisant un hématimètre)et utiliser cette valeur pour calculer le volume approprié de cellules à appliquer à chaque plat pour obtenir une concentration de 50 000 cellules / ml par boîte. Le volume maximal à appliquer est de 250 pi. Notez que cela ne remplit la zone centrale en verre, pas tout le plat. </li><li> Incuber les boîtes pendant 30 min dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Permettent aux cellules de se rétablir et adhèrent. </li><li> Ajouter lentement 1,5 ml de milieu réchauffé à chaque plat, en prenant soin de ne pas perturber la grille de EM. Le type de support dépend du type de cellule (ou de l&#39;hippocampe DRG). <ol><li> Préparer le support approprié soit pour les neurones hippocampiques 19 ou dorsales neurones du ganglion de racine 24, qui doit être chauffé dans un bain d&#39;eau à 37 ° C avant de l&#39;utiliser. Incuber les boîtes pendant la nuit dans l&#39;incubateur à CO 2. </li><li> Pour neurones de l&#39;hippocampe, changer les médias le lendemain. Changer la moitié des médias tous les deux jours ultérieurs pendant 14 jours. Réchauffez les médias dans un bain d&#39;eau à 37 ° avant de l&#39;utiliser. </li&gt; <li> Pour les neurones de DRG, le lendemain dissection / placage, préparer un nouveau bilan des médias avec un agent anti-mitotique (uridine et 5&#39;-fluoro-2&#39;-désoxyuridine) faire une solution mère à 10 mM de chacun, séparément; utiliser une finale concentration de 10 uM de chaque. Retirer la moitié des médias de DRG (875 pi) et ajouter 875 ul de milieu frais avec l&#39;agent anti-mitotique. <ol><li> Pour les neurones DRG, tous les deux jours pour la première semaine, suppléant changer de support entre les médias antimitotiques et médias DRG standard. Pour la deuxième semaine, changer de support de standards DRG tous les deux jours. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrification neurones sur EM Grilles <ol><li> Préparer le matériel et tous les matériaux pour la congélation et le stockage des grilles EM d&#39;or à la température cryogénique: un dispositif de vitrification avec une chambre d&#39;humidité 17, pointes fines pinces spécifiques pour la machine de vitrification, point longue et plate pincettes, Dewar (s) de l&#39;azote liquide (LN 2), crécipient oolant, boîte de rangement de grille EM, papier filtre sans calcium. </li><li> Lancer le dispositif de vitrification. Régler le taux d&#39;humidité à 100% et la température à 32 ° C. Dans la section «Console», régler le temps de transfert à zéro seconde. Cela permet de buvard manuel à travers le côté fenêtre de la chambre d&#39;humidité de la machine de vitrification. </li><li> Manipulez le papier filtre sans calcium avec des gants, les couches de telle sorte que trois documents sont empilés. Couper la pile dans 0,5 cm de larges bandes qui sont ~ 2 cm de long. Plier à un angle de telle sorte que d&#39;un côté du papier a un 0,5 cm x 0,5 cm pour le visage (figure 2) à 90 °. L&#39;aide de pinces, retirer le papier du milieu et placez-le sur un autre papier filtre sans calcium jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Mettre le bouton de stockage de grille dans le porte-bouton à l&#39;intérieur de la chambre de vitrification. Remplir la chambre intérieure du conteneur d&#39;agent de refroidissement à l&#39;azote liquide et attendre jusqu&#39;à évaporation complète. Remplir la chambre extérieure de ee conteneur réfrigérant avec de l&#39;azote liquide jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne une température stable pour procéder à l&#39;étape suivante. Remplir la chambre intérieure de haute pureté avec de l&#39;éthane gazeux qui se condense à l&#39;état liquide à l&#39;intérieur de l&#39;enceinte réfrigérée. </li><li> Déplacer l&#39;antenne (s) de l&#39;incubateur, dans une large plat en polystyrène de 100 mm pour le transport vers la chambre de vitrification, s&#39;il n&#39;est pas dans le voisinage immédiat. Utilisez les pinces de vitrification spécialisées à soigneusement choisir la grille EM de l&#39;antenne. Remarque quel côté les neurones se développent sur la grille de EM, la position sera question pour la prochaine étape. Utilisez le verrou coulissant noir sur la pince à épiler pour verrouiller solidement les pinces sur la grille de EM. </li><li> Insérer la pince à épiler dans la machine, tels que la vitrification de côté de la grille EM sur lequel les neurones sont collées les faces de la gauche, à l&#39;écart de l&#39;orifice à ouverture latérale de la machine de vitrification. Rentrez les pinces spécialisées dans la machine de vitrification. </li><li> Placer le récipient de liquide de refroidissement dans le support appropriéde la machine de vitrification. Il doit être rempli avec LN adéquate 2 et de l&#39;éthane liquide. En utilisant la commande appropriée de l&#39;écran de la machine de vitrification, soulever la chambre d&#39;agent de refroidissement vers le haut jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit balayé avec le fond de la chambre d&#39;humidité. </li><li> Avec les pinces à bout plat, saisir un bord de papier filtre de telle sorte que le côté le plus court (les 0,5 cm x 0,5 cm du visage) est perpendiculaire à la pince à épiler. Ce visage entrera en contact direct avec la grille de EM pour blot (figure 2B). Insérez délicatement le papier filtre dans le petit trou de la chambre de l&#39;humidité de la machine de vitrification (figure 2A). Maintenir de manière stable le papier contre la grille EM (le côté opposé à l&#39;échantillon) pendant 10 s. Jeter le papier après et immédiatement plonger-congeler les échantillons dans de l&#39;éthane liquide à l&#39;aide de l&#39;automatisation de la machine de vitrification. </li><li> Soigneusement transférer votre grille EM congelé-hydraté à une des fentes dans l&#39;un desboutons de stockage de grille. Répétez le processus pour les grilles EM supplémentaires dans les plats. Les boutons de stockage de grille EM utilisés dans ces expériences peuvent stocker plusieurs grilles EM congelés hydraté. </li></ol> 4. Collection de l&#39;image, traitement et annotation <ol><li> Procéder pour collecter des micrographies électroniques 2-D et / ou 3-D série 5 d&#39;inclinaison des neurites en utilisant un microscope électronique de cryo-dans des conditions à faible dose. Les images 2-D ont été conçus pour évaluer la qualité de la grille en termes d&#39;épaisseur de la glace et les zones possibles pour être utile pour 3-D série d&#39;inclinaison. <ol><li> Dans ce cas, toutes les images ont été recueillies à l&#39;aide d&#39;une caméra 4k x 4k CCD fixée à un microscope 200 d&#39;électrons kV équipé d&#39;un seul et même titulaire de l&#39;azote liquide de transfert de cryo d&#39;inclinaison, à 20k microscope grossissement sur une cible underfocus de 7 um et d&#39;échantillonnage de 4,4 Å / pixel. </li><li> Pour obtenir une tomographie 3D de l&#39;échantillon, prendre une série d&#39;images de projection tout en inclinant progressivement l&#39;échantillon along un axe du microscope électronique à transmission (MET). Compte tenu des angles d&#39;inclinaison et d&#39;autres paramètres expérimentaux, il existe plusieurs logiciels différents disponibles pour collecter automatiquement la série de basculement 5. La série d&#39;inclinaison 3-D représenté ici ont été collectées sur le même microscope à l&#39;aide de semi-automatisé logiciel d&#39;acquisition de la série d&#39;inclinaison 26 sur une plage de -60 ° à 60 ° dans des incréments de 5 ° avec une dose cumulée de ~ 60 e / A 2. </li></ol></li><li> Reconstruire la série d&#39;inclinaison des neurites en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image 21 comme décrit précédemment pour d&#39;autres échantillons 5,29. </li><li> Color-annoter les caractéristiques en 3-D des neurites par la segmentation de la première tomogramme et la création d&#39;un modèle de surface en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image 3-D comme précédemment décrit 5. </li></ol>

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Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous montrons que le rat neurones embryonnaires (ganglionnaires de la racine dorsale et l&#39;hippocampe) peuvent être cultivées en microscopie électronique or (EM) des grilles et dans la glace vitreuse suffisamment minces pour leurs neurites être imagées à l&#39;aide de 2-D cryo-EM et 3-D cryo- ET. Alors que neurites hippocampe ont déjà été imagées en utilisant cryo-ET 8,10,18,23, un protocole suffisamment détaillée pour reproduire avec succès en utilisant des dispositifs disponibles dans le co...

Les neurones établissent l&#39;essentiel des circuits complexes de la fonction des systèmes nerveux central et périphérique, par l&#39;élaboration de dendrites et des axones recevoir des informations, souvent assez volumineux, de communiquer avec des neurones en aval. L&#39;extension des neurites joue un rôle fondamental pendant le développement embryonnaire et la différenciation neuronale et la maintenance des neurites soutient de manière critique de la fonction du système nerveux. Processus séniles également critique dans les lésions neuronales et de régénération, ainsi que des troubles du système nerveux. L&#39;étude de l&#39;architecture neuronale est crucial de comprendre à la fois le cerveau normal et pathologique. Heureusement, les systèmes de culture de cellules neuronales physiologiquement pertinentes existent qui peuvent récapituler structures cellulaires complexes et hétérogènes. Basé sur l&#39;élucidation des plates-formes expérimentales solides, des stratégies de visualisation efficaces qui permettent des analyses qualitatives et quantitatives de la morphologie des neurones sont nécessaires. Particulièrement utile seraitune méthodologie détaillée qui fournit une plate-forme uniforme pour la visualisation de neurites, les axones et les dendrites à l&#39;échelle du nanomètre. Microscopie électronique traditionnelle nécessite l&#39;utilisation de solvant organique lors de la déshydratation et l&#39;incorporation de résine, ce qui peut induire des distorsions dans les spécimens de leur véritable état. À ce jour, la plupart des caractérisations structurales à l&#39;échelle du nanomètre sont basées sur des cellules plus grandes ou des tissus qui sont soumis à ces produits chimiques agressifs - limitant ainsi l&#39;interprétation des résultats 4,9,25. De plus, pour la pénétration du faisceau d&#39;électrons, le sectionnement est requis pour les organismes cellulaires ou de saillies présentant une épaisseur supérieure à 1 um 12. Enfin, en coupe ou fraisage résultats de tissus dans la collection d&#39;ensembles de données spécifiques aux tranches discrètes, ce qui rend fastidieux la définition de la fonction de forme allongée de neurites. Même pour cryo-EM, dans lequel la coupe d&#39;un échantillon congelé-hydraté est possible, la méthode présente compression artifagit 1. Au cours des dernières années, les chercheurs ont appris à cultiver des neurones d&#39;hippocampe directement sur ​​les grilles EM et le flash-gel dans les éthane liquide pour visualiser la suite neurites en utilisant cryo-ET 8,10,18,23. Toutefois, ces études utilisent soit un dispositif sur mesure 10,23, ou le manque de détails sur l&#39;étape buvard pour générer suffisamment de glace vitreuse mince pour la visualisation de routine 8,18. Par exemple, une étude recommande l&#39;utilisation de 30-40 secondes pour buvard la grille EM 10, mais cette valeur est optimisée pas pour un usage général, mais est spécifique à ce dispositif de plongée gel sur mesure. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif sur mesure plutôt que disponible dans le commerce 17 pour maintenir l&#39;humidité avant de plonger au point de congélation de l&#39;échantillon pourrait constituer un obstacle pour la reproductibilité généralisée. Bien que ces études ont été révolutionnaire dans la visualisation de neurites par cryo-ET, nous avons franchi une nouvelle étape pour explorer l&#39;APplicability de cryo-ET à une variété de spécimens neuronales (neurones de l&#39;hippocampe et le ganglion de la racine dorsale). De plus, nous discutons de deux résultats optimaux et sous-optimaux, ainsi que les artefacts potentiels que l&#39;on peut rencontrer en utilisant cryo-ET pour ces spécimens. Définition d&#39;une technique détaillé pour la préservation et la visualisation des neurites entiers à l&#39;échelle du nanomètre dans un état quasi-native serait de renforcer la capacité pour plus de chercheurs de mener des études ultrastructurales. À cette fin, nous décrivons un protocole efficace et détaillée en utilisant un équipement disponible dans le commerce pour préparer non fixées, les neurones non colorées pour visualiser neurites. Il s&#39;agit d&#39;une première étape importante vers détaillant l&#39;ultrastructure des neurites en bonne santé et de jeter les bases pour comprendre ce que les différences structurelles sont présents dans des modèles de maladies du système nerveux. Depuis cryo-ET peut résoudre non fixées, les caractéristiques de neurites non colorées en 3-D à l&#39;échelle du nanomètre, la méthode permettant de ne jamais êtreavant de définir l&#39;architecture neuritique 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neurites, les dendrites et les axones, sont des processus cellulaires neuronales qui permettent la conduction des impulsions électriques entre les neurones. Définition de la structure des neurites est essentielle pour comprendre comment ces processus qui déplacent des matières et des signaux qui facilitent la communication synaptique. microscopie électronique (EM) a été traditionnellement utilisé pour évaluer les caractéristiques ultrastructurales dans neurites, mais l&#39;exposition au solvant organique lors de la déshydratation et l&#39;incorporation de résine peut fausser les structures. Un objectif important non satisfait est la formulation de procédures qui permettent des évaluations structurelles pas touchés par ces objets. Ici, nous avons établi un protocole détaillé et reproductible pour la croissance et entières neurites flash-gel des différents neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivie de leur examen à la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette technique permet la visualisation en 3-D de neurites, hydratés-congelés à résolution nanométrique, facilitant assessment de leurs différences morphologiques. Notre protocole donne une vue sans précédent du ganglion de racine dorsale (DRG) neurites, et une visualisation des neurites de l&#39;hippocampe dans leur état quasi-native. En tant que tel, ces méthodes créent une fondation pour les études futures sur neurites des deux neurones normaux et ceux qui sont touchés par des troubles neurologiques.

Avant la congélation et l&#39;imagerie par cryo-ET, images au microscope optique devraient être prises de la grille de EM sur lequel les neurones sont de plus en plus. Neurites doivent être clairement visibles sans chevauchement important avec l&#39;autre. Une boîte de couleur dans la figure 3A représente une zone qui est agrandie en montrer un plus fort grossissement de la figure 3B, dans laquelle neurites s&#39;étendent à travers le treillis de la grille. Chaque grille-carré e...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Afin de préserver les processus neuronaux pour l&#39;analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l&#39;échelle nanométrique.

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l&#39;état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K vues.  Baylor College of Medicine.  Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique. 

Vidéo: Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Recherche

Neurosciences

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Préparation d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Les neurones centraux pour<em&gt; In situ</em&gt; Patch de serrage

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

Utilisation de puces microfluidiques plastique prémontées pour compartimenter les neurones murins primaires

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantification spontanée Ca2+ Fluxes et leurs effets en aval dans les neurones midbrains de souris primaires

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...