Ce projet a été financé par le NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), la NSF (# 0905041, # 0079874), le Programme du Texas Advanced Technology (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A &amp; M Research Foundation, Department of Computer Science et génie à la Texas A &amp; M University, et 3Scan. Nous tenons à remercier Bernard Mesa (Micro Star Technologies) pour la consultation technique et de soutien pour l&#39;instrumentation KESM. De grandes parties de la conception et la mise en œuvre du KESM a été réalisé par Bruce H. McCormick, qui mourut en 2007.

1. Préparation des éprouvettes: Golgi-Cox <ol><li> Ce protocole suit de près le protocole de Mayerich et al. 7. </li><li> La souris C57BL/6J est profondément anesthésié à l&#39;aide d&#39;anesthésie par inhalation d&#39;isoflurane et ensuite décapité. </li><li> Le cerveau est enlevé et placé dans une solution de fixation de Golgi-Cox (1% chromate de potassium, 1% de bichromate de potassium, et 1% de chlorure mercurique dans de l&#39;eau déminéralisée). </li><li> Le cerveau est laissé dans la solution de Golgi-Cox dans l&#39;obscurité, à température ambiante, pendant 10 à 16 semaines. </li><li> Les cerveaux sont rincés à l&#39;eau déminéralisée nuit dans l&#39;obscurité. </li><li> Le cerveau rincé est immergé dans une solution d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium à 5% dans de l&#39;eau déminéralisée pour les 7 à 10 jours dans l&#39;obscurité à température ambiante. Cette fois-ci une longue préparation était d&#39;assurer l&#39;infiltration de l&#39;ensemble du cerveau, de sorte que le précipité noir avait une chance pour complètement se forment dans le tissu. </li><li> Le cerveau est à nouveau rincées à l&#39;eau déminéralisée à température ambiante pendant 4 heures et tpoule déshydraté par une série graduée d&#39;alcools éthylique: 50% et 70% dans le réfrigérateur (4 ° C), et 85%, 95% (3 changements), et 100% (4 à 5 changements) à température ambiante. Le cerveau est laissé dans chaque solution pendant 24 heures. </li><li> Le cerveau déshydraté est ensuite mis dans de l&#39;acétone (3 à 4 changements, chacun pour un jour), suivi par un mélange araldite-acétone à l&#39;araldite à l&#39;acétone ratio de 1:2, 1:1, 2:1, et enfin en 100 araldite% (3 changements, chaque fois pendant la nuit), dans le réfrigérateur (4 ° C). </li><li> Enfin, le cerveau traitée est intégré dans l&#39;araldite 100% et chauffée à 60 ° C pendant 3 jours (protocole intégrant cf. Abbott et Sotelo 2). Si les échantillons sont intégrés dans LR blanc, puis les échantillons sont transférés de la solution d&#39;éthanol à 100% par le biais dernière trois changements de LR Blanc solution qui sont chacun conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit, qui est une procédure standard avant la polymérisation. Trois changements sont faits pour assurer l&#39;infiltration complète. Le spécimen est tpoule frais LR transféré à blanc qui est polymérisé dans un récipient fermé à 60 ° C pendant 24 heures, ce qui est le montant requis de temps et la température de polymérisation approprié. </li><li> Fig. 1 montre un cerveau de Golgi-Cox teinté intégré dans l&#39;Araldite. </li><li> Le bloc de spécimen de guérir est ensuite montée sur le ring échantillon métallique à l&#39;aide d&#39;époxy, et les côtés du bloc coupé au besoin (voir fig. 2). </li></ol> 2. Préparation des éprouvettes: Nissl <ol><li> La souris est profondément anesthésié à l&#39;aide de kétamine et de xylazine (1,7 mg de kétamine / xylazine 0,26 mg par 20 grammes de poids corporel) par voie intrapéritonéale injecté puis perfusé transcardiaque utilisant 50 mL de la température ambiante du tampon phosphate salin (pH 7,4), suivi par 250 ml de chambre Température de 10% du formol tamponné neutre (pH 7,4). et enfin avec 3,0 cc d&#39;encre de Chine pur. </li><li> Perfusion du corps entier avec une solution saline et de fixateur est nécessaire pour effacer le sang du système cardio-vasculaire et de fixer le ti<html> es questions. Perfusion avec l&#39;encre de Chine est nécessaire pour remplir complètement la vascularisation du système cardio-vasculaire. </li><li> Le cerveau qui en résulte est ensuite déshydraté par une série d&#39;alcools éthyliques classés (25% -100%), puis intégrées dans le plastique araldite suivant le protocole de 1.8 à 1.9 ci-dessus. Si le blanc est la LR milieu d&#39;inclusion, puis le protocole en 1.10 ci-dessus est suivie. </li></ol> 4. La préparation de l&#39;échantillon: les espèces génériques, les organes générique <ol><li> Pour le cas générique, la fixation peut se faire soit avec 10% de paraformaldéhyde neutres% du formol tamponné ou 4. </li><li> Pour les volumes du tissu de petites, la diffusion, au lieu de la perfusion est recommandé pour la fixation et coloration. Dans le cas des petits organismes ou d&#39;organes, la coloration peut également être fait durant le processus de déshydratation. </li><li> Le protocole intégrant est le même que ci-dessus, bien que les temps d&#39;infiltration solution peut être réduite pour les organes ou organismes qui sont beaucoup plus petits que le cerveau de souris ensemble. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. KESM configuration et l&#39;imagerie <ol><li> Arrêter la pompe, tourner sur scène, tourner la caméra, allumez l&#39;illuminateur. </li><li> Soulever un couteau et objective. </li><li> Installez anneau de spécimen. </li><li> Mesurer la dimension éprouvette et de créer un fichier de configuration pour l&#39;application scène KESM Controller2. </li><li> Départ de l&#39;étape KESM Controller2 et initialiser la scène. </li><li> Basse couteau / objectif, tournez sur la pompe. </li><li> Point de vue objectif et la caméra, en tournant le bouton de mise sur le train optique et en ajustant champ de la caméra de vue par rapport à l&#39;arête du couteau. </li><li> Appuyez sur [Go] pour lancer l&#39;imagerie. </li><li> Voir fig. 3-8. Voir 9, 7 pour les détails techniques. </li></ol> 6. Traitement d&#39;image et de préparation des données <ol><li> Copiez le fichier exécutable du processeur KESM pile dans le dossier de données dans le dossier du fichier de configuration (00000, 00001, etc.) </li><li> Exécutez le processeur Stack KESM pour enlever des artefacts d&#39;éclairage et de normaliser l&#39;intensité de fond dans tous lesimages. Répétez l&#39;opération pour tous les sous-dossiers de données. </li><li> Préparer les tuiles multi-échelle de l&#39;ensemble des données et de télécharger et mettre en place les fichiers dans le serveur Web de l&#39;Atlas du cerveau KESM. </li><li> Voir Fig. 9. </li></ol> 7. La visualisation des données et l&#39;analyse <ol><li> Visualisation à l&#39;aide de l&#39;atlas du cerveau KESM. Aller à la <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> et sélectionnez l&#39;atlas approprié. <ol><li> Naviguer comme dans Google Maps. </li><li> Zoom avant et arrière comme dans Google Maps. </li><li> Pour aller à une profondeur différente, sélectionnez la profondeur pour aller à chaque étape à partir du menu déroulant, puis cliquez soit sur [+] ou [-] pour augmenter ou diminuer la profondeur z. </li><li> Ajustez le nombre de superposition en utilisant le menu déroulant. </li><li> Réglez l&#39;intervalle de superposition en utilisant le menu déroulant. </li><li> Voir Fig. 11. </li></ol></li><li> Visualisation à l&#39;aide MeVisLab. <ol><li> Lancement MeVisLab. </li><li> Créez un nouveau projet. </li><li> Dans la suite, de nouveaux modules peuvent être créer par Typing dans le nom du module dans la boîte de commande. </li><li> Créer le module [Compose3Dfrom2DFiles], et aller vers le dossier souhaité. Entrez la chaîne de fichier et cliquez sur [GetFileList]. Assurez-vous que les images sélectionnées peuvent tenir en mémoire. Cliquez sur [Create3D] pour créer du volume. </li><li> Créer le module [SetWorldMatrix], et réglez le &quot;Scale&quot; sous &quot;élémentaire Transforme&quot; x, y, z pour la taille de voxel appropriée (0,6, 0,7, 1,0 pour un objectif 10X 0.45NA). Lien [Compose3Dfrom2DFiles] à [SetWorldMatrix]. </li><li> Set Matrix et se transforme sous &quot;composition de la matrice&quot; à &quot;Ignorer&quot;, &quot;Ignorer&quot;, &quot;Forward&quot;. </li><li> Créer le module [Arithmetic1] et réglez la &quot;Fonction&quot; pour &quot;Inverser (Max-Img)&quot;. Lien [SetWorldMatrix] à [Arithmetic1]. </li><li> Créer le module [View3D] et connectez [Arithmetic1]. </li><li> En View3D, alors que le bouton droit de la souris est enfoncé, déplacez la souris pour ajuster le seuil. Vous pouvez rogner les régions, l&#39;orientation du changement (déplacez la souris alors que le bouton gauche de la souris est pressé), l&#39;éclairage du changement (renderin volumesg ou PIM), activer / désactiver de fond, etc </li><li> Voir Fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Ici, nous présentons l&#39;ensemble du cerveau de données et d&#39;informations. Figues. 12-15 montrent toute-encéphalique encre de chine, de Golgi et de Nissl ensembles de données 1, 4, 3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" /> Figure 1. Cerveau de souris fixés, colorés, et embarquées <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" /> Figure 2. Embarqué échantillon de cerveau de souris monté sur la bague spécimen. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" /> Figure 3. Le microscope à balayage Knife Edge (KESM). Une photo de l&#39;KESM est montré avec ses principaux composants marqués: (1) l&#39;assemblage ligne à grande vitesse de balayage la caméra, l&#39;objectif de microscope (2), (3) un couteau de diamant et collimateur de lumière, (4) SPERéservoir Cimen (pour l&#39;imagerie immersion dans l&#39;eau), (5) à trois axes de précision à coussin d&#39;air étape, (6) illuminateur de microscope à lumière blanche, pompe à eau (7) (dans le dos) pour le prélèvement de tissus sectionnés, (8) PC serveur pour le contrôle de la scène et d&#39;acquisition d&#39;image, base de granit (9), et le pont de granit (10). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" /> Figure 4. Principes de l&#39;imagerie KESM. Le principe de fonctionnement de KESM est illustré. L&#39;objectif et le couteau est maintenu en place, tandis que le spécimen apposé sur le stade de positionnement se déplace (flèche avec une ligne solide) à la résolution de 20 nm et la vitesse de déplacement de 1-5, et obtient raclait le couteau de diamant (5 mm de large pour objectif 10X), générant une section mince s&#39;écoulant sur le couteau (flèche avec une ligne solide). Ligne-scan imagerie se fait à proximité de la pointe du couteau. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" /> Figure 5. KESM appareil et l&#39;objectif de contrôle mise au point. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" /> Figure 6. Assemblée couteau KESM et les contrôles. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" /> Figure 7. Initiale se concentrant sur ​​le port d&#39;observation. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" /> Figure 8. Controller Stade KESM 2 application (capture d&#39;écran). <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" /> Figure 9. Demande KESM processeur pile (screenshot). <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" /> Figure 10. Demande MeVisLab (screenshot). <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" /><br/&gt; Figure 11 KESM Atlas du cerveau:. Interface web (screenshot). <img alt="Figure 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" /> Figure 12. KESM ensemble du cerveau des données encre de Chine. Volume de visualisations de données KESM piles sont présentés pour l&#39;ensemble des données vasculaires. (A) Gros plan sur les données vasculaire. Largeur ~ 100 um. (Bd) Trois vues standard de l&#39;ensemble de la vascularisation du cerveau de souris (sous-échantillonné à partir des données haute résolution). Largeur ~ 10mm. <img alt="Figure 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" /> Figure 13. KESM ensemble du cerveau de souris de données de Golgi. <img alt="Figure 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" /> Figure 14. KESM Golgi détail des données. <img alt="Figure 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" /> Figure 15. KESM ensemble du cerveau des données de Nissl. (A) Gros plan sur la Ndes données ISSL. ~ 300 um 3. (Bd) Trois vues standard de l&#39;ensemble des données de la souris Nissl cerveau (sous-échantillonné à partir des données haute résolution). Coupe transversale indiquée pour une vision claire des structures internes.

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	<li>Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+whole+small+animal+brains+with+the+knife-edge+scanning+microscope.">High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).</li><li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices.">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging,+analysis,+and+integration+of+mouse+brain+networks.">Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).</li><li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure:+Neurons+and+vasculatures.">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy:+High-throughput+imaging+and+analysis+of+massive+volumes+of+biological+microstructures.">Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures.</a> High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope.">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM.">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li><li>McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Brain+Tissue+Scanner.">Development of the Brain Tissue Scanner.</a> Technical Report. , (2002).</li><li>Sporns, O., Tononi, G., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+connectome:+A+structural+description+of+the+human+brain.">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li></ol>

Todd Huffman est avec 3Scan, une société commerciale qui fabrique et commercialise la technologie KESM (brevet américain 6,744,572 #).

Le KESM permet pour une enquête submicroniques niveau de grands volumes d&#39;échantillons biologiques (~ 1 cm 3). Ce type de volume est suffisant pour contenir l&#39;ensemble des organes des petits animaux, tels que le cerveau, les poumons, cœur, rein, etc images numérisées à partir d&#39;organes peuvent fournir sans précédent, des informations quantitatives sur l&#39;organisation structurale de ces organes, et de permettre la modélisation computationnelle des fonctionnelles diverses aspects de ces organes, y compris la dynamique du circuit et le réseau, propriétés électriques, fluide et dynamique de l&#39;écoulement de l&#39;air, et la dynamique musculaire. Le protocole de préparation des échantillons et de post-analyse de protocole détaillé dans cet article sont attendus pour aider les groupes de recherche en dehors d&#39;avoir plus facilement accès à l&#39;KESM et les données résultantes. Le protocole de coopération KESM aidera ces chercheurs externes à apprécier les avantages et les limites de cette modalité d&#39;imagerie unique.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy

Des avancées majeures dans le haut débit, haute résolution, des techniques de microscopie en 3D ont permis l&#39;acquisition de gros volumes de données neuroanatomiques à la résolution submicroniques. Un des premiers instruments tels la production entière-cerveau-données à grande échelle est le microscope à effet couteau (KESM) 7, 5, 9, développé et hébergé dans le laboratoire des auteurs. KESM a été utilisé pour la section et le cerveau de souris l&#39;image entière à la résolution submicroniques, révélant les détails complexes des réseaux neuronaux (Golgi) 1, 4, 8, les réseaux vasculaires (encre de Chine) 1, 4, et la distribution du corps cellulaire (Nissl) 3 . L&#39;utilisation de KESM n&#39;est pas limitée à la souris ni le cerveau. Nous avons réussi à imager le cerveau 6 poulpes, des poumons de souris, et le cerveau du rat. Nous travaillons actuellement sur l&#39;ensemble des embryons de poisson zèbre. Des données comme celles-ci peuvent grandement contribuer à la recherche connectomics 10; à la microcirculation et de la recherche hémodynamique et à la recherche par les dispositions stéréologieDing an. exacte réalité de terrain Dans cet article, nous allons décrire le pipeline, y compris la préparation des échantillons (fixation, coloration, and Embedding), la configuration et l&#39;installation KESM, de sectionnement et d&#39;imagerie avec le KESM, traitement d&#39;image, la préparation des données et la visualisation de données et d&#39;analyse. L&#39;accent sera mis sur la préparation des échantillons et la visualisation / l&#39;analyse des données obtenues KESM. Nous prévoyons que le protocole détaillé présenté dans cet article pour aider à élargir l&#39;accès à KESM et augmenter son utilisation.

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Le processus complet de préparation des échantillons à l&#39;imagerie cérébrale coupes sériées en utilisant le microscope à effet couteau, à la visualisation de données et d&#39;analyse est décrite. Cette technique est actuellement utilisée pour acquérir des données cerveau de souris, mais il est applicable à d&#39;autres organes, d&#39;autres espèces.

Protocoles de préparation des échantillons, d&#39;imagerie et d&#39;analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.5K vues.  Texas A&M University. Le processus complet de préparation des échantillons à l'imagerie cérébrale coupes sériées en utilisant le microscope à effet couteau, à la visualisation de données et d'analyse est décrite. Cette technique est actuellement utilisée pour acquérir des données cerveau de souris, mais il est applicable à d'autres organes, d'autres espèces.

Vidéo: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Recherche

Bio-ingénierie

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Microscopie à balayage vidéo confocale et à taux Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Imagerie hybride μCT-FMT et l&#39;analyse d&#39;image

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...