Cette technique de microscopie électronique en volume est utilisée pour effectuer des études biologiques qui nécessitent l’observation d’une structure 3D. Offrir une tige, une vue fielder et un stockage d’échantillon avant la reprise de l’image. Fx2 Asan a conçu les étapes de chemin qui catalyse la désabilation pour augmenter le test électronique des structures cibles et peut être utilisé pour localiser une cible spécifique d’intérêt.
Ces particules combinent l’utilisation de la lumière corrélative et de la technique de microscopie électronique 3D pour étudier les interactions entre les organites mémbraneux et les cellules hôtes. 16 à 24 heures après la transfection, laver doucement la culture avec 250 microlitres de 30 à 37 degrés Celsius solution de fixation. Remplacer rapidement le lavage par 1,5 millilitres de solution de fixation fraîche et placer la culture sur la glace pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, rincer les cellules avec trois lavages de dix minutes dans un millilitre de tampon de cacodylate de sodium molaire de 0,1 molaire par lavage. Après le dernier lavage, ajouter un millilitre de glace froide de 0 à 4 degrés Celsius 20 millimolaire solution glycine au plat pour une incubation de dix minutes sur la glace suivie de trois lavages de cinq minutes avec un millilitre de frais, froid 0,1 tampon de cacodylate de sodium molaire par lavage. Ensuite, étiquetez les cellules avec 500 microlitres de solution DAB fraîchement préparée.
Et incuber les cellules sur la glace pendant environ cinq à quarante-cinq minutes. Lorsqu’une tache brun clair est visible sous un microscope léger inversé, rincer les cellules trois fois avec un millilitre de tampon cacodylate de sodium frais et froid de 0,1 molaire pendant dix minutes par lavage. Ensuite, utilisez un microscope inversé à contraste de phase pour visualiser la coloration DAB à un grossissement 100 fois ou plus et marquer le fond de la vitre où se trouve la région d’intérêt.
Pour la préparation de l’échantillon de bloc de microscope électronique, d’abord post-fixer les cellules avec un millilitre de 2% réduit tétoxyde d’osmium pendant une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de la fixation, rincer les cellules avec trois lavages de cinq minutes et un millilitre d’eau fraîche distillée par lavage. Avant de traiter les cellules avec un millilitre de solution tch filtrée pendant 20 minutes.
À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans de l’eau distillée comme vient de le démontrer et fixer les cellules avec une incubation de 30 minutes en tétroxyde d’osmium réduit de 2 %. À la fin de la deuxième fixation, laver les cellules trois fois avec de l’eau distillée et couvrir la culture d’un millilitre d’acétate d’uranyle aqueux pendant la nuit à 4 degrés Celsius protégé de la lumière. Le lendemain matin, lavez les cellules trois fois avec de l’eau distillée avant de les soutrer avec un millilitre de 60 degrés Celsius réchauffé la solution aspartate de plomb de Walton pendant 30 minutes dans un four de 60 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans de l’eau distillée. Et incuber la culture dans une série classée de 20 minutes 2 millilitres d’éthanol aliquots. Après la dernière exposition à 100 % d’éthanol, incuber les cellules pendant 30 minutes en un millilitre de trois à un mélange d’intégration d’éthanol à faible viscosité à température ambiante.
À la fin de l’incubation, remplacer le milieu par un millilitre d’éthanol en tête-à-tête au milieu du mélange d’intégration à faible viscosité pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. Ensuite, remplacez le milieu par un millilter d’éthanol un à trois à faible viscosité intégrant le mélange moyen pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. Ensuite, remplacez le milieu par un millilitre de viscosité 100% faible intégrant milieu pendant la nuit, suivi de l’intégration de l’échantillon dans le mélange d’intégration de viscosité 100% faible pendant 24 heures à 60 degrés Celsius.
Pour l’analyse de la microscopie électronique de transmission, le lendemain, utilisez une microtome ultra pour obtenir des sections de 90 nanomètres d’épaisseur et observer la grille sous microscopie électronique de transmission à 200 kilovolts. Avant de commencer la préparation de l’échantillon, nettoyez les couvercles en verre enduits d’oxyde d’étain Indium avec une légère agitation dans l’isopropanol pendant 30 à 60 secondes. À la fin de l’agitation, égoutter l’excès d’alcool et placer les coverslips dans un environnement exempt de poussière.
Lorsque les coverslips sont secs, utilisez un revêtement plasma pour faire briller les coverslips pendant une minute. Insérez ensuite les couvercles dans le support du substrat et placez le support de substrat dans le bateau à couteaux. Pour obtenir des échantillons de microscopie électronique à balayage, insérez le bloc d’échantillon intégré dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome.
Et placez le support dans le bloc de coupe. Utilisez une lame de rasoir pour couper l’excès de résine autour de la position cible de sorte que la face du bloc acquiert une forme trapézoïde ou rectangulaire. Les bords de tête et de suivi doivent être strictement parallèles les uns aux autres.
Il n’est pas facile d’acquérir un grand nombre de sections en série. Cependant, vous devez avoir les bords d’attaque et les bords de suivi complètement parallèles. Ensuite, insérez le porte-échantillon dans le bras de l’ultramicrotome.
Placez le couteau à diamants dans le porte-couteau et remplissez le bateau-couteau d’eau distillée filtrée. Ensuite, poussez soigneusement la poignée du support pour ajuster la position du transporteur de sorte que le bord des coverslips est proche du couteau. Après avoir obtenu l’échantillon, arrêtez le processus de section, ouvrez lentement la vis de serrage du tube et égouttez le bateau à eau.
Lorsque le processus de collecte du ruban est terminé, retirez le substrat avec la poignée du dispositif de serrage et séchez le ruban. L’utilisation de plasmides génétiquement marqués exprimant des protéines d’intérêt, permet l’identification des cellules cibles transfectées après coloration pour les protéines étiquetées. La microscopie électronique de lumière corrélative peut alors être utilisée pour visualiser davantage la culture cellulaire étiquetée.
Par exemple, la tache foncée générée par SCO1-APEX2 est observée exclusivement dans l’espace intermembrane mitochondrial et non dans l’espace matriciel des mitochondries. Les cellules transfectées de code avec les plasmides SCO1-APEX2 et HRP-KDEL expriment un signal électronique très dense dans l’espace intermembrane mitochondrial et le réticulum endoplasmique. Cependant, aucune coloration endoplasmique de reticulum n’est observée dans les cellules qui sont transfectées avec SCO1-APEX2 seulement.
Pour l’imagerie en série en scannant la microscopie électronique, une vue d’ensemble de l’image de l’ensemble du tableau est créée à l’aide d’un détecteur d’électrons rétrocifuge sur une grande surface. Ensuite, la région d’intérêt est placée dans la première section et propagée à toutes les autres sections. Enfin, la région d’intérêt contenant cinq cellules cibles est photographiée avec cinq pixels image nanométriques.
Le grossissement révèle des structures subcellulaires détaillées telles que l’appareil de Golgi, les mitochondries et le réticulum endpolasmique. L’imagerie en série révèle clairement que les contacts endoplasmiques reticulum-mitochondries se produisent sur différents z-planes. Vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de localiser une structure cible spécifique à l’aide de la lumière corrélative et de la microscopie électronique pour étudier les effets d’une modification spécifique de l’identité.
Ces techniques de coloration combinées à la microscopie électronique en volume pourraient être utilisées pour une EM à plus grande échelle afin d’étudier les interactions cellulaires, en particulier dans l’eurovirus. Rappelez-vous le glutaraldehyde, également enteterocide et TCH sont très toxiques, alors assurez-vous de porter des vêtements de protection et de travailler dans une hotte de fumée lors de l’utilisation de ces matériaux.
