Nous remercions le Dr T. Helleday et le Dr E. Petermann de l&#39;aide pour la technique des fibres ainsi que des membres du laboratoire de discussion utile. WN est soutenu par une bourse de recherche internationale senior de l&#39;Association for Cancer Research International et par le Comité d&#39;État polonais pour la recherche scientifique subvention (165 935 N301).

La méthode décrite ici a été utilisé dans la publication suivante: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 culture cellulaire Matériaux: sérum fœtal bovin (FBS), du sérum de poulet, de pénicilline / streptomycine, 2-mercaptoéthanol, RPMI <ol><li> Préparer milieu de culture cellulaire: ajouter 7% de FBS, le poulet 3% de sérum, 1x pénicilline / streptomycine et 10 pM de 2-mercaptoéthanol à un milieu RPMI. </li><li> DT40 cellules sont cultivées dans des flacons stériles de culture de cellules à 38 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. Fractionner les cellules chaque jour à une densité de 5 x 10 5 cellules / ml 6. </li></ol> 2. Marquage in vivo Matériaux: UDI, CldU <ol><li> Préparer des solutions étalons d&#39;analogues de nucléotides: dissoudre UDI à 5 mm et CldU à 2,5 mM dans le milieu. Chauffer les deux solutions brièvement à 60 ° C et jusqu&#39;à ce que le vortex analogue nucléotidiqueUES sont complètement dissous. </li><li> Ajouter UDI à une concentration finale de 25 pM à la croissance exponentielle des cellules DT40 et mélanger la suspension cellulaire ainsi. Incuber les cellules pendant 20 minutes à 38 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après incubation avec la première étiquette, ajouter CldU à une concentration finale de 250 uM et de traiter les cellules comme décrit dans l&#39;étape précédente. </li><li> Laver les cellules avec de la glace du PBS froid et les remettre en suspension à une concentration de 7,5 x 10 5 cellules / ml dans du PBS froid. Gardez les cellules marquées sur la glace. </li></ol> La procédure d&#39;étiquetage décrites n&#39;est qu&#39;une suggestion et peut être modifié pour répondre aux questions spécifiques. S&#39;il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus d&#39;informations sur le design expérimental. 3. Lyse des cellules et l&#39;ADN propagation Matériaux: lames de verre, fibre de solution de lyse <ol><li> Préparer la solution de lyse des fibres: 50 mM d&#39;EDTA et 0,5% de SDS dans 200 mM Tris-HCI, pH 7,5 </li><li&gt; Spot 2 ul de la suspension cellulaire à une extrémité de la lame de verre. Sécher à l&#39;air pendant 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que le volume de la goutte est considérablement réduit, mais non secs. </li><li> Pipet 7 solution de lyse ul sur le dessus de la suspension cellulaire et remuer doucement avec la pipette pour mélanger les solutions. Incuber pendant 2 minutes pour la lyse cellulaire de procéder. </li><li> Tilt diapositives à 15 ° pour permettre aux fibres de se propager le long de la glissière. </li><li> Une fois la solution fibre a atteint le fond de la diapositive, le placer horizontalement sécher à l&#39;air. Après séchage, une fine ligne opaque devrait être visible le long de la glissière. A ce point, le début de l&#39;fibres étirées doivent être marqués avec un crayon comme après coloration de la ligne ne sera pas visible plus longtemps. Cette marque sera plus tard aider à localiser les fibres sous le microscope. </li></ol> 4. Immunofluorescence Matériaux: Le méthanol, l&#39;acide acétique, l&#39;acide chlorhydrique, BSA 5% dans le PBS, cuvette, anti-BrdU (souris) d&#39;anticorps,anti-BrdU (rat) anticorps, mouton anti-souris Cy3 d&#39;anticorps de chèvre anti-rat Alexa Fluor 488 anticorps, moyennes Vectashield montage, lamelles, vernis à ongles <ol><li> Immerger les lames dans du méthanol / acide acétique (3:1) dans une cuvette et incuber pendant 10 minutes. </li><li> Laver les lames de H 2 O distillée, puis plonger dans HCl 2,5 M pendant 80 minutes. </li><li> Laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Retirer les lames de la cuvette et de recueillir l&#39;excès de PBS avec une serviette en papier. Placer les lames horizontalement et BSA pipette de 5% sur le dessus de chaque diapositive. Couvrir les lames délicatement avec une lamelle de répandre la BSA uniformément sur la lame et incuber pendant 20 minutes. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans BSA 5% aux concentrations suivantes: 1h25 anti-BrdU (souris) et 1:400 anti-BrdU (rat). </li><li> Déplacer la lamelle doucement la lame de verre pour l&#39;enlever. Ne forcez pas si la lamelle colle à la lame. La lame peut être réhydratés dans du PBS jusqu&#39;à ce que la lamelle se détache uneD peut être retiré avec facilité. Recueillir BSA excédent avec un papier absorbant et placer les diapositives à l&#39;horizontale. Pipeter 50 pl de la solution d&#39;anticorps primaire sur chaque diapositive. Couvrir à nouveau avec une lamelle de répandre la solution d&#39;anticorps uniformément sur la lame et incuber dans une chambre humide pendant 2 heures. </li><li> Après avoir enlevé les lamelles, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire BSA 5% aux concentrations suivantes: 1:500 mouton anti-souris Cy3 et 1:400 chèvre anti-rat Alexa Fluor 488. </li><li> Appliquer 50 pl de la solution d&#39;anticorps secondaire comme décrit pour les anticorps primaires. Protéger les diapositives de la lumière et incuber pendant 1 heure. </li><li> Après avoir enlevé les lamelles, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter une goutte de milieu de montage sur Vectashield chaque diapositive et appliquer une lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle et enlever l&#39;excès de liquide autour de lui avec une serviette en papier. Sceller avec des lamelles transparentes ongles polish et les laisser sécher. Stocker les diapositives à -20 ° C. </li></ol> 5. L&#39;acquisition des images Matériaux: la fluorescence microscope, caméra Déposer une goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur une lame près de la marque au crayon et commencer localiser les fibres. Typiquement, il ya un faisceau de fibres principaux, mais ces fibres sont trop enchevêtrés et ne peut pas être analysé plus tard. S&#39;éloigner du faisceau principal de trouver des zones où les fibres sont clairement séparées les unes des autres (fig. 2). Nous souhaitons sélectionner des images en utilisant uniquement un canal de couleur afin d&#39;éviter les biais. Ensuite, nous faudrait environ 10 photos de chaque ligne de temps là, la concentration ou de la cellule. Toutefois, le nombre de photos dépend du nombre de fibres peuvent être comptés sur chaque image. Déplacer le long de la glissière de prendre les différentes images, comme un domaine d&#39;une diapositive peut ne pas fournir des longueurs de fibre représentant ou des structures de réplication. 6. L&#39;analyse des données Matériaux: programme d&#39;analyse d&#39;image, par exemple ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importer des images dans un programme d&#39;analyse d&#39;image. Mesurer la longueur des faisceaux de fibres et / ou compter les structures de réplication différentes (Fig 3). Ne compter que les fibres qui sont clairement visibles et qui ne s&#39;étendent pas sur le bord de l&#39;image. Nous généralement de mesurer la longueur d&#39;environ 100 fibres et compter 150 à 200 structures de réplication et de nous répéter les expériences individuelles d&#39;au moins trois fois. 7. Les résultats représentatifs: L&#39;ADN nouvellement répliqué peuvent être visualisées sous forme de lignes d&#39;anticorps marqués analogues nucléotidiques. Dans nos expériences une fourche en cours est représentée comme adjacentes signaux rouge et vert (Fig. 3). Le protocole de double marquage nous permet également de définir quatre grandes catégories de structures de réplication: 1) des événements d&#39;initiation de nouvelles peuvent être divId<html> ED sur les origines qui ont tiré alors que les cellules ont été incubées avec la première étiquette et origines qui ont tiré pendant l&#39;incubation avec la deuxième étiquette. Les premiers consistent en voisines vert-rouge-vert et les seconds signaux d&#39;une ligne verte uniquement. 2) événements de résiliation manifester comme attenante rouge-vert-rouge signaux. 3) entrecoupées origines sont des sites dans le génome avec des origines très rapprochées. Ces sites comprennent des origines consécutifs et signaux de terminaison. 4) en fonction de la conception expérimentale, au point mort / fourches effondrée peut être défini comme un signal rouge à seulement 7 ou une ligne rouge suivie d&#39;une courte voies vertes 8,9. En utilisant les conditions décrites ici, les cellules de type sauvage DT40 ont une vitesse moyenne de la fourchette de 0,4 um / min. Nous pouvons détecter environ 63% fourches en cours, des origines à 10%, 16% fourches bloquées (rouge voies seulement), les résiliations de 8% et 3% de fibres entremêlées. <html> Ure 1 &quot;/&gt; . Figure 1 (A) Le côté gauche de la caricature illustre la première étape de la procédure de marquage de l&#39;ADN: l&#39;ajout d&#39;UDI à la croissance exponentielle des cellules DT40 conduit l&#39;analogue nucléotidique pour être facilement intégrés dans les principaux nouvellement synthétisées et le retard des brins d&#39;ADN. Ceci peut être visualisé en utilisant un anticorps spécifique, et apparaîtra comme une ligne rouge lorsqu&#39;on les examine sous le microscope. Par la suite, la même procédure est répétée avec CldU comme indiqué sur le côté droit de la figure. Après incubation avec l&#39;analogue de nucléotides seconde, une fourche active sera visible comme une attenante rouge-vert voies. La longueur de la fibre moyenne est proportionnelle au temps d&#39;incubation de la analogues nucléotidiques. (B) l&#39;ADN de cellules lysées DT40 est étirée par gravité sur une lame de microscope et les analogues de nucléotides incorporés sont visualisés par l&#39;utilisation d&#39;anticorps spécifiques et la microscopie à fluorescence. igure 2 &quot;/&gt; Figure 2. Une image représentative de fluorescence montre des fibres à partir des cellules de type sauvage DT40 suite étiquetés avec UDI et CldU pendant 20 minutes chacun. La plupart des fibres sont bien séparés les uns des autres et peuvent donc facilement être analysés. La barre blanche représente 10 um. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figure 3" /> . Figure 3 La technique de fibre double étiquetage permet de distinguer entre les structures de réplication différentes; 1 - fourches répliquant activement, 2 - de nouveaux sites de réplication de l&#39;ADN (tirs de nouvelles origines), 3 - terminaisons fourche (deux fourchettes convergentes), 4 - fibres entremêlées (sites d&#39;origines rapprochées) et 5 - fourches bloquées (rouge signal seulement).

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons une méthode qui permet une analyse quantitative des paramètres qui influencent la synthèse de l&#39;ADN lors de la phase S à un niveau molécule unique. Au cours des dix dernières années, différentes versions de la technique de l&#39;ADN fluorographie en fibre ont été développés pour visualiser le mouvement des fourches de réplication individuels au sein des cellules vivantes. Le paramètre critique dans toutes ces techniques est la procédure utilisée pour obtenir le meilleur étirement de l&#39;ADN sur les surfaces en verre offrant fibres d&#39;ADN bien séparées. Une étape cruciale pour parvenir à cela est le temps d&#39;incubation de la suspension cellulaire sur la lame du microscope ainsi que le temps de lyse. Ces paramètres dépendent de la température et le débit dans un laboratoire particulier et doit être déterminé de manière empirique. La partie pratique d&#39;une expérience de fibre d&#39;ADN est en général accompli en une journée. Toutefois, l&#39;acquisition d&#39;image et l&#39;analyse subséquentes est plus beaucoup de temps et exige la pratique. Le protocole de marquage peut être adApted pour répondre à différents problèmes d&#39;ordre scientifique: en utilisant un agent qui inhibe la réplication lors de la deuxième impulsion d&#39;étiquetage des moniteurs allongement de fourche / décrochage en réponse au stress réplicatif. Dans ce scénario, le premier label n&#39;a pas besoin d&#39;être lavés comme le deuxième nucléotide est ajouté en excès. Alternativement, les médicaments qui empêchent la réplication peut être utilisé en combinaison ou juste après l&#39;addition de la première étiquette. Cela nécessite d&#39;abord l&#39;étiquette et la drogue pour être enlevés avant l&#39;analogue de nucléotides secondes est appliquée. Cette procédure permet de déterminer l&#39;importance des différents facteurs sur la stabilité réparation de l&#39;ADN de fourche réplicative / récupération dans des conditions de stress réplicatif (fourche à savoir caler et / ou l&#39;effondrement). Il convient de noter, une analyse plus détaillée des particularités du programme réplication de l&#39;ADN pourrait être effectuée avec l&#39;utilisation d&#39;une combinaison des approches alternatives peignage moléculaire et la fluorescence par hybridation in situ. Ceci, cependant, est techniquement plus difficile et exige dépenseséquipements excessive. La capacité à analyser qualitativement et quantitativement détails de réplication de l&#39;ADN fournit un outil essentiel pour étudier les défauts de réplication de l&#39;ADN lui-même ainsi que les voies qui suppriment l&#39;instabilité génomique associée avec des fourches de réplication. Sans aucun doute, ce test sera une aide supplémentaire pour faire la lumière sur les mécanismes de réplication à médiation réparation de l&#39;ADN qui permettent aux cellules normales pour répondre / s&#39;adapter aux changements environnementaux ainsi que la manière dont les cellules cancéreuses utilisent ces mécanismes de résister à la toxicité des médicaments ciblant les fourches de réplication.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Fetal or sérum bovin (FBS) </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de poulet </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-iodo-2&#39;-désoxyuridine (UDI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-chloro-2&#39;-désoxy-uridine (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Lames SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Couverture glisse No1 </td><td> Suppplies laboratoire scientifique </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield milieu de montage </td><td> H-1000 Vecteur de laboratoire </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps anti-BrdU (souris) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps anti-BrdU (rat) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> mouton anti-souris Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> chèvre anti-rat Alexa Fluor 488 anticorps </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Maintien de la stabilité fourche de réplication est d&#39;une importance capitale pour la division des cellules afin de préserver la viabilité et à prévenir la maladie. Les processus impliqués non seulement assurer la duplication du génome fidèles dans le visage de dommages à l&#39;ADN endogènes et exogènes, mais aussi de prévenir l&#39;instabilité génomique, un facteur reconnu de causalité dans le développement des tumeurs. Ici, nous décrivons un microscope à base simple et rentable de fluorescence méthode pour visualiser la réplication de l&#39;ADN dans le aviaire à cellules B en ligne DT40. Cette lignée cellulaire est un outil puissant pour étudier la fonction des protéines in vivo par génétique inverse dans les cellules de vertébrés 1. Fluorographie fibre de l&#39;ADN dans des cellules dépourvues de DT40 un gène spécifique permet d&#39;élucider la fonction des gènes dans ce produit réplication de l&#39;ADN et la stabilité du génome. Les méthodes traditionnelles pour analyser la dynamique des fourches de réplication dans les cellules des vertébrés reposent sur la mesure du taux global de synthèse d&#39;ADN dans une population de cellules marquées par impulsions. Ceci est une approche quantitative et ne permet pas pour l&#39;analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d&#39;ADN. En revanche, le taux de mouvement des fourches active peut être suivie directement en utilisant la technique des fibres d&#39;ADN 2-4. Dans cette approche, l&#39;ADN naissante est étiqueté in vivo par incorporation de nucléotides halogénés (figure 1A). Par la suite, les fibres individuelles sont étirées sur une lame de microscope, et les voies étiqueté réplication de l&#39;ADN sont colorées avec des anticorps spécifiques et visualisé par microscopie à fluorescence (figure 1B). Initiation de la réplication ainsi que la directionnalité fourche est déterminée par l&#39;utilisation successive de deux analogues différemment modifiés. Par ailleurs, l&#39;approche à double étiquetage permet une analyse quantitative des paramètres qui influencent la synthèse de l&#39;ADN lors de la phase S, les structures de la réplication à savoir comme les fourches en cours et calé, la densité origine de réplication ainsi que résiliations fourchette. Enfin, la procédure expérimentale peut être d&#39;accomplired dans la journée, et ne requiert que du matériel de laboratoire général et d&#39;un microscope à fluorescence.

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, un système de modèle génétique des vertébrés, fournit un outil puissant pour analyser la fonction des protéines. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet l&#39;analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d&#39;ADN lors de la phase S dans les cellules DT40 à l&#39;échelle de la molécule unique.

Visualisation de la réplication de l&#39;ADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d&#39;ADN

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

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JoVE Journal

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39.6K vues.  University of Oxford. DT40, un système de modèle génétique des vertébrés, fournit un outil puissant pour analyser la fonction des protéines. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet l'analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d'ADN lors de la phase S dans les cellules DT40 à l'échelle de la molécule unique.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Recherche

Biologie

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Les études génétiques des protéines humaines réparation de l&#39;ADN utilisant de la levure comme système modèle

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisation des Caenorhabditis elegans</emOuvrages cuticules> Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualisation de la surface captif grande molécules d&#39;ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.