Samir Hamdan aidé dans le développement de cette technique. E. coli sont des protéines du laboratoire du professeur Nick Dixon, protéines de l&#39;Université de Wollongong, et T7 sont du professeur Charles Richardson, Harvard Medical School. Le travail est soutenu par le National Institutes of Health (GM077248 d&#39;AMvO) et la Fondation Jane Coffin Childs (JJL).

Avant d&#39;effectuer la réplication d&#39;une expérience unique molécule, un peu de matériaux doivent être préparés à l&#39;avance. 1. Modèle de réplication d&#39;ADN Le substrat pour la réaction de réplication est un biotinylé, queue M13 cercle roulant préparés en utilisant standards de biologie moléculaire 1,2 techniques. Matériaux: M13mp18 ADN simple brin, biotinylé oligonucléotide amorce de queue (5&#39;-biotine-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), l&#39;ADN polymérase T7, un bloc de chaleur, de phénol / alcool isoamylique / Chloroforme <ol><li> Recuire les oligo biotinylé la queue à l&#39;M13 en ajoutant un excès de 10 fois d&#39;oligo dans du tampon TBS (330 nM queue oligo, 33 nM M13). </li><li> Chauffer le mélange à 65 ° C dans le bloc thermique. Une fois chauffée, tournez le bloc de chauffage hors tension et permettre un refroidissement lent à bien recuit l&#39;amorce. </li><li> Ajouter la M13 amorcée à un mélange de 64 nM polymérase T7 ADN et le tampon de la réplication T7 contenant dNTPs et MgCl 2. </li><li> Incuber la réaction à 37 ° C pendant 12 minutes et étancher avec 100 mM d&#39;EDTA. </li><li> Purifier l&#39;remplie dans l&#39;ADN des produits avec extraction phénol / chloroforme / isoamyle et dialyser dans un tampon TE ou d&#39;autres tampons de stockage approprié et de déterminer la concentration d&#39;ADN (Back-extraire chaque phase organique à récupérer tout résidu amorcée M13). </li><li> Une itération de préparation modèle peut facilement faire plusieurs millilitres de modèle de concentration nanomolaire, assez pour des centaines de milliers de molécule unique d&#39;expériences. </li></ol> 2. Lamelles fonctionnalisés Pour la fixation à l&#39;ADN de la lamelle de verre, le verre est d&#39;abord fonctionnalisés avec un aminosilane, qui est ensuite couplé à des molécules de PEG biotinylé. Ce revêtement contribue à réduire les interactions non spécifiques de l&#39;ADN et les protéines de réplication avec la surface 1,3. Matériaux: lamelles de verre, des pots de coloration, 3-aminopropyltriéthoxysilane, méthoxy-PEG5k-NHS ester biotine-PEG5k-NHSester, l&#39;acétone, 1M KOH, l&#39;éthanol, Four Bain sonicateur, <ol><li> Nettoyez soigneusement les lamelles de verre en les plaçant dans des bocaux coloration et le remplissage des bocaux avec de l&#39;éthanol. Soniquer pendant 30 minutes et rincer les bocaux et les remplir de 1 M KOH. Soniquer pendant 30 minutes Répéter deux lavages. </li><li> Pour la réaction de fonctionnalisation d&#39;abord, toute trace d&#39;eau doivent être enlevés. Remplissez les bocaux avec de l&#39;acétone et soniquer pendant 10 min. Rincez à nouveau les bocaux avec de l&#39;acétone. </li><li> Préparer un 2% v / v solution du réactif de silane dans l&#39;acétone. Ajouter à la coloration des bocaux et agiter pendant 2 minutes. Cette réaction des couples du groupe alcoxy de l&#39;aminosilane à la vitre, laissant une amine réactive pour la prochaine étape de couplage. Arrêter la réaction avec un large excès d&#39;eau. </li><li> Sécher les lamelles en les cuisant à 110 ° C dans le four pendant 30 minutes. </li><li> Préparer un méthoxy 50:1: biotine PEG mélange dans 100 mM NaHCO 3 à pH 8,2. But pour environ 0,2% p / v PEG biotinylé. </li><li> Pipeter 100 uL du mélange PEG sur une lamelle sèche silanisé et placer une autre lamelle sur le dessus. Y compris une entretoise lamelle de verre permettra la séparation des lamelles. </li><li> Incuber les lamelles dans la solution de PEG pendant 3 heures, puis de séparer chaque paire de lamelles et laver abondamment avec de l&#39;eau. Veillez à garder les lamelles latérales fonctionnalisées en tant que côté une fois sera recouvert avec du PEG. </li><li> Sécher les lamelles et stocker sous vide. Les surfaces restent stables pendant au moins un mois, donc des dizaines de lamelles peuvent être faites dans un lot et utilisés au besoin. </li></ol> Ces matériaux doivent être faites d&#39;avance, puis utilisées pour chaque expérience. Pour commencer chaque expérience unique molécule, commencer par rassembler la chambre d&#39;écoulement. 3. Préparation Chambre de circulation L&#39;expérience est réalisée en utilisant une chambre de flux simple, construit avec une lamelle fonctionnalisée, scotch double-face, une lame de quartz et les tubes. Une chambre d&#39;écoulement est préparé pour le 1,4 expérimentation chaque molécule unique. Matériaux: ruban adhésif double face, une lame de rasoir, glisser à quartz avec des trous pour tuyaux, à séchage rapide époxy, lamelle fonctionnalisés (voir ci-dessus), une solution de streptavidine (25 uL de 1 mg / ml dans le PBS), tubes de tampon de blocage (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 2 mM, NaCl 50 mM, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% de Tween-20) <ol><li> Commencez par placer 20-25 ml de tampon de blocage dans un dessiccateur pour éliminer les bulles d&#39;air pour les étapes ultérieures. </li><li> Prenez une lamelle de PEG-fonctionnalisés et la propagation de la solution de streptavidine 125 PBS-dilué sur la surface. Laissez ce à incuber pendant 20 minutes tout en préparant d&#39;autres parties de la chambre, ce qui permet de lier streptavidine biotines surface. </li><li> Coupez un morceau de double facebandes d pour correspondre à la taille de la diapositive à quartz. Marquer la position des trous de tuyau sur la bande avec un crayon afin que les grandes lignes de la chambre d&#39;écoulement peuvent être tirées sur la bande (1 mg / ml). </li><li> Faire un 2 mm de large rectangle autour des trous. Ce sera le canal d&#39;écoulement, donc soyez sûr de faire les côtés droit et laisser de la place autour de l&#39;entrée et la sortie de tube. Si désiré, des canaux multiples ou de tailles différentes peuvent être utilisées. </li><li> Coupez le long du contour dessiné, rendant coupes droites et propres pour s&#39;assurer que personne ne dépasse colle dans le canal. </li><li> Nettoyez soigneusement l&#39;acétone de quartz à l&#39;aide ou l&#39;éthanol pour enlever l&#39;adhésif de la construction de cellules d&#39;écoulement précédentes. </li><li> Trouver le meilleur alignement du contour de canal, retirer un côté de l&#39;adhésif et placer soigneusement le ruban sur la lame de quartz. Soyez prudent afin d&#39;aligner la bande correctement, comme les trous d&#39;entrée et de sortie doivent rester débloqué. </li><li> Couper des longueurs de tuyaux pour l&#39;entrée et la sortie de la cellule d&#39;écoulement. Il aide à couper l&#39;extrémité du tube à environ un angle de 30 ° pour que le tube ne sera pas de presse à plat contre le fond de chambre. Placer les tubes sur une sorte de soutien pour les suspendre pour une fixation facile à la cellule de flux dans les prochaines étapes. </li><li> Rincer la lamelle recouvertes de streptavidine abondamment à l&#39;eau et sécher à l&#39;air comprimé. Rappelez-vous que seul un côté est fonctionnalisé; attention à ne pas tourner la lamelle sur. Retirer de l&#39;autre côté du support cassette et placer la lame de quartz sur la lamelle. </li><li> Appuyez légèrement sur la lamelle pour faire sortir tout l&#39;air emprisonné dans la colle. Cela permettra d&#39;éviter les bulles d&#39;air d&#39;entrer dans le canal d&#39;écoulement. </li><li> Scellez les côtés de la chambre à l&#39;époxy. Insérer le tuyau coupé dans les trous du quartz et sceller en place à l&#39;époxy. Cela doit sécher pendant quelques minutes. </li><li> Une fois sèche, commencer à bloquer la surface en tirant partie de la mémoire tampon dégazée par un blocage de tubes. Une aiguille de calibre 21 correspond parfaitement à l&#39;intérieur du tube de 0,76 mm. Rincez plusieurs fois pour enlever les bulles d&#39;air, et permettre à la chambre à incuber pendant au moins une demi-heure. </li></ol> 4. Expérience de la réplication de molécules simples Matériaux: chambre de flux Préparé, SYTOX d&#39;Orange, un microscope TIRF, 532 nm laser, caméra CCD, de l&#39;informatique avec le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image, substrat d&#39;ADN de cercle roulant, les protéines de réplication <ol><li> Après la cellule de débit a été bloqué, tout est prêt pour commencer l&#39;expérience unique molécule. </li><li> Prenez la cellule d&#39;écoulement et le placer sur la platine du microscope. Tenir la chambre en place avec des clips scène et être sûr que le canal d&#39;écoulement est positionné directement le long de l&#39;axe y. </li><li> Connectez le tube de sortie de flux de cellules à l&#39;aide d&#39;une pompe seringue tube diamètre de connecteur ou une aiguille. Placer l&#39;entrée dans le tampon de blocage et tirez sur la seringue pour enlever tout l&#39;air dans le tube. Un film de douceur du tube de sortie aidera à éclaircir les bulles d&#39;air piégées dans la cellule d&#39;écoulement. </li><li> Diluer la matrice d&#39;ADN d&#39;actions à 25 pM dans 1 ml de tampon de blocage. Débit dans la chambre à débit modéré pour permettre une couverture de surface bien de l&#39;ADN. 0,025 ml / min pendant 30 minutes fonctionne bien. Cela peut être varié en fonction du nombre de molécules d&#39;ADN sont sur la surface de chaque lot de lamelles ou combien sont souhaitées pour l&#39;expérience. </li><li> Une fois que l&#39;ADN est dans, laver tout excédant d&#39;ADN à l&#39;aide du tampon de blocage. Laver pendant au moins 200 flux de cellules volumes pour se débarrasser de tout l&#39;ADN libre. </li><li> Commencez dégazage le tampon de la réplication. Pour les E. expériences de réplication coli, cela à 37 ° C pour réduire le risque de bulles dans la chambre d&#39;écoulement chauffé. </li><li> Allumez le laser et la caméra. Le CCD refroidie doit atteindre la température avant de pouvoir être utilisé. </li><li> Si vous effectuez une expérience de 37 ° C, tournez le chauffage. Soyez sûr l&#39;objectif est en contact avec la cellule de flux ou il sera un dissipateur thermique plus tard. </li><li> Après le lavage et le dégazage, la réaction peut être préparé. Nucléotides Mix, la TNT, et SYTOX dans le tampon de la réplication. Puis ajouter les protéines et les mélanger délicatement. </li><li> Débit du mélange réactionnel dans la cellule de flux. Cette vitesse d&#39;écoulement doit être suffisante pour étirer ADNdb. Pour une 2-mm de large, 100-um canal d&#39;écoulement hauteur 0,04 ml / min fonctionne bien. </li><li> Prévoyez du temps pour le mélange à pénétrer dans la chambre et commencer l&#39;imagerie. Un bon conseil est de déplacer le champ de vision sur le côté du canal et de se concentrer sur le matériau adhésif. Cela permettra d&#39;assurer vous êtes près de la surface de focalisation. </li><li> Régler la puissance du laser, mise au point microscope, et l&#39;angle de la FRBR. Gardez la faible puissance pour éviter toute photoclivage de l&#39;ADN coloré. Acquérir à 1-5 images / seconde pendant plusieurs minutes, selon le taux de réplication de l&#39;ADN. Si vous le souhaitez, répétez pour obtenir des trajectoires plus de réplication ou de passer à un nouveau champ pour voir plus de molécules. </li><li> Après le mélange réactionnel est presque vide, c&#39;est une bonne idée de circuler dans plusieurs tampons avec SYTOX pour voir d&#39;autres champs de vue. Prendre des images multiples de différentes molécules reproduit fournit des statistiques pour la détermination de processivité. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Molécules répliquant activement sont facilement considérées comme des lignes de plus en plus de l&#39;ADN coloré. Dans nos expériences, coulant 25 pM du substrat M13 donne 100-1000 molécules dans un 60x, 125 um um champ x 125 de vue (figure 1). Réaliser des expériences de réplication en utilisant les E. protéines coli réplisome à 37 ° C (voir Matériaux pour plus de détails) donne des molécules de 50 à 50 répliquant par champ de vue. A des concentrations équivalentes de l&#39;réplisome T7, qui initie sur le substrat beaucoup plus efficacement, nous observons&gt; 70% des molécules dans un champ de répliquer. Ces conditions donnent une densité du produit si élevé que des molécules individuelles sont difficiles à résoudre et d&#39;analyser, de sorte que les expériences sont réalisées à T7 concentrations de protéines plus faible. Analyse des données: Pour obtenir des données de taux, il suffit de tracer l&#39;extrémité de l&#39;ADN en fonction du temps et de calculer la pente (figure 2). Pour processivité, déterminer la longueur totale de l&#39;ADN. Ces deux numéros devront être convertis en paires de bases. Avant d&#39;effectuer l&#39;expérience, vous devriez connaître la taille de pixel de la caméra à l&#39;agrandissement approprié. Pour la conversion de paires de bases, une bonne estimation est tout simplement la conversion basé sur la longueur cristallographique de l&#39;ADN, 2,9 bp / nm. Cependant, un écoulement laminaire ne sera pas complètement étirer l&#39;ADN, donc un calibrage de longueur d&#39;ADN devraient être effectuées en prenant un ADN de longueur connue, par exemple 48 502 pb λ ADN, de le fixer à la cellule de flux avec un oligo biotinylé et en mesurant sa SYTOX teinté longueur à le débit utilisé pour l&#39;expérience de la réplication. Déterminer le nombre de paires de base / pixel permet un calcul précis des taux de réplication et processivities. Prendre de nombreuses images et des films offrira un grand nombre de molécules de produits, permettant de traçage de distributions de taux et de processivité (figure 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: (A partir Ref 1.) Un dessin animé) de l&#39;essai de réplication de cercle roulant. (SA, streptavidine). Diriger brin synthèse étend la queue reliant le cercle et la surface. La queue est converti en ADN double brin par la polymérase brin retardé et étirée par flux laminaire. Exemple de terrain b) de vue avec SYTOX Orange et d&#39;excitation 532 nm. De petites taches fluorescentes sont attachés, non répliquée substrats. Notez la longueur extrême des produits et le grand nombre de produits par le terrain (chaque cellule contient des flux&gt; 5000 domaines tels). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: (adapté de référence 1.) A, b) Kymographs des molécules typiques répliquant de T7 (a) et E. coli (b) des expériences. c) les trajectoires des molécules à partir de Endpoint a) et b) tracée en fonction du temps. Les trajectoires sont équipés de régression linéaire pour obtenir des taux de réplication. Les exemples montrés sont 99,4 pb s -1 et 467,1 pb s -1. d) Longueur distributions de produits de réplication, l&#39;ajustement avec décroissance exponentielle simple à obtenir processivité: 25,3 ± 1,7 kpb (T7), 85,3 ± 6,1 kpb (E. coli). e) Taux de distribution des trajectoires seule molécule, l&#39;ajustement des gaussiennes unique. Moyens: 75,9 ± 4,8 s -1 pb (T7), 535,5 ± 39 pb s -1 (E. coli).

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Une critique de contrôle n&#39;est examinant l&#39;effet de la tache orange, SYTOX, sur les protéines de réplication d&#39;intérêt. Une façon simple de faire cela est de réaliser l&#39;expérience de réplication dans la cellule de flux comme décrit mais avec l&#39;omission de SYTOX. Après le mélange réactionnel a coulé dans la chambre, ajoutez tampon avec SYTOX pour colorer l&#39;ADN et d&#39;examiner la distribution des longueurs de molécules répliquées. Alternativement, les réactions en vrac standard peut être utilisé pour vérifier tout effet de SYTOX sur le taux de réplication et de l&#39;efficacité. L&#39;expérience décrite ici utilise seulement un canal d&#39;écoulement unique. Ceci peut être changé facilement en créant multi-canal chambres d&#39;écoulement ou de l&#39;utilisation de PDMS ou similaire dispositifs microfluidiques. Augmenter le nombre de canaux facilite grandement le dépistage des concentrations de protéines, des mutants, ou des molécules d&#39;inhibiteur et augmente la rapidité de la réplication de données de collecte. Comme mentionné précédemment, nous effectuons les E. expériences de réplication coli à 37 ° C à l&#39;aide d&#39;un chauffe-maison construite en aluminium flux de cellules, un élément résistif chauffant (cartouche chauffante) et une alimentation variable. Cela donne une bonne stabilité en température et évite l&#39;achat d&#39;un chauffe-objectif. Pour calibrer l&#39;appareil de chauffage, nous avons simplement percé un trou dans le centre d&#39;une cellule à écoulement supérieure à quartz, a inséré un thermocouple dans le canal d&#39;écoulement et coulé tampon comme normale. Mesure de la température du tampon de flux de cellules à des tensions croissante permet un chauffage précis.

Réplication T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM de glutamate de potassium, chlorure de magnésium 10 mM, 100 ug / ml de BSA, avec 5 mM de dithiothréitol, 600 uM dNTP, 300 uM ATP, CTP 300 uM, et 15 nM SYTOX orange ajouté immédiatement avant utilisation. Protéines ajouté que: 5 nM GP4 (hexamère), 40 nM polymérase (1:1 gp5: thiorédoxine), 360 nm gp2.5 1,5. La réplication de E. coli: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM d&#39;acétate de magnésium, chlorure de potassium 80 mM, 100 ug / ml de BSA avec 10 mM de dithiothréitol, 40 uM dNTP, 200 rNTP uM, et 15 nM SYTOX orange ajouté immédiatement avant utilisation. Protéines ajouté que: 30 nM DnaB (hexamère), 180 Nm DNAC (monomère), 30 nM αεθ, 15 nM τ γ 2 1 δδ&#39;χψ ou τ 3 δδ&#39;χψ, 30 nM β (dimère), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tétramère), 20 nM Pria, 40 nM Prib, 320 nM pric, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Nous décrivons un simple microscope à fluorescence-temps réel basé sur la méthode pour l&#39;observation de réplication de l&#39;ADN à la molécule seul niveau. Une circulaire, matrice d&#39;ADN fourchue est attaché à une lamelle de verre fonctionnalisée et reproduit abondamment après l&#39;introduction de protéines de réplication et de nucléotides (figure 1). Le produit de plus en plus l&#39;ADN double-brin (ADNdb) est étendu avec un écoulement laminaire et visualisées en utilisant un colorant intercalant. Mesure de la position de l&#39;extrémité d&#39;ADN en croissance en temps réel permet la détermination précise du taux de réplication (figure 2). Par ailleurs, la longueur des produits d&#39;ADN rempli des rapports sur la processivité de la réplication. Cette expérience peut être effectuée très facilement et rapidement et ne nécessite qu&#39;un microscope à fluorescence avec un appareil assez sensible.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Ce protocole illustre une simple molécule unique technique de microscopie par fluorescence pour la visualisation de la réplication de l&#39;ADN par replisomes individuelles en temps réel.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Recherche

Biologie

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Observation directe d&#39;ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation