Ce travail a été financé par l&#39;IEN et NIMH.

1. VideoSwitcher 1,1. Connectez VideoSwitcher à un ordinateur Le VideoSwitcher (figure 1) reçoit vidéo analogiques (VGA) et des entrées est utilisée pour piloter à tube cathodique (CRT) de couleur. Avant d&#39;utiliser le VideoSwitcher, assurez-vous que la carte graphique informatique a soit un port VGA (figure 2A) ou d&#39;un Digital Visual Interface (DVI-I) port (figure 2B) qui transmet les signaux vidéo numériques et analogiques. Un adaptateur DVI-VGA (figure 2C) est nécessaire pour connecter le port DVI-I de la VideoSwitcher. Éteignez l&#39;ordinateur et de suivre et de débrancher le moniteur de la carte graphique informatique. Branchez le VGA ou le port DVI-I de l&#39;infographie de la carte au port d&#39;entrée de l&#39;VideoSwitcher l&#39;aide du câble fourni VGA. Utilisez un petit tournevis pour sécuriser les connexions. Connecter le câble VGA de l&#39;écran pour le port de sortie de l&#39;une VideoSwitchere sécuriser les connexions. Branchez le VideoSwitcher à une source d&#39;alimentation en utilisant l&#39;adaptateur d&#39;alimentation fourni. Allumez l&#39;ordinateur et le moniteur. 1,2. Deux modes d&#39;affichage de l&#39;aiguilleur vidéo Le bouton interrupteur sur la VideoSwitcher permet à l&#39;utilisateur de basculer en va-et-vient dans deux modes d&#39;affichage. Dans le mode de couleur, l&#39;VideoSwitcher ne modifie pas le signal vidéo de la carte d&#39;ordinateur graphique. Dans le mode de niveaux de gris, l&#39;affichage devient monochromatique, avec sa luminance déterminée essentiellement par le signal vidéo à partir du canal bleu de la carte graphique, légèrement affectée par le signal provenant du canal rouge, et aucune contribution de la couche verte. C&#39;est parce que le réseau résistant à l&#39;intérieur du VideoSwitcher atténue le signal du canal rouge par un facteur d&#39;environ 128, et le signal de la voie verte ne contribue pas du tout. Le ratio des contributions de l&#39;une bleued canaux rouge à la sortie du VideoSwitcher est appelé bleu au rouge rapport (BRratio). Le BRratio est la propriété d&#39;un commutateur vidéo, indépendante de la configuration de l&#39;affichage. Il peut être déterminée expérimentalement pour chaque VideoSwitcher (voir 1.3). Le mode d&#39;affichage peut aussi être activé en envoyant un signal spécial par la voie verte de la carte graphique en utilisant un appel de fonction dans Matlab: PsychVideoSwitcher («SwitchMode &#39;, whichScreen, ToGrayMode); où ToGrayMode de 1 ou 0 signifie pour passer en niveaux de gris ou en mode couleur. La figure 3 montre le schéma d&#39;un VideoSwitcher. 1,3. Mesurer BRratio Le BRratio peut être mesurée pour chaque VideoSwitcher aide d&#39;une tâche de détection d&#39;ondes carrées réseau. Les deux niveaux de l&#39;onde carrée reçoivent des valeurs RGB comme (0, 0, 40) et (x, 0, 39). On peut ajuster la valeur de x jusqu&#39;à ce que la grille d&#39;onde carréedisparaît, après quoi la valeur x est le BRratio --- l&#39;amplitude du signal dans le R-canal qui conduit à l&#39;intensité produite par une unité de signal dans le canal B. Bien que l&#39;on peut mesurer la BRratio par voie électronique, par exemple pour mesurer le rapport des sorties de tension d&#39;un VideoSwitcher à des valeurs RVB de (0, 0, 255) et (255, 0, 0), la méthode psychophysique décrit ici est très simple et précise. 1,4. Étalonnage d&#39;écran Pour la plupart des moniteurs, luminosité de l&#39;écran n&#39;augmente pas linéairement avec le niveau du pixel gris précisé par la carte graphique informatique. La relation peut être décrite comme suit: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où L max, L min et γ sont déterminées avec une procédure de correction gamma, soit en utilisant photomètres ou par une combinaison de procédures et des mesures photométriques psychophysiques 7,8. D&#39;étalonnage Gamma est important pour produire des contrastes précis sur un écran, elle doit être effectuée pour chaque dispositif d&#39;affichage. Avec un photomètre, on peut simplement afficher un carré uniforme à grande niveaux de gris de pixels différents (par exemple, de 0 à 255), mesurer la luminance du centre de la place, et le montage des résultats avec l&#39;équation 1 pour obtenir γ. Le procédé implique la création d&#39;psychophysique, dans une zone de la surface de visualisation, aussi uniforme que possible d&#39;un mélange (dans l&#39;espace et le temps) de quantités égales de zéro et pleine intensité pixels et déterminant la valeur niveau de gris de pixels dans une zone adjacente homogène ( dans lequel tous les pixels ont la même intensité) qui produit une correspondance psychophysique à la luminance de la zone mixte-pixel. Le premier match détermine la valeur niveaux de gris pour moitié de la luminance maximale. Un mélange de pixels avec des intensités de luminance 1/2 et 1 est utilisée pour déterminer la valeur 3/4, et cette procédure est répétée jusqu&#39;à ce que sept valeurs de fROM 1/8-7/8 ont été déterminés. Ces matches sont répétées, et diverses vérifications de cohérence sont effectués, par exemple, vérifier qu&#39;un mélange de 3/4 et 1/4 matchs 1/2. Dans cette procédure, à la fois le B et le niveau de R de la zone homogène sont ajustées, et U = B + R / BRratio. Les résultats peuvent être adaptés avec l&#39;équation 1 pour obtenir γ. Après nous obtenons des valeurs de L min, L max et γ, nous pouvons définir la luminance de fond L 0 = (L max + L min) / 2, La relation entre le contraste pixel c (U) et le pixel de niveau de gris U est la suivante: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="L&#39;équation 2" /> Nous pouvons réécrire l&#39;équation à résoudre pour le niveau requis de gris pour un contraste donné: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="L&#39;équation 3" /> où U est normalement un nombre non entier. La valeur RVB du pixel correspondant est: R = BRratio * [U-int (U)], G = 0, B =int (U), où int () prend la valeur entière de son entrée. 1,5. Démo d&#39;un réseau sinusoïdal L&#39;effet de l&#39;augmentation en niveaux de gris de résolution peut être démontré par la comparaison de deux réseaux d&#39;ondes sinusoïdales. Le réseau de gauche utilise la capacité totale de l&#39;VideoSwitcher les uns avec les intensités de pixel spécifié par l&#39;R approprié et les valeurs B. Le réseau sur la droite est la même que celle de gauche, sauf que seule la U arrondi est utilisé comme valeur B de chaque pixel, imitant la sortie d&#39;un dispositif d&#39;affichage à 8 bits. 2. RTbox 2,1. Branchez le RTbox à un ordinateur Branchez le RTbox (Figure 4) à un port USB d&#39;un ordinateur avec le câble fourni. Si nécessaire, téléchargez le pilote du dispositif de la <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . Installez le pilote en suivant les instructions sur le site. 2,2. Utilisez le RTcase pour mesurer le temps de réponse Le RTbox peut être utilisé de deux manières différentes. Si le programme de l&#39;utilisateur peut retourner fiables fois le début du stimulus, comme le temps retourné par l&#39;écran (&#39;Flip&#39;) et PsychPortAudio dans Psychtoolbox [8], le RTbox peut être utilisé comme un clavier. Parce que les temps d&#39;apparition de relance et les délais bouton RTbox sont basés les horloges de l&#39;ordinateur hôte et le RTbox, respectivement, nous devons synchroniser les deux horloges. Cela se fait avec un RTBox appel de fonction (&#39;clear&#39;) avant chaque début du stimulus pour effacer les événements indésirables dans la mémoire tampon. Le temps de réponse peut être simplement mesuré comme t resp = t - t apparition, où tonset est le stimulus retourné par le programme utilisateur, et t est le temps le bouton retourné par l&#39;appel de fonction [t, bouton] = RTBox (timeout). C&#39;est parce que le conducteur RTBox convertit automatiquement le temps sur le bouton à partir du moment RTbox d&#39;accueillir le temps d&#39;ordinateur. Si le programme de l&#39;utilisateur ne peut pasretour fiable fois le début du stimulus, des signaux de déclenchement indiquant onsets de relance doit être fourni à l&#39;RTbox. Une solution consiste à utiliser un capteur de lumière pour détecter l&#39;apparition du stimulus ou d&#39;une tache lumineuse qui est synchronisé avec le stimulus. La sortie du capteur de lumière est connecté au port de lumière de l&#39;RTbox. Une deuxième solution consiste à utiliser la sortie de déclenchement de l&#39;VideoSwitcher. Le déclencheur peut être directement connecté au port d&#39;impulsion du RTbox. Une troisième solution est de connecter le signal audio de l&#39;ordinateur hôte à l&#39;orifice sonore du RTbox. Pour générer un déclencheur début du stimulus de l&#39;VideoSwitcher, on &quot;activer&quot; le canal vert des pixels dans la partie centrale de la première trame du stimulus visuel. Parce qu&#39;il ne contribue pas à le réseau de résistances, le signal dans le canal vert est invisible à l&#39;objet. Un appel de fonction [t, bouton] = RTBox («pulse», timeout) retourne le temps de réponse, où «pulse» indique l&#39;RTbox pour calculer t<html> il la réponse relative du temps pour la détente. Le même appel de fonction est utilisé pour le déclenchement du son. Pour les déclencheurs de capteurs de lumière, l&#39;appel de fonction est [t, bouton] = RTBox («lumière», timeout). 3. Intégrer VideoSwitcher et RTbox Nous avons programmé un programme de démonstration qui utilise le VideoSwitcher pour contrôler l&#39;affichage, le RTbox pour recueillir le temps de réponse précise, et le RTbox d&#39;envoyer le code d&#39;événement et les réponses à un système ERP. Le programme peut être téléchargé à partir <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Image d&#39;un commutateur vidéo. Il possède une entrée VGA et deux ports de sortie (femelle), un bouton pour basculer entre deux modes d&#39;affichage, et un port de sortie de déclenchement. ontenu &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Photos Figure 2. De VGA (A) et DVI-I (B) et les ports DVI-I vers VGA (C). <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Le schéma d&#39;un commutateur vidéo. Le multiplexeur a deux modes d&#39;entrée, commandés par un niveau de tension. Quand il est dans le mode indiqué dans le schéma, les canaux RVB d&#39;un moniteur reçoivent le même signal, pour que l&#39;écran est en mode niveaux de gris. La tension de commutation est généré par une puce CPLD, commandés par des signaux dans le G-canal et le bouton interrupteur. La détente est également contrôlée par l&#39;entrée dans le G-canal. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Image d&#39;un RTbox. Il possède un port USB-B, un port d&#39;entrée de lumière, un port d&#39;entrée d&#39;impulsion / bruit, un orifice d&#39;entrée bouton externe, et un orifice de sortie TTL.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le commutateur vidéo fournit une méthode compact, peu coûteux et facile à utiliser pour générer la résolution affiche une luminance élevée en utilisant classiques infographie cartes et des moniteurs couleur analogiques. Il est connecté entre les sorties analogiques de la carte graphique et le moniteur. Il peut également basculer entre les modes d&#39;affichage monochromatiques et chromatiques, offrant plus de commodité. Son canal de déclenchement permet aux chercheurs de synchroniser d&#39;autres équipemen...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

Les systèmes d&#39;affichage basés sur les cartes graphiques informatiques classiques sont capables de générer des images avec résolution de 8 bits en niveaux de gris. Cependant, la plupart des expériences dans la recherche en vision exigent écrans avec plus de 12 bits de résolution de luminance. Plusieurs solutions sont disponibles. Bit + + 1 et 2, utilisez la DataPixx Digital Visual Interface (DVI) de sortie de cartes graphiques et haute résolution (14 ou 16-bit) numérique-analogique des convertisseurs pour commander les dispositifs d&#39;affichage analogiques. Le 3 VideoSwitcher décrit ici combine les signaux vidéo analogiques à partir des canaux rouge et bleu de cartes graphiques avec des poids différents en utilisant un réseau résistant passive 4 et un circuit actif pour délivrer des signaux vidéo identiques aux trois canaux de moniteurs couleur. La méthode fournit un moyen peu coûteux pour permettre des écrans haute résolution en utilisant monochromatiques classiques cartes graphiques et moniteurs analogiques. Il peut également fournir des signaux de déclenchement qui peuvent être utilisés pour marqueronsets de relance, le rendant facile pour synchroniser affichages visuels avec des enregistrements physiologiques ou des mesures de temps de réponse. Bien que les claviers d&#39;ordinateur et la souris sont fréquemment utilisés pour mesurer les temps de réponse (RT), la précision de ces mesures est assez faible. Le RTbox est un matériel spécialisé et solution logicielle pour les mesures précises RT. Connecté à l&#39;ordinateur hôte via une connexion USB, le pilote de l&#39;RTbox est compatible avec tous les systèmes d&#39;exploitation classiques. Il utilise une horloge de microprocesseur et de haute résolution pour enregistrer les identités et le calendrier des événements de bouton, qui sont mises en mémoire tampon jusqu&#39;à ce que l&#39;ordinateur hôte les récupère. Les événements de bouton enregistrées ne sont pas affectées par les incertitudes de synchronisation potentiels ou les préjugés associés à la transmission et traitement des données dans l&#39;ordinateur hôte. Le stockage asynchrone simplifie grandement la conception des programmes utilisateurs. Plusieurs méthodes sont disponibles pour synchroniser les horloges de la RTbox et le comput d&#39;accueiler. Le RTbox pouvez également recevoir des déclencheurs externes et être utilisé pour mesurer la RT par rapport à des événements extérieurs. Les deux VideoSwitcher et RTbox sont disponibles pour les utilisateurs à acheter. L&#39;information pertinente et les programmes de démonstration de nombreux peut être trouvé à <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

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Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Matériel informatique conventionnel ne peut pas générer des stimuli visuels avec suffisamment élevée en niveaux de gris des temps de réponse de résolution et de mesure avec une précision suffisante. Nous décrivons comment utiliser le VideoSwitcher pour produire des écrans haute résolution monochromatiques, et le RTbox pour mesurer les temps de réponse avec une grande précision sur le matériel informatique classique.

Activation des niveaux de gris écrans haute résolution et s&#39;assurer de mesures précises de temps de réponse sur les ordinateurs classiques

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

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Transient and Steady-state Response Analysis

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9.3K vues.  The Ohio State University. Matériel informatique conventionnel ne peut pas générer des stimuli visuels avec suffisamment élevée en niveaux de gris des temps de réponse de résolution et de mesure avec une précision suffisante. Nous décrivons comment utiliser le VideoSwitcher pour produire des écrans haute résolution monochromatiques, et le RTbox pour mesurer les temps de réponse avec une grande précision sur le matériel informatique classique.

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Recherche

Neurosciences

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Haute résolution magnétique fonctionnelle Méthodes d&#39;imagerie par résonance mésencéphale humain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

En Vivo mesures électrophysiologiques sur les nerfs sciatiques souris

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Haute résolution structurelle Imagerie par résonance magnétique de la sous-cortex humain<I&gt; In Vivo</I&gt; Et Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Déclenchement Stress cellulaire et la mort Utilisation conventionnelle UV Laser Microscopie confocale

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...