1. Préparation de la vaisselle <ol><li> Plats utilisés pour la culture tranche sont à fond de verre (avec une lamelle de la base) (plats WillCo). Ces derniers sont placés sur du tissu optique dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm pour garder le fond de verre propre. </li><li> Le jour avant l&#39;expérience, ajouter 2 ml de 0,1% de poly-L-lysine solution au plat à fond de verre et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour permettre à la poly-L-lysine recouvrir le fond de verre. </li><li> Retirer la poly-L-lysine solution et rincer trois fois dans de l&#39;eau désionisée, puis une fois dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Laissez sécher une nuit. Les plats peuvent également être séché en chauffant légèrement dans un micro-ondes à faible puissance pendant 30-45 secondes. </li></ol> 2. L&#39;électroporation d&#39;embryons <ol><li> Incuber les œufs à 37 ° C à Hamburger-Hamilton (HH) étape 10 (~ 36 heures) (ou un autre stade de croissance désiré). </li><li> Avant de commencer de préparer des aiguilles de verre (nous utilisons un Flaming / modèle de Brown p87 extracteur microcapillaire) et de rompre la pointe de l&#39;needle à l&#39;aide d&#39;une pince fines sous une loupe binoculaire. La fin de l&#39;aiguille doit être suffisamment pointu pour percer l&#39;embryon tout en n&#39;étant pas si étroite qu&#39;elle entrave l&#39;injection de la solution d&#39;ADN. </li><li> Oeufs de fenêtres et positionner les électrodes (5mm d&#39;intervalle) de chaque côté de l&#39;embryon </li><li> Injecter de l&#39;ADN (~ 0,025 à 0,5 ug / ul dans de l&#39;eau déminéralisée coloré avec une petite quantité de vert rapide) dans le tube neural. </li><li> Appliquer le courant - 12-17 V trois fois, la longueur d&#39;impulsion 50ms avec 950 ms entre les impulsions. </li><li> Nous utilisons de faibles concentrations d&#39;ADN et des tensions d&#39;électroporation bas pour obtenir l&#39;expression de la mosaïque afin que nous puissions suivre les cellules individuelles. </li><li> Couvrez la fenêtre dans la coquille d&#39;oeuf avec scotch et assurez-vous qu&#39;il est scellé. </li><li> Laisser embryons de récupérer pendant 3-4 heures ou toute la nuit à 37 ° C. </li></ol> 3. Le collagène et de préparation moyen Slice Culture <ol><li> Préparer le mélange de collagène et d&#39;un milieu de culture tranche d&#39;environ une heure avant de trancher. </li><li> Pour 300 t plype 1 collagène ajouter 100 ul solution à 0,1% d&#39;acide acétique et 100 ml 5 x milieu L15. Vortex bien après chaque addition. La solution doit virer au jaune. </li><li> Maintenant, ajoutez du bicarbonate de 15-20 pi de sodium à 7,5% et de manière approfondie vortex. La solution doit devenir légèrement rosée, et le volume de bicarbonate de sodium requise pour cela peut varier. Gardez sur la glace et maquillage frais à chaque fois. </li><li> Pour 10 ml de milieu neurobasal ajouter B-27 supplément et Glutamax, à une concentration de 1 x final et une solution à 10 gentamicine ul. </li><li> Lieu moyenne dans un incubateur à 37 ° C tamponnée avec 5% de CO 2. Laisser la partie supérieure du récipient lâche pour lui permettre de s&#39;équilibrer avec le CO 2. </li></ol> 4. Culture Slice <ol><li> Retirer embryons à partir d&#39;œufs et se laver dans du milieu L15. </li><li> Lieu dans une boîte de culture tissulaire avec une couche de Sylgard au fond et les fixer à travers les entourant extra-embryonnaire de telle sorte que les membranes sont tendus. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un microroknife, embryon tranche aussi droite que possible à travers la région d&#39;intérêt. Pour la moelle épinière, des tranches doit être comprise entre 1-2 somites épais. Laissez tranches attachés à l&#39;embryon pendant que vous coupez d&#39;autres embryons afin de ne pas les perdre. </li><li> Préparer une spatule 200 micropipette ul en coupant ~ 1 mm de la pointe et en joignant cette page à un p2 ou p10. Cette astuce va être utilisé pour transférer les tranches de la moelle épinière dans le plat à fond de verre. Un pourboire de 10 ul n&#39;est pas assez large pour ramasser tranches. </li><li> Manteau à l&#39;intérieur de la pointe avec du collagène par pipetage 1 mix collagène ul préparé plus tôt. Laissez pendant 1-2 minutes, puis rincer à l&#39;milieu L15. Cela permettra d&#39;éviter le tissu de coller à l&#39;intérieur de la pointe. </li><li> Détachez tranche de l&#39;embryon en utilisant un microknife et retirer de l&#39;antenne en utilisant un p2 ou p10 munie d&#39;une douille 200 pi et mis à 1 pl. Essayez de prendre place en tant que milieu le moins possible. </li><li> Vortex du mélange de collagène et de goutte 5-8 pi de ce message à l&#39;antenne de poly-L-lysine revêtu. </li><li> ImmediaTely mis tranche embryon dans le collagène et la position en place avec une paire de pinces fines. Tranches doit être placé de sorte que le côté à imager est alignée avec la lamelle. Le tissu doit adhérer au revêtement poly-L-lysine sur la lamelle. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que vous avez plusieurs tranches sur la lamelle. Nous pouvons généralement placer 6-9 tranches sur un plat. </li><li> Une fois toutes les tranches sont en place, couvrir le plat et laissez le collagène de mettre pendant 20 minutes. Certaines des premières collagène placé peut-être déjà commencé à se dessécher. Pour éviter cela, ajoutez une petite quantité de L15 à ces avant de recouvrir. </li><li> Une fois réglé, ajouter prudemment 2ml milieu de culture tranche qui a été équilibrée dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant au moins une heure. Des précautions doivent être prises pour ne pas déloger le collagène de la lamelle. </li><li> Placer dans un 37 ° / 5% de CO 2 incubateur et permettent de récupérer les tranches pendant au moins 3 heures avant l&#39;imagerie. S&#39;il n&#39;ya pas de placer le plat d&#39;humidité, dans un esprit boîte de plexiglasha peu de papier absorbant humide dans un coin. </li></ol> 5. Tranches d&#39;embryons d&#39;imagerie <ol><li> Nous utilisons un Core DeltaVision grand champ microscope équipé d&#39;une chambre de l&#39;environnement StationMeteo à des tranches d&#39;image. La chambre est maintenue constante à 37 ° C, avec un groupe CO 2 Dispositif de perfusion afin de maintenir la platine du microscope à 5% de CO 2/95% d&#39;air. </li><li> L&#39;imagerie est normalement effectuée en utilisant un 40 x / 1,30 lentille à immersion d&#39;huile et de NA images sont capturées avec un HQ2 Coolsnap refroidi caméra CCD. </li><li> Z-sections sont capturés tous les 1,5 um à 45 um tissus. Le temps d&#39;exposition doit être maintenue aussi basse que possible. Nous avons l&#39;habitude d&#39;exposer pour la 5-50 ms pour chaque section en Z. Les images sont capturées toutes les 7 minutes et jusqu&#39;à 9 tranches peuvent être visités en utilisant le système de point précis DeltaVision de visiter fonction. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple en accéléré séquence d&#39;une cellule progénitrice moelle épinière estFig. 2a et Movie 1 correspondant. L&#39;imagerie a été commencé sur une tranche de la moelle épinière de deux jours-vieux (stade HH 12) embryon. Cette cellule a été transfectées avec une construction exprimant GFP-αTubulin. Au cours de ce stade précoce, les cellules progénitrices neurales subissent principalement les divisions de mode géniteur-souches au cours de laquelle les cellules se divisent pour générer deux autres cellules progénitrices du cyclisme. Fig. Film 2b et correspondant 2 montre une cellule transfectée avec GFP-GPI (GPI ancrées GFP), le marquage de la membrane cellulaire. Cette cellule subit une division au cours de laquelle le processus de base se divise en deux et est également hérité par les cellules filles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figure 1. Protocole de culture Tranche d&#39;imagerie time-lapse. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figure 2. B portableehavior au cours du développement normal de la moelle épinière. (a) les cadres sélectionnés à partir de Film 1. Cellule exprimant la GFP-tubuline divise avec un plan de clivage qui est perpendiculaire à la surface apicale (2 h 20 min), générer deux cellules filles qui divisent une fois de plus (24 h 23 min et 25 h 54 min). (B) les cadres sélectionnés à partir de Movie 2. Cellules transfectées avec GFP-GPI subit la division cellulaire au cours de laquelle le processus de base est divisé (flèches blanches) et également hérité par les cellules filles. Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> . Movie 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous présentons ici une analyse de l&#39;imagerie nouvelle time-lapse pour surveiller le comportement des cellules dans la culture tranche de poulet embryonnaire. Ce test permet l&#39;imagerie haute résolution des tissus vivants pour un maximum de 70 heures, bien que les délais entre 24-48 heures sont plus faciles à capturer. L&#39;utilisation d&#39;un objectif NA élevés du pétrole et des intervalles relativement courts entre-temps des points permet l&#39;acquisition d&#39;images à haute résolution, ainsi que ce qui nous permet de surveiller le comportement des cellules qui se produit souvent rapidement, et peuvent facilement passer inaperçus au cours classique imagerie time-lapse en utilisant confocale microscopie. Le principal avantage de ce test est la capacité de cellules d&#39;image sur de longues périodes de temps. L&#39;utilisation de grand champ 6 au lieu de confocale à balayage laser 7 microscopie est essentiel pour cela. La microscopie confocale a traditionnellement offert plusieurs avantages par rapport à champ large microscopie, y compris la capacité à prendre des sections optiques et d&#39;éliminer de l&#39;information sont directement axées <sup&gt; 7, mais l&#39;utilisation d&#39;un trou d&#39;épingle conduit à une perte de lumière au détecteur 8, à l&#39;exclusion d&#39;une quantité importante d&#39;informations, et nécessitant des temps d&#39;exposition plus longue. À grand champ microscopie, d&#39;autre part, utilise illumination à fond plein et toute la lumière passant à travers l&#39;objectif est envoyé au détecteur. Ceci, couplé avec un rendement quantique élevé refroidi dispositif à couplage de (CCD) assure l&#39;imagerie avec un signal haute par rapport au bruit par rapport à la microscopie confocale 9, avec des temps d&#39;exposition très rapides. Dans notre application, nous devons l&#39;image pendant de longues périodes, record piles 3D et finalement résoudre les petits-près-diffraction des structures limitées. Bien que la microscopie confocale empêche l&#39;extérieur de la focalisation de la lumière de jamais atteindre le détecteur, et donc de réduire de façon significative de fond dans épaisseur, à forte densité de marqués échantillons 7, 8, il ne réalise qu&#39;une utilisable signal à bruit d&#39;entrée de lumière avec beaucoup plus grande que large 10 microscopie en champ. Pour sparsel très sensible à la lumièreéchantillons y étiquetés comme nos électroporées tranches de la moelle épinière, par conséquent, la microscopie en champ large est plus performant que la microscopie confocale. Lorsqu&#39;il est combiné avec la restauration d&#39;images par déconvolution, qui élimine de l&#39;information mise au point et améliore le contraste, à champ large est alors particulièrement bonne pour la détection de petits objets faibles 11. Bien que n&#39;étant pas approprié pour toutes les expériences d&#39;imagerie des tissus, cette approche a été très efficace pour notre application d&#39;imagerie cellulaire en direct. Le choix de la protéine fluorescente est un facteur important qui peut influer sur la survie des cellules. Nous constatons que les meilleurs résultats sont obtenus à partir de constructions qui utilisent la protéine fluorescente verte (GFP) 12 en tant que marqueur. Nous sommes en train d&#39;évaluer une gamme de protéines fluorescentes rouges qui peuvent être efficacement utilisés en combinaison avec la GFP pour le canal de temps dual est caduque. Il existe une variété de ces protéines disponibles 13. Bien que de nombreuses protéines sont stables sous forme de fusions avec une protéine fluorescente, Certaines protéines peuvent être rendus instables par fusion, ce qui réduit la viabilité des cellules. Dans de tels cas, l&#39;utilisation de constructions contenant un site d&#39;entrée interne des ribosomes (IRES) est utile pour séparer la protéine d&#39;intérêt de la protéine fluorescente. Lorsque les tranches d&#39;imagerie de la moelle épinière, des précautions doivent être prises pour minimiser l&#39;exposition à la lumière fluorescente. Les oculaires du microscope doit être utilisé uniquement avec la lumière transmise (fond clair) pour localiser la position et les tranches. Images fluorescentes doivent toujours être acquis à l&#39;aide du logiciel microscope en utilisant un minimum de temps d&#39;exposition. Ceux-ci devraient être conservés dans la gamme de 5-50 ms et l&#39;utilisation de filtres de densité neutre devrait être expérimenté. Bien que les temps d&#39;exposition plus longs peuvent produire initialement des images plus claires, les effets phototoxiques de exposition à la lumière fluorescente peut conduire à la mort cellulaire. Les 5-10 premières um de tissu qui est la plus proche de la lamelle ne doit pas être représenté comme cette région contient des tissus qui peut avoir été endommagé pendant letranchage. Bien que les exemples présentés ici sont des embryons au stade électroporés HH 10 et imagées 6-7 heures plus tard, cette méthode peut être utilisée pour les embryons à Son Altesse l&#39;étape 18. Aux stades ultérieurs, la moelle épinière est beaucoup plus grande et est donc difficile de trancher la main. Dans ces cas, l&#39;incorporation des embryons à faible point de fusion d&#39;agarose et la coupe avec un vibratome peut donner de meilleurs résultats. Même si nous présentons cette analyse comme une méthode pour l&#39;imagerie de cellules dans la moelle épinière en développement, cette approche a également été modifié pour d&#39;autres images des tissus embryonnaires, y compris le sensorielle placodes 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> WillCo vaisselle </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% dans du Tris </td></tr><tr><td> Le verre borosilicate capillaires </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 mm de diamètre externe, 0.58mm diamètre intérieur </td></tr><tr><td> Électrodes (Genetrodes, dans ovo, en forme de L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> Or plaqué 5mm </td></tr><tr><td> ECM 830 carré générateur d&#39;impulsions </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> dans electroopration ovo </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Tapez collagène I de rat </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu L-15 (en poudre) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L dans l&#39;eau distillée pour solution 5x </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> Solution à 7,5% </td></tr><tr><td> Milieu Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> sans rouge de phénol </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Solution 100x </td></tr><tr><td> B-27 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> La gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Du milieu L15 (liquide 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 pente degré </td></tr><tr><td> Goupilles en acier inoxydable sans tête </td><td> Watkins et Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Format A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 élastomère </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> Système DeltaVision microscope de base </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 caméra CCD </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

Le cordon épinière embryonnaire se compose de vélo cellules progénitrices neurales qui donnent lieu à un grand pourcentage des cellules neuronales et gliales du système nerveux central (SNC). Bien que beaucoup est connu au sujet des mécanismes moléculaires qui motif de la moelle épinière et de susciter la différenciation neuronale 1, 2, nous manquons d&#39;une compréhension profonde de ces événements précoces au niveau du comportement des cellules. Il est donc essentiel d&#39;étudier le comportement des progéniteurs neuronaux en temps réel car ils subissent la neurogenèse. Dans le passé, imagerie en temps réel des tissus embryonnaire précoce a été limitée par les cellules / tissus viabilité de la culture ainsi que les effets phototoxiques de l&#39;imagerie de fluorescence. Ici, nous présentons un nouveau test pour l&#39;imagerie des tissus tels pendant de longues périodes de temps, en utilisant un ex vivo roman protocole de culture tranche et à grand champ microscopie à fluorescence (Fig. 1). Cette approche permet d&#39;atteindre à long terme time-lapse de surveillance de poussin embryonnaire scellules progénitrices de la moelle Pinal avec une résolution spatiale et temporelle. Ce test peut être modifiée à l&#39;image de toute une gamme de tissus embryonnaires 3, 4 En plus de l&#39;observation des comportements cellulaires et sub-cellulaire, le développement du roman et des journalistes très sensibles pour l&#39;activité des gènes (par exemple, la signalisation Notch 5) rend ce test un outil puissant permettant de comprendre comment de signalisation régule le comportement des cellules pendant le développement embryonnaire.

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High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

L&#39;imagerie des tissus embryonnaires en temps réel est difficile sur de longues périodes de temps. Nous présentons ici une analyse pour surveiller les changements cellulaires et sub-cellulaire de la moelle épinière de poulet pendant de longues périodes avec une résolution spatiale et temporelle. Cette technique peut être adaptée pour d&#39;autres régions du système nerveux et de l&#39;embryon en développement.

Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K vues.  University of Dundee, Dundee, UK. L'imagerie des tissus embryonnaires en temps réel est difficile sur de longues périodes de temps. Nous présentons ici une analyse pour surveiller les changements cellulaires et sub-cellulaire de la moelle épinière de poulet pendant de longues périodes avec une résolution spatiale et temporelle. Cette technique peut être adaptée pour d'autres régions du système nerveux et de l'embryon en développement.

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Recherche

Neurosciences

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Haute résolution magnétique fonctionnelle Méthodes d&#39;imagerie par résonance mésencéphale humain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Haute résolution<em&gt; In Vivo</em&gt; Protocole de segmentation manuelle pour les sous-zones de l&#39;hippocampe humain Utilisation 3T imagerie par résonance magnétique

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Une procédure pour l&#39;implantation d&#39;une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du cordon spinal de souris

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Haute résolution structurelle Imagerie par résonance magnétique de la sous-cortex humain<I&gt; In Vivo</I&gt; Et Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilisation de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...