Ce travail a été soutenu par SFB 604, DFG MO 1421/2-1 et Krebshilfe 107089 (HM). AS est récipiendaire du prix du jeune chercheur de la tumeur du Children Foundation (New York, États-Unis).

La présente étude a été réalisée selon la protection des animaux Loi de la République fédérale d&#39;Allemagne (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) et a été approuvé par l&#39;Office d&#39;Etat de Thuringe pour la sécurité alimentaire et la protection des consommateurs (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. Configuration des mesures <ol><li> Anesthésier les souris par isoflurane / O 2 inhalation - pour l&#39;initiation de l&#39;anesthésie à 3%, pour l&#39;entretien 2% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène à 100% (Figure 1). Confirmez l&#39;anesthésie suffisamment en testant les réflexes simples comme des réflexes et des tests de sensibilité pour la douleur de bas grade mouvement. L&#39;utilisation de la pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l&#39;anesthésie est recommandé mais pas indispensable car la procédure prend généralement que 30 min / animaux au total. En cas d&#39;expériences de survie, d&#39;administrer en temps opportun plus analgésiques à action pour la gestion de la douleur postopératoire. </li><li> Raser les poils qui recouvrent les pattes arrière avec un rasoir électrique et effectuer l&#39;épilation avec une crème d&#39;épilation disponibles dans le commerce alors que les animaux sont déjà sous analgésie. Afin de maintenir le statut exempt d&#39;agents pathogènes tout au long de la procédure, porter des gants aseptiques et toujours utiliser des instruments soigneusement nettoyées à l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Organe de contrôle de la stabilité de la température par une plaque de chauffage de retour et contrôlée sonde thermo rectale (figure 2). Si nécessaire, s&#39;il vous plaît utiliser un champ stérile pour couvrir la plaque de chauffage entre les animaux afin de maintenir un environnement expérimental stérile. En outre, il est recommandé d&#39;utiliser une plaque de chauffage, qui est commandé électroniquement par l&#39;intermédiaire d&#39;un capteur intégré pour limiter la température de chauffage à ≤ 40 ° C, afin d&#39;éviter des dommages aux tissus. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51181/51181fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51181/51181fig1.jpg" /> Figure 1. Expconfiguration erimental montrant une souris anesthésiée avec les membres postérieurs rasé. </li><li> Prenez l&#39;électrocardiographie (ECG) pour surveiller le rythme cardiaque comme un paramètre essentiel. Installez trois électrodes pour les enregistrements ECG comme suit: une électrode sous la peau de chaque patte avant et une électrode sous la peau dans la région du cou. </li><li> Électrodes Lieu d&#39;anneau utilisant un gel de contact pour la résistance de conductivité / transfert optimal. L&#39;électrode de détection (marqué en noir) est placé à la position où le muscle gastrocnémien a son diamètre maximal. L&#39;électrode de référence (indiqué en rouge) est placé juste en dessous de l&#39;électrode de détection. Note: S&#39;il vous plaît voir «Tableau des matériaux» pour les détails d&#39;équipement. </li><li> Marquez les positions correctes de mesure des distances prédéterminées mais cohérentes entre la stimulation proximale et distale du nerf sciatique et l&#39;électrode de plomb. Proposition expérimentale: À une distance de 4 mm de l&#39;électrode de détection, la stimulation distale aura lieu.Dans une distance de 16 mm à l&#39;électrode de détection, la stimulation proximale sera réalisée (figure 2). </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51181/51181fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51181/51181fig2.jpg" /> Figure 2. D&#39;image représentative montrant la situation expérimentale juste avant le début des mesures. La flèche blanche indique la position du palpeur (noir) et de référence (rouge) à l&#39;électrode muscle jumeau de la patte arrière gauche. La stimulation par des électrodes à aiguille est réalisée à des positions définies par rapport à l&#39;électrode de détection noir. Le point de stimulation distale (marque noire avec &quot;ds&quot; à la patte arrière gauche) a une distance de 4 mm de l&#39;électrode de détection; le lieu de la stimulation proximale (marque noire &quot;ps&quot;) est de 16 mm de distance. La ligne rouge sur la patte postérieure droite montre l&#39;env<html> iMate trajet anatomique du nerf sciatique. En outre, les positions approximatives des muscles des pattes postérieures pertinents sont présentés comme points de repère. L&#39;astérisque indique la sonde thermique rectale. 2. Mesure <ol><li> Principe: Effectuez une série de stimulations nerveuses avec des impulsions carrés d&#39;ondes simples générés de façon répétitive de 0,1 msec par jetables 28 G électrodes aiguilles monopolaires (taux de répétition de 200 ms, voir la figure 3A). Pour l&#39;analyse des données hors de la ligne, il est recommandé d&#39;acquérir simultanément des signaux de stimulation neuromusculaire avec la courbe de réponse en fonction (Figure 3B) du fait de la stimulation du nerf. Moyenne d&#39;une série de réponses maximales («réponse de la fonction neuromusculaire représentant&quot;) pour une analyse ultérieure des données. Afin de produire des données fiables, fiche et au moins trois courbes plus tard moyennes indépendantes, optimales réponse par site de stimulation et animale. p_upload/51181/51181fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Procédure d&#39;acquisition de données et d&#39;analyse (présentation schématique). Impulsions générées sont appliquées répétitivement au nerf sciatique par l&#39;intermédiaire d&#39;électrodes à aiguille (rangée supérieure sur la figure 3A). Simultanément, plusieurs courbes de réponse neuromusculaire correspondantes sont enregistrées (rangée inférieure de la figure 3A). Lorsque la moyenne et agrandie, des courbes de réponse neuromusculaire due à des impulsions de stimulation (rangée supérieure sur la figure 3B) présentent les propriétés suivantes caractéristiques (rangée inférieure sur la figure 3B): Temps de latence de la réponse de signal ainsi que la durée et l&#39;amplitude du signal sont indiquées et peuvent être obtenu pour les calculs et les statistiques suivantes. Conduction du signal irrégulière et / ou enregistrements sous-optimaux aboutissent généralement à diverses déformations de signaux avec plus que juste une positive et une déviation négative ou déformation du signal(Forme bimodale) avec une amplitude réduite (figure 3C). </li><li> Effectuer une stimulation avec une électrode proximale de l&#39;aiguille à la position déterminée (&quot;ps&quot; sur la figure 2). <ol><li> Afin d&#39;obtenir les meilleures conditions d&#39;enregistrement avec des amplitudes maximales, de visualiser des courbes de réponse réels simultanés au processus de stimulation. En faisant cela, l&#39;expérimentateur est en mesure d&#39;évaluer immédiatement la forme de courbes de réponse ainsi que la taille de l&#39;amplitude. </li><li> Le cas échéant, un peu d&#39;attention et de manipuler la position et / ou l&#39;angle de l&#39;aiguille de stimulation par rapport au nerf sciatique. Cette optimisation douceur de conditions de stimulation permet d&#39;atteindre des amplitudes constantes avec la plus grande valeur possible, et une courbe de réponse typique de forme biphasique (figure 4). </li></ol></li><li> Effectuer une stimulation distale avec une électrode à aiguille en position déterminée (&quot;ds&quot; dans la figure 2). </li><li> Après des achèvementsn de la mesure, de transférer la souris testée à une cage séparée jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Ne pas laisser un animal sans surveillance, et en compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait totalement récupéré de l&#39;anesthésie. Administrer en temps opportun plus analgésiques à action pour la gestion de la douleur postopératoire. L&#39;administration systémique de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les opioïdes sont recommandés pour 1-3 jours. </li><li> Sinon, sacrifier la souris encore anesthésiés de façon rapide et sans cruauté sans autre douleur pour l&#39;animal, par exemple par dislocation cervicale. </li></ol><img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51181/51181fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51181/51181fig4.jpg" /> Figure 4. Illustration de déterminer les enregistrements CMAP avec des amplitudes maximales. Une série d&#39;inscription complète est présentée. (A </strong&gt;) point d&#39;insertion de la réponse de CMAP minime. (B) les résultats du mouvement de l&#39;aiguille légère de stimulation dans les enregistrements CMAP avec amplitudes maximales. (C) D&#39;autres changements dans le placement de l&#39;aiguille produisent enregistrements CMAP avec des amplitudes différentes, y compris près du maximum des amplitudes. (D) la stimulation de remplacement de l&#39;aiguille avec des enregistrements CMAP série d&#39;amplitudes quasi-maximales. Remarque: décroissance typique des amplitudes CMAP peut se produire lors de la stimulation répétitive à optimale site de stimulation 12, 13. Les astérisques indiquent les enregistrements CMAP avec des amplitudes maximales représentées pour la moyenne. 3. Analyse <ol><li> Extraire des paramètres de conduction nerveuse sur la base de l&#39;ensemble neuromusculaire représentant de réponse de la fonction de données en utilisant un logiciel approprié (par exemple AtisaPro). Note: S&#39;il vous plaît traiter détermination de données en fonction du temps avec un soin particulier car le point d&#39;inflexion de détermination composé action motrice potrentiel (CMAP) début et la fin peut être difficile. Une procédure avec une reproductibilité garantie est donnée à la figure 3B, où les tangentes sur des détournements de signal après le début et avant la fin sont utilisés. </li><li> Calculez «signal latence» et les valeurs «CMAP. <ol><li> Latence »représente le délai entre la stimulation et CMAP apparition, tandis que le laps de temps entre CAMP début de déviation initiale négative à parapher retour à la ligne de base est appelé« durée CMAP. Utiliser la différence entre les latences distales et proximales pour calculer la vitesse de conduction en même temps que la distance entre les sites de stimulation distale et proximale. = vitesse de conduction de latence / distance entre les sites de stimulation </li><li> CMAP &#39;(composé potentiel d&#39;action du moteur) amplitude représente l&#39;amplitude entre le point positif et négatif maximum de redressement du signal CMAP (donnée en mV). CMAP = valeur &quot;point de retournement positif» - valeur «négative redressement point &#39; </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kimura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3rd+ed.">3rd ed.</a> Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , (2001).</li><li>Rutkove, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+neuromuscular+electrophysiology.">Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology.</a> Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).</li><li>Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+caudal+tail+and+sciatic+motor+nerve+conduction+studies+in+adult+mice:+technical+aspects+and+normative+data.">Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data.</a> Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).</li><li>Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+P0-deficient+mice+resemble+human+hereditary+neuropathies+linked+to+P0+gene+mutations.">Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations.</a> Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).</li><li>Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+insulin+to+maintain+normal+nerve+function+during+high-frequency+stimulation+in+diabetic+rat+tail+nerves.">Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves.</a> Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).</li><li>Magda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrodiagnostic+abnormalities+and+criteria+in+a+cohort+of+patients+with+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy.">Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy.</a> Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).</li><li>Lindberg, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuropathy+in+porphobilinogen+deaminase-deficient+mice+imitates+the+peripheral+neuropathy+of+human+acute+porphyria.">Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria.</a> J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).</li><li>Massey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromyography+in+disorders+of+neuromuscular+transmission.">Electromyography in disorders of neuromuscular transmission.</a> Sem. Neurol. 10, 6-11 (1990).</li><li>Stalberg, E., Falck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+electromyography+in+neurology.">The role of electromyography in neurology.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 103, 579-598 (1997).</li><li>Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+model+of+sciatic+nerve+conduction+in+healthy+and+septic+mice:+reliability+and+normative+data.">Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data.</a> Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).</li><li>Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia+on+measures+of+nerve+conduction+velocity+in+male+C57Bl6/J+mice.">The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice.</a> Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).</li><li>Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+and+stretch+mechanosensitivity+of+peripheral+nerve+fibres+following+local+inflammation+of+the+nerve+trunk.">Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk.</a> Pain. 117, 462-472 (2005).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+and+morphometry+of+the+alpha-+and+beta-fiber+populations+in+the+normal+and+regenerating+rat+sciatic+nerve.">Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve.</a> Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le protocole décrit fournit une méthode simple et fiable pour déterminer nerf sciatique propriétés de conduction sur des souris anesthésiée sans la nécessité d&#39;exposer le nerf d&#39;intérêt. Néanmoins, cette procédure expérimentale provoque des lésions du tissu par ponction à l&#39;aiguille. Il est donc raisonnable d&#39;une option de sacrifier les animaux après la fin des enregistrements. Cependant, par rapport à d&#39;autres procédures plus invasives, qui nécessitent l&#39;exposition du nerf av...

Mesures électrophysiologiques sont un outil indispensable pour étudier l&#39;intégrité fonctionnelle des nerfs périphériques dans des environnements cliniques et de laboratoire. Chez l&#39;homme, un grand nombre de troubles neuromusculaires et des neuropathies diagnostic repose sur des mesures électrophysiologiques. En mesurant les propriétés nerveuses que la vitesse de conduction et l&#39;amplitude possibles du signal, il est possible de caractériser l&#39;origine grossière de maladies des nerfs périphériques. La vitesse de conduction nerveuse est très dépendante de propagation de signal rapide est activée par la myélinisation. Par conséquent, les processus de démyélinisation montrent généralement diminué la vitesse de conduction 4. Le potentiel d&#39;action composé de moteur (CMAP) - en corrélation avec le nombre d&#39;axones fonctionnels - est un indicateur de lésions axonales quand considérablement réduit 5. Ainsi, au moyen de procédés électrophysiologiques l&#39;étiologie de la lésion des nerfs périphériquespeut être discriminé, comme par neuropathies héréditaires, la neuropathie diabétique 6,7 8,9, polyneuropathies inflammatoires chroniques démyélinisantes (CIDP), 10 ou des neuropathies métaboliques 11. Normalement, dans l&#39;application humaine des enregistrements non invasifs sur le nerf saphène ou ulnaire sont préférés. Chez la souris, il est facile d&#39;analyser les propriétés nerveuses du nerf sciatique, le plus grand nerf du système nerveux périphérique (SNP) contenant à la fois grand - et les axones de petit calibre du système moteur et sensoriel. La procédure comme l&#39;a démontré ici est une méthode rapide, simple et fiable de mesurer toutes les valeurs standards pertinents pour électrophysiologie sur les nerfs périphériques chez la souris intacte. En prenant des enregistrements à partir d&#39;un organisme préservé, les conditions physiologiques de l&#39;environnement de nerf sont garantis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Concentric Needle Electrodes (Stimulation)</td>
			<td style="width:311px;">Natus Medical Incorporated 
			San Carlos, CA 94070, USA</td>
			<td style="width:119px;">9013S0901</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Digital Ring Electrodes (Recording)</td>
			<td style="width:311px;">Natus Medical Incorporated 
			San Carlos, CA 94070, USA</td>
			<td>9013S0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ToM - Tower of Measurement (A/D converter)</td>
			<td>GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AtisaPro, Data acquisition &#38; analysis software</td>
			<td>GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HSE-Stimulator T</td>
			<td colspan="2">Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves

Les études électrophysiologiques permettent une classification rationnelle des diverses maladies neuromusculaires et sont de l&#39;aide, ainsi que des techniques neuropathologiques, dans la compréhension de la physiopathologie sous-jacente 1. Nous décrivons ici une méthode pour réaliser des études électrophysiologiques sur les nerfs sciatiques de souris in vivo. Les animaux sont anesthésiés avec de l&#39;isoflurane, afin d&#39;assurer une analgésie pour les souris testées et perturbées environnement de travail au cours des mesures qui ont environ 30 min / animal. A température constante de 37 ° C est maintenue par une plaque de chauffage et de mesure en continu par une sonde thermo rectale 2. En outre, un électrocardiogramme (ECG) est régulièrement enregistré au cours des mesures afin de surveiller en permanence l&#39;état physiologique des animaux étudiés. Des enregistrements électrophysiologiques sont effectués sur le nerf sciatique, le plus grand nerf de ee système nerveux périphérique (SNP), en fournissant le membre postérieur de la souris avec des faisceaux de fibres à la fois motrices et sensorielles. Dans notre protocole, les nerfs sciatiques rester in situ et par conséquent n&#39;ont pas besoin d&#39;être extrait ou exposé, ce qui permet des mesures sans aucune irritation des nerfs indésirables avec des enregistrements réels. En utilisant des électrodes à aiguilles appropriées 3, nous effectuons tous les deux proximale et distale stimulations nerveuses, l&#39;enregistrement des potentiels transmises avec des électrodes de détection à muscles jumeaux. Après traitement des données, fiable et valeurs très cohérentes pour la vitesse de conduction nerveuse (NCV) et le composé potentiel d&#39;action du moteur (CMAP), les paramètres clés pour la quantification de fonctionnement brut de nerf périphérique, peuvent être atteints.

<html> Nous avons effectué une série de mesures électrophysiologiques in vivo sur les nerfs sciatiques de 12 souris au total pour cette étude: 6 animaux de chaque sexe. Les mesures ont été réalisées avec le protocole présenté et livrés aux résultats suivants: Les deux souris mâles et femelles présentent une vitesse sciatique moyen de conduction nerveuse de l&#39;ordre de 20 m / sec (figure 5). Ceci est cohérent avec d&#39;autres mesures dans la littér...

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In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Les mesures de propriétés de conduction nerveuses in vivo illustrent un outil puissant pour caractériser différents modèles animaux de maladies neuromusculaires. Ici, nous présentons un protocole simple et fiable qui analyse électrophysiologique sur les nerfs sciatiques des souris anesthésiées peut être effectuée.

En Vivo mesures électrophysiologiques sur les nerfs sciatiques souris

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

in-vivo-electrophysiological-measurements-on-mouse-sciatic-nerves

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

33.0K vues.  Fritz Lipmann Institute.  Les mesures de propriétés de conduction nerveuses in vivo illustrent un outil puissant pour caractériser différents modèles animaux de maladies neuromusculaires. Ici, nous présentons un protocole simple et fiable qui analyse électrophysiologique sur les nerfs sciatiques des souris anesthésiées peut être effectuée. 

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Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Mesures électrophysiologiques à partir d&#39;un système de Moth olfactive

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Recherche

Neurosciences

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are based on behavioural and physiological body reactions, such as crying, body movements or changes in facial expression. While these measures demonstrate that infants mount a response following noxious stimulation, they are limited: they are based on activation of subcortical somatic and autonomic motor pathways that may not be reliably linked to central sensory processing in the brain. Knowledge of how the central nervous system responds to noxious events could provide an insight to how nociceptive information and pain is processed in newborns.
The heel lancing procedure used to extract blood from hospitalised infants offers a unique opportunity to study pain in infancy. In this video we describe how electroencephalography (EEG) and electromyography (EMG) time-locked to this procedure can be used to investigate nociceptive activity in the brain and spinal cord.
This integrative approach to the measurement of infant pain has the potential to pave the way for an effective and sensitive clinical measurement tool.

The assessment and treatment of pain in infants is difficult because infants cannot verbally report their experience. In this video we describe quantitative electrophysiological methods and analysis techniques that can be used to measure the response to noxious events from the infant nervous system.

Mesures électrophysiologiques et d&#39;analyse de la nociception chez les nourrissons humains

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

In Vivo Électrophysiologique mesure du potentiel d’Action musculaire composé de membres antérieurs dans des modèles murins de la dégénérescence des motoneurones

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...