Nous remercions Alberto Severini et Vanessa Goleski de l&#39;aide pour le développement de tests et de commentaires critiques sur ce manuscrit. Ce travail a été financé par l&#39;Agence de santé publique du Canada et le Programme d&#39;aide la recherche industrielle (Conseil national de recherches du Canada). Un appui supplémentaire a été obtenue à l&#39;Université de la Saskatchewan Fonds de publication.

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Un diagramme schématique illustrant la procédure générale est présentée dans la figure 1. 1. Perle de couplage Cette section décrit les méthodes qui seront utilisées pour le couplage des sondes oligonucléotidiques de billes de polystyrène Luminex (voir tableau 2). Les volumes sont légèrement adaptées pour l&#39;évaluation des nouvelles sondes de capture sur une base expérimentale, ces volumes sont indiqués entre parenthèses. <ol><li> Retirer 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) de poudre de -20 ° C et il dessicateur à température ambiante. </li><li> Resuspendre les microsphères par sonciation dans un sonicateur bain-marie pendant 20 secondes, puis vortex 20 secondes environ. </li><li> Transfert 400 pi (100 pi) de microsphères dans un tube Eppendorf (ce qui correspond à 5x10 6 ou 1,25 x10 6 microsphères). Luminex suggère l&#39;utilisation de tubes de faible teneur en protéines microcentrifugeuse contraignant (par exemple des tubes Eppendorf LoBind protéines, numéro de catalogue 0030 108.094) pour empêcher les billes de découplés de coller aux tubes et interférer avec la récupération de billes. Nous n&#39;avons pas trouvé que cela soit un problème en utilisant la norme microtubes polypropylène, qui nous utilisent habituellement (par exemple numéro de catalogue VWR 87003-298). </li><li> Pellet à 14000 xg pendant 1 minute. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les microsphères dans 50 pi (12,5 pi) de la température ambiante 0,1 M 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à pH 4,5. </li><li> Préparer une nouvelle solution d&#39;EDC à 10 mg / ml dans l&#39;eau. <ol><li> Préparer moins de 1 ml de cette solution en pesant 5-10 mg d&#39;EDC à l&#39;échelle d&#39;analyse, puis en ajoutant de l&#39;eau à 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Ajouter 1 nmol de 5&#39;-amino oligonucléotide de capture C12-modifié (tableau 2) pour les microsphères et les mélanger au vortex. 1 nmol est de 5 l de 200 uM oligonucléotides. </li><li> Ajouter 2,5 l de solution fraîche d&#39;EDC à l&#39;microsphères et mélanger au vortex pendant 5 secondes. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l&#39;obscurité. </li><li> Jeter la solution d&#39;EDC (étape 1.6) et de préparer un nouvel échantillon de 10 mg / ml d&#39;EDC dans l&#39;eau comme ci-dessus (étape 1.6). </li><li> Ajouter un autre ul 2.5 d&#39;EDC solution fraîche aux microsphères et de vortex pendant 5 secondes. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les billes en ajoutant 1 ml de 0,02% de Tween 20. Vortex (facultativement soniquer pendant 20 secondes ainsi) pour remettre les perles. </li><li> Centrifugeuse 14000 xg 1 minute. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Laver les billes à nouveau en ajoutant 1 ml de sulfate de sodium dodécyl 0,1% (SDS). Vortex (facultativement soniquer pendant 20 secondes ainsi) pour remettre les perles. </li><li> Centrifugeuse 14000 xg 1 minute. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les perles dans 100 ul (25 pi) de Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM de Tris-Cl pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0]. </li><li> Énumérer les perles dans un hémocytomètre ou compteur Coulter pour déterminer la concentration d&#39;actions. </li><li> Préparer un Master Mix microsphère en diluant chaque bourrelet à une concentration finale de 100 billes / ul dans du tampon TE. Piscine couplé perles correspondant aux complexes désiré de l&#39;essai (par exemple pour un dosage de 10-plex, mélanger 10 différentes billes couplées à une concentration finale de 100/μl de chaque bourrelet). </li><li> Stocker le Master Mix microsphère à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Le mélange peut être stockée pendant des mois s&#39;il est conservé dans ces conditions. </li></ol> 2. Chaperonine 60 universelle cible (cpn60 UT) la production d&#39;amplicons et la génération de brins simples. <ol><li> Générer la réaction en chaîne polymérase (PCR) de produit pour chaque échantillon. Inclure les phosphorothioate et amorces biotine modifiés 5 &#39;(tableau 1). Voir le tableau 3 pour les volumes à mélanger et à la concentration. </li><li> Immédiatement après la PCR est terminée, ajouter 2 pl (20 unités) de T7 exonuclease à chaque tube de PCR (le tampon de PCR suffira pour que la réaction T7). Incuber la réaction à température ambiante (~ 22-25 ° C) pendant 40 minutes. </li><li> A la fin de cette incubation, ajouter 12,5 ul de 0,5 M d&#39;éthylène diamine tétraacétique (EDTA) pH 8,0 et mélanger. Cela donne un total de ~ 64.5μl d&#39;un seul brin de produits PCR. </li></ol> 3. Hybridation d&#39;un seul brin de produits PCR pour des billes de polystyrène oligonucléotides couplés. <ol><li> Préchauffer l&#39;instrument à 60 ° C pour maintenir la température d&#39;hybridation pendant l&#39;analyse. Allumez le chauffe-plateforme utilisant le logiciel de l&#39;instrument et être sûr d&#39;utiliser le bloc de chauffage en cuivre qui s&#39;adapte à la plaque PCR de style qui contient le mélange de perles hybridées. </li><li> Resuspendre microsphère Mix Master (étape 1.20) avec une pipette, verser un montant approprié dans un tube Eppendorf, capuchon du tube, et soniquer dans un sonicateur bain-marie pendant 2 minutes. Sinon, pour assurer la cohérence absolue dans billes resuspension, le master mix microsphères peuvent être remises en suspension par vortex et de pipetage, puis sonication comme ci-dessus, puis distribuer la quantité désirée dans un tube en polypropylène Eppendorf. </li><li> Distribuer 17 l de simple brin produit de PCR (étape 2.2) dans les puits appropriés d&#39;un profil bas de 96 puits thermométrique PCR plaque (tableau 2). Ajouter 33 ul d&#39;extrait, mélange billes sonciated à chaque puits. Couvrir avec couvercle en silicone (tableau 2) et appuyez doucement. </li><li> Mettez la plaque dans le thermocycleur avec un programme d&#39;: 95 ° C pendant 5 min, 60 ° C pendant 10 min, 60 ° C détiennent, 60 ° C pendant 5 min, à la fin. Démarrez le programme. </li><li> Faire frais streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) solution; vous aurez besoin de 25 pi par puits (faire plusieurs puits en sus). Faire SA-PE solution en diluant stock de SA-PE (1 mg / ml) de 1:50 à 20 pg / ml avec 1x chlorure de tétraméthylammonium (TMAC) tampon (3 M TMAC; 0,1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Lorsque le thermocycleur arrive à la 60 ° étape maintenez C,ouvrir le couvercle, retirez le couvercle en silicone et d&#39;ajouter SA-PE solution directement dans chaque puits (NE PAS prendre la plaque de la thermocycleur). Replacez le couvercle en silicone, fermez le couvercle thermocycleur et reprendre le programme. </li><li> Lorsque le programme est terminé, prenez la plaque et rapidement à le transférer à la machine Bioplex à lire. Plaque doit être lu en 10 minutes. Lisez à 60 ° C; s&#39;assurer que les Bioplex a été préchauffée à cette température. Soyez certain que la hauteur de la sonde a été ajusté pour tenir compte de la plaque utilisée, comme décrit dans le manuel de l&#39;utilisateur pour l&#39;instrument utilisé. </li><li> Pour précision de perles et de détection de signal, les paramètres de grille sur la Bioplex doit être réglé en fonction du type de microsphères utilisées. Billes de polystyrène BioRad nécessitent un réglage porte de 4,335-10,000 tout microsphères magnétiques nécessitent un réglage du 5,000-25,000. Il ya aussi la possibilité d&#39;exécuter la plaque en utilisant le réglage de PMT haute qui augmente la valeur du gain journaliste. Ce que je peuxUGMENTATION l&#39;intensité de la baisse des signaux mais il est important notamment un contrôle approprié négatif comme un signal de fond sera également augmenté. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Un de nos objectifs dans le développement et l&#39;exécution du présent essai a été de le rendre aussi simple et rationnel que possible. Nous avons donc optimisé la critique post-amplification des mesures, y compris le temps du traitement T7 exonucléase et le temps d&#39;hybridation afin de développer un test qui peut être complété dans un délai raisonnable. Comme le montre la figure 2A, le traitement T7 de l&#39;amplicon est essentiel pour la génération de signaux, comme la plupart des sondes avaient peu ou pas de signal avec le traitement T7 courte ou pas. Le signal augmenté linéairement jusqu&#39;à 40 minutes environ, au moment où l&#39;augmentation du signal ralenti. Aucune dégradation du signal a été observé, même à 2 heures de temps de traitement T7, ce qui indique que la modification phosphorothioate des amorces est très efficace pour prévenir targela dégradation brin t comme décrit 15. Nous avons choisi 40 minutes pour le temps de traitement T7 à minimiser le temps de protocole global, mais il est clair à partir figure 2A que le traitement T7 peut durer beaucoup plus longtemps. Nous avons également déterminé l&#39;effet du temps d&#39;hybridation sur la génération du signal (figure 2B) et constaté que 10 minutes était suffisant pour le signal maximum, car aucune nouvelle augmentation du signal a été observée même après 4 heures d&#39;hybridation. Par conséquent, une étape d&#39;hybridation 10 minutes a été choisi, encore une fois de minimiser le temps de dosage global. Avec ces résultats à l&#39;esprit, et avec des techniques d&#39;extraction rapide de l&#39;ADN tels que InstaGene (Bio-Rad), le dosage global, y compris l&#39;extraction d&#39;ADN, la PCR et l&#39;analyse Luminex peut être complété en 4-5 heures. Sur une note d&#39;avertissement, le niveau d&#39;agrégation des billes de polystyrène pendant une course Luminex ou Bioplex peut avoir un impact majeur sur l&#39;efficacité du dosage. Le logiciel Bioplex affichera le niveau de perles d&#39;agrégation, qui survient lorsqueplus d&#39;un cordon est détectée dans le chemin laser et entraîne l&#39;exclusion du signal d&#39;hybridation de l&#39;agrégat. Apparente d&#39;agrégation de billes peut aussi être causée par toute particule qui n&#39;est pas la bonne taille pour une seule perle, et peut même être provoquée par des bulles d&#39;air. Dans un de ces événements, le signal de l&#39;agrégat perles, bulles d&#39;air, ou de particules est éliminée. Dans la plupart des cas, nous constatons que l&#39;agrégation billes est minime (figure 3A) et le niveau cible de 100 événements comptant pour chaque perle est facilement réalisable. Parfois, cependant, les perles présentent une modérée (figure 3B) ou sévère (figure 3C) niveau d&#39;agrégation. Dans ces cas, puisque la plupart des données sont supprimées, l&#39;instrument peut avoir des difficultés pour atteindre 100 événements par type de perle et les résultats peuvent être discutables. L&#39;étape de sonication (étape 3.2) vise à minimiser l&#39;agrégation de billes. De plus, le stockage des perles comme un mélange maître de microsphères diluée (1,20 étape) peut aider. Nous avons remarqué que TMAC excluant de la Hybribuffer dization - il en ajoutant au diluant SA-PE au lieu (étape 3.5) - permet de minimiser l&#39;agrégation de billes. En outre, si nous n&#39;avons pas testé cela, les perles magnétiques récentes disponibles auprès de Luminex ou BioRad On pense à afficher moins d&#39;une tendance à s&#39;agréger. Les résultats de l&#39;application d&#39;un tableau 5-plex Luminex ciblant G. vaginalis, A. vagin, L. iners, L. crispatus, et L. gasseri avec coloration de Gram des frottis correspondants prélèvement vaginal sont présentés dans la figure 4. Ces échantillons ont été prélevés à partir d&#39;un seul individu à plusieurs moments. Au temps 0, l&#39;individu a été diagnostiqué avec BV basée sur la coloration de Gram (figure 4A) et les résultats de cette Luminex même échantillon (figure 4B) montrent que sur les organismes représentés dans le tableau, G. vaginalis a été la plus répandue, alors que A. vagin et L. iners étaient également positifs. Neuf jours plus tard, l&#39;individu était toujours positive et le BV signal pour G. vaginalis a considérablement augmenté alors que A. vagin et L. iners étaient encore positifs. Surtout, après ce temps la personne a commencé la transition vers un microbiote normal que les bacilles à Gram positif est devenu détectable dans le frottis (figure 4A) alors que le signal pour G. vaginalis faibli et que le signal pour L. iners augmenté (figure 4B). Par notre définition originale de BV avec cette méthode (échantillons positifs pour G. vaginalis et / ou A. vagin ont été considérés comme positifs BV) 13, cet individu a été positif BV à tous les temps, bien que la coloration de Gram a échoué à détecter G. vaginalis dans les deux derniers points du temps. Avec la méthode décrite ici Luminex, les tendances peuvent être facilement comparés aux méthodes basées sur le séquençage, et les résultats du test Luminex généralement corroborer les colorations de Gram 13 tout en fournissant des informations supplémentaires sur identité de l&#39;organisme et l&#39;abondance. <img src=&quot;/ Files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figure 1&quot; /&gt; Figure 1. Schéma du protocole de Luminex pour déterminer le profil microbiote d&#39;un échantillon clinique complexe ou environnementaux. Le protocole débute avec l&#39;ADN matrice qui a été extraite de l&#39;échantillon d&#39;intérêt. (1) Générer des produits de PCR de l&#39;ADN matrice en utilisant brin spécifique biotinylé, phosphorothioate modifiée cpn60 UT amorces PCR couplée avec un fichier cpn60 UT amorces PCR (tableau 1), (2) Cela génère une piscine produit de PCR représentant le microbiote avec la biotine- phosphorothioate modification sur un brin, (3) Digest le produit double brin par PCR avec l&#39;exonucléase T7, qui ne peuvent pas dégrader le brin phosphorothioate-modifié et génère donc un ADN simple brin qui est modifié à l&#39;extrémité 5 &#39;avec de la biotine, (4) Couple billes de polystyrène pour les espèces spécifiques cpn60 sondes UT - chaque perle a une adresse unique spectrale (indiqué par la couleur perle) que jediscernable par le Luminex ou Bio-Plex instrument de s (5); Hybrider le produit simple brin généré par PCR de l&#39;échantillon d&#39;intérêt à la suite d&#39;espèces spécifiques d&#39;oligonucléotides couplés perles; (6) Ajouter conjugué streptavidine-phycoérythrine qui se lie à l&#39;biotinylé simple brin produit de PCR et agit comme un indicateur de l&#39;hybridation; (7) Déterminez l&#39;adresse spectrale (billes d&#39;identité) et l&#39;intensité du signal d&#39;hybridation utilisant un Luminex ou Bio-Plex instrument. Au moins 100 perles sont comptés pour chaque identité bourrelet et l&#39;intensité médiane de fluorescence (MFI) du signal de la phycoérythrine est rapporté que la sortie. Jusqu&#39;à 100 différents types de billes peuvent être évalués simultanément, mais un test montrant la discrimination de trois types de billes est illustré. (8) Lorsque l&#39;IMF de la PCR se réplique générée à partir du même échantillon est sensiblement supérieur au contrôle négatif pour une donnée perles (unilatéral de Student-test, p &lt;0,05), l&#39;échantillon est considéré comme positif pour l&#39;organisme.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Optimisation des paramètres de dosage Luminex. Cinq sondes différents, s&#39;adressant à anaerobius Peptostreptococcus ont été utilisés avec des amplicons générés à partir d&#39;un modèle mixte comprenant des plasmides contenant la cloné cpn60 UT de 20 bactéries connues pour être associées avec le vagin, y compris P. anaerobius. (A). Effet de la durée du traitement T7 exonucléase. Le protocole décrit ci-dessus a été suivie, mais le temps de traitement avec l&#39;exonucléase T7 a été variée avant l&#39;hybridation et l&#39;intensité médiane de fluorescence (MFI) a été déterminée pour toutes les sondes. (B). Effet de la durée d&#39;hybridation. Le protocole décrit ci-dessus a été suivie avec une variété de fois l&#39;hybridation. Les mêmes ensembles de sondes ont été utilisées avec un amplicon généré à partir du même modèle que dans A et l&#39;intensité médiane de fluorescence (MFI) a été déterminée pour toutes les sondes. »&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Détermination de l&#39;agrégation billes en utilisant le logiciel Bioplex. Trois exemples sont donnés de pistes Bioplex dans lequel le niveau d&#39;agrégation est billes (A) acceptable (5%), (B) limite (50%) et (C) inacceptable (80%). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Application d&#39;un tableau 5-plex Luminex pour le diagnostic BV dans les échantillons séquentiels tiré du même individu. (A). Coloration de Gram diapositives montrant le traditionnel diagnostic utilisés pour évaluer chaque échantillon pour BV. (B). Application d&#39;un tableau 5-plex Luminex préparé et exécuté comme décrit dans ce protocole pour les mêmes quatre échantillons présentés dans (A). Cibles bactériennes dont le MFI signal a été significativement positif par notre définition (unilatéral de Student-test, p &lt;0,05) sont indiquées par un astérisque (*).

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La spécificité de la génération du signal est d&#39;une importance critique; vous devez être convaincus que le signal observé reflète vraiment la détection de l&#39;amplicon généré par cet organisme. Des logiciels tels que PrimerPlex (Premier Biosoft) peut aider à concevoir des sondes qui vont s&#39;hybrider efficacement, mais ils peuvent ou non croisées s&#39;hybrident à des espèces non ciblées. Lorsque des amorces universelles PCR sont utilisés comme décrit dans ce protocole, il est important de gard...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom d&#39;oligonucléotides </td><td> Société </td><td> Séquence 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, ou d&#39;autres </td><td> Biotine-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotine-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, phosphorothioate-C, E, G-phosphorothioate; F, phosphorothioate-A; I, inosine, Y, C ou T, R, A ou G, K, T ou G, S, C ou G. </td></tr></tbody></table> Séquences Tableau 1. Des oligonucléotides modifiés pour Universal cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif</td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1-éthyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> Pierce </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Billes de polystyrène fluorescentes: Microplex microsphères (Luminex), ou Bio-Plex COOH billes (Bio-Rad) </td><td> Luminex ou Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx où xxx correspond à l&#39;identificateur de perles </td><td> Les billes magnétiques sont désormais disponibles pour le couplage d&#39;oligonucléotides et peut offrir certains avantages. N&#39;ont pas été jugés par ces auteurs. </td></tr><tr><td> Oligonucléotides de capture (5 &#39;aminés modifiés C12) </td><td> Invitrogen, IDT, ou d&#39;autres </td><td> diverses </td><td> Niveau de pureté dessalée est acceptable. Séquences des sondes de capture utilisée pour caractériser des prélèvements vaginaux sont fournis dans le manuscrit sur ​​lequel ce protocole est basé 13. </td></tr><tr><td> T7exonucléase </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-R-phycoérythrine (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Soyez prudent afin d&#39;obtenir une grande pureté SA-PE, ce numéro de catalogue est recommandé </td></tr><tr><td> Thermométrique 96 puits Plaques PCR </td><td> Fisher </td><td> CS006509 </td><td> tienne compte des deux thermocycleur 96 puits et la machine Bioplex </td></tr><tr><td> Thermométrique étanchéité tapis </td><td> Fisher </td><td> CS006555 </td><td> Peut-être ré-utilisés; laver à l&#39;eau savonneuse, bien rincer et sécher </td></tr><tr><td> TMAC 5M </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex ou de l&#39;instrument Luminex </td><td> Bio-Rad ou Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciels pour la conception de la sonde PrimerPlex </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Suggestions pour la sonde de Luminexsigne, bien que d&#39;autres plates-formes logicielles peuvent être utilisés </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques. <table border="1"><tbody><tr><td> composante </td><td> ul / dosage </td><td> dosages μl/100 </td><td> concentration finale </td></tr><tr><td> 10x tampon PCR (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> DNTP 10 mM </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM de chaque </td></tr><tr><td> H279BP, 25 pM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 pM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 pM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1613,25 pM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totaux </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Suggérée mélanges pour PCR avec amorces modifiées cpn60 TU (tableau 1). Le test est mis en place pour 5 pi d&#39;ADN matrice et 0,5 ul (2,5 U) de Taq ADN polymérase (Invitrogen). Normalement grands volumes sont préparés (par exemple, suffisant pour 100 tests) et stockés à -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

La vaginose bactérienne (VB) est un syndrome récurrent polymicrobiennes qui se caractérise par un changement dans la «normale» microbiote de Lactobacillus dominé à un microbiote dominé par un certain nombre d&#39;espèces bactériennes, dont Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, et d&#39;autres 1-3. Cette condition est associée à une série de résultats négatifs sur la santé, y compris l&#39;acquisition du VIH 4, et il peut être difficile à gérer sur le plan clinique 5. Par ailleurs, le diagnostic de BV s&#39;est appuyée sur l&#39;utilisation de la coloration de Gram des frottis frottis vaginal qui sont notés sur différents critères numériques 6,7. Bien que ce diagnostic est simple, peu coûteux et bien adapté aux ressources limitées, il peut souffrir de problèmes liés à des interprétations subjectives et il ne donne pas un profil détaillé de la composition du microbiote vaginale 8. Les récents efforts de séquençage en profondeur ont révélé une riche flore vaginale avec diversesdes différences claires entre les échantillons prélevés sur des individus qui sont diagnostiqués avec le BV par rapport à ceux des individus qui sont considérés comme normaux 9,10, ce qui a abouti à l&#39;identification d&#39;un certain nombre de cibles potentielles pour le diagnostic moléculaire de 11,12 BV. Ces études ont fourni une mine d&#39;informations utiles, mais séquençage en profondeur n&#39;est pas encore pratique en tant que méthode de diagnostic dans un contexte clinique. Nous avons récemment décrit une méthode de profilage rapide de la microflore vaginale dans un format multiplex à l&#39;aide d&#39;oligonucléotides couplés avec des billes fluorescentes de détection sur une plate-forme Luminex 13. Cette méthode, comme la coloration de Gram actuelle basée sur les méthodes, est rapide et simple, mais ajoute en outre l&#39;avantage d&#39;exploiter les connaissances moléculaires résultant de séquençage des études en design de la sonde. Cette méthode offre donc un moyen de profil de la micro-organismes importants qui sont présents dans un prélèvement vaginal qui peut être utilisé pour diagnostiquer BV avec une haute spécificité et la sensibilité de compARED à la coloration de Gram tout en fournissant des informations supplémentaires sur la présence et l&#39;abondance d&#39;une façon semi-quantitative et rapide. Cette méthode multiplex est extensible bien au-delà de la gamme des dosages PCR quantitative pour des organismes particuliers, qui est actuellement limitée à 5 ou 6 essais différents dans un seul échantillon 14. Surtout, la méthode n&#39;est pas limité à la détection de bactéries dans des prélèvements vaginaux et peut facilement être adapté rapidement le profil de presque toutes les communautés microbiennes d&#39;intérêt. Par exemple, nous avons récemment commencé à appliquer cette méthodologie à l&#39;élaboration d&#39;outils de diagnostic pour utilisation dans les usines de traitement des eaux usées.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Nous décrivons une méthode multiplex pour la détection des microorganismes dans un échantillon à l&#39;aide d&#39;oligonucléotides couplés billes fluorescentes. Amplicon de tous les organismes au sein d&#39;un échantillon est hybridé à un panel de sondes couplées perles. Un instrument Luminex ou Bio-Plex est utilisé pour interroger chaque perle pour le type de perle et le signal d&#39;hybridation.

Détection multiplex de bactéries dans les échantillons complexes cliniques et environnementaux à l&#39;aide d&#39;oligonucléotides couplés microsphères fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K vues.  Agriculture and Agri-Food Canada. Nous décrivons une méthode multiplex pour la détection des microorganismes dans un échantillon à l'aide d'oligonucléotides couplés billes fluorescentes. Amplicon de tous les organismes au sein d'un échantillon est hybridé à un panel de sondes couplées perles. Un instrument Luminex ou Bio-Plex est utilisé pour interroger chaque perle pour le type de perle et le signal d'hybridation.

Vidéo: Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

Utilisez des fluorescents Immuno-Chimie pour la détection de Edwardsiella ictaluri Dans la barbue de rivière ( I. punctatus) Des échantillons

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Déterminer l&#39;activité phagocytaire des échantillons d&#39;anticorps cliniques

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

Détection in situ de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l&#39;aide majeur d&#39;histocompatibilité Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ détection des bactéries dans les tissus inclus en paraffine Utiliser une sonde ADN de digoxine marqué ciblage ARNr 16S

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Le développement d&#39;un anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer l&#39;exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Techniques de laboratoire utilisées pour maintenir et différencier les biotypes de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolats cliniques et environnementaux