Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association et de la Fondation cardiomyopathie des enfants (SDG2462390204001) et les Instituts nationaux de santé (de HL114669). CM est un bénéficiaire d&#39;une subvention de bourse de recherche postdoctorale décerné par la Fondation myocardite, NJ.

Déclaration d&#39;éthique: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par l&#39;Université de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. Une. Induction de l&#39;EAE <ol><li> Pour induire l&#39;EAE, préparer l&#39;émulsion de peptide / de l&#39;adjuvant complet de Freund (CFA), comme décrit dans 11 avec les modifications suivantes: Etape 1.1:. Préparer PLP 139-151, à une concentration de 1 mg / ml dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) Étape 1.4:. utiliser 200 ul de FCA émulsion contenant 100 ug de PLP 139-151 par animal étape 1.4.1: pour immuniser des dix animaux, préparer 2 ml d&#39;émulsion en mélangeant 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml dans 1 x . PBS) et un volume égal de CFA étape 1.5: injecter 200 pi d&#39;émulsion en doses fractionnées voie sous-cutanée dans les deux régions inguinales (~ 75 pi de chacun) et région sternale (~ 50 pi) de cinq à six semaines d&#39;âge FEMAsouris le SJL / J. Les étapes 1.7 et 1.8 ne sont pas applicables pour l&#39;induction de l&#39;EAE. </li></ol> 2. Notation clinique des souris EAE et récolte de cerebrums <ol><li> Surveiller les animaux pour apparition des signes cliniques, et marquer la maladie gravité tous les jours de 9 jours après immunisation comme suit: 0 - sain; 1 - mou queue ou des membres postérieurs faiblesse, mais pas les deux; 2 - mou queue et des pattes postérieures faiblesse; 3 - paralysie partielle des membres postérieurs; 4 - la paralysie complète des membres postérieurs; 5 - morts ou moribonds 12. </li><li> Euthanize la souris quand ils atteignent un score neurologique de 3 ou 4 à l&#39;aide de CO 2. Pour euthanasier les souris, pré-remplir la chambre d&#39;euthanasie d&#39;abord avec le CO 2 en tournant le régulateur du réservoir de CO 2 ne dépassant pas 6 psi et permettre aux animaux de rester dans la chambre pendant environ 5 min pour atteindre l&#39;asphyxie complète. Faire tremper les animaux euthanasiés dans 70% d&#39;alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l&#39;aide d&#39;une paire de stérile pourcèpes et ciseaux exposent les cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs. </li><li> Creuser le crâne en coupant le crâne de façon circulaire à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux courbes, et soigneusement, retourner les os du crâne avec une pince. Récolter le cerveau par émousser la dissection et l&#39;aide d&#39;un scalpel propre, cerveau séparé du cervelet. Placez le cerveau dans un tube contenant froid 1x PBS et laisser le tube sur la glace jusqu&#39;à ce que le traitement. </li></ol> 3. In Situ coloration des sections cérébrales avec CMH de classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers <ol><li> Préparer 4% PBS tamponnée d&#39;agarose bas point de fusion, fondu par chauffage à 50 ° C et laisser dans un bain-marie à 40 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Placez le cerveau dans un moule de base profonde cassette histologie disponible conservés sur de la glace, et versez fondu (40 ° C) agarose. Immédiatement, appuyez doucement sur le cerveauavec une pince pour s&#39;immerger le tissu. Laisser la cassette sur la glace pendant 15-20 min jusqu&#39;à ce que la solidification est terminée. </li><li> Remplir la baignoire vibratome avec réfrigéré 1x PBS. Remplir l&#39;espace autour vibratome bain de glaçons pour maintenir la température de PBS entre 0 et 2 ° C. Fixer une lame de rasoir propre dans le vibratome et régler l&#39;angle de la lame à 15 °. </li><li> Placement de tissu dans vibratome. Coupez l&#39;excédent agarose de tous les côtés du tissu intégré et légèrement exposer la surface ventrale du cerveau. <ol><li> Étaler vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d&#39;agarose-intégré sur la surface collée en plaçant la face ventrale du cerveau exposé sur la colle pour le sectionnement transversal. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc. </li><li> Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min. </li></ol></li><li> Dans le même temps, placez le cham de tissuBers un par puits d&#39;une plaque de 24 puits. Remplir les puits contenant les chambres de tissu avec 1 ml de PBS froid 1x, et laisser la plaque sur la glace. <ol><li> Préparer les chambres de tissu en attachant un nylon mince filet à la coupe en bout d&#39;une pipette 25 ml de polypropylène en utilisant de la colle super; après la coupe du treillis en excès autour de la pipette, la pipette à couper une longueur de 1 cm à partir de la maille. </li></ol></li><li> Abaisser la lame vibratome au niveau de la surface supérieure du tissu; régler la vitesse de vibratome à 0,22 mm / s et commencer la coupe avec un mouvement vers l&#39;avant pour faire 200 um sections épaisses. Transférer une partie cérébrale par puits en utilisant une brosse douce d&#39;aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d&#39;une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu&#39;à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation des tissus. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir un total, trois sections paires de trois régions différentes du cerveau dorsale à la face ventrale (figure 2). Une section dechaque paire (sur un total de trois sections) placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers spécifiques (s IA / PLP 139-151) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de trois sections qui sont placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers de commande (IA s / TMEV 70-86) et anti-CD4. </li><li> Transférer les trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pl de cocktail contenant une allophycocyanine (APC) conjugués PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) et anti-CD4-phycoérythrine (PE; 5 pg / ml) dans une solution de blocage (PBS 1x avec 2% de sérum normal de chèvre) a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. </li><li> De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de contrôle dans trois puits dans une plaque de 24 puits avec une chambre pour nousll dans laquelle, à 300 pl d&#39;un cocktail contenant TMEV APC conjugué 70-86 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. Remarque: Reportez-vous à Massilamany et al, 8 pour la préparation de dextramers, et les molécules de dextran pour préparer dextramers ont été aimablement fournies par Immudex, Copenhague, Danemark.. </li><li> Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d&#39;aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Après la période d&#39;incubation, laver les coupes de tissus sur la plate-forme à bascule, en transférant les chambres de tissu pour un nouveau puits contenant 1 ml de PBS froid 1x, et éviter le dribble le contenu d&#39;un bien dans l&#39;autre. Répéter le lavage trois fois, ce qui permet au moins 10 min par lavage. Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas séchés car ils peuvent coller aux parois de la chambre. </li><li> Fixer les sections en transférant le cham de tissubres dans un nouveau puits en plaque de 24 puits contenant 1 ml de filtre 4% de paraformaldéhyde tampon PBS (pH 7,4) sur une plate-forme à bascule pendant 2 heures avec des rotations douces. </li><li> Répétez trois fois le lavage comme décrit à l&#39;étape 3.10. </li><li> Placez les coupes colorées et fixes sur une lame de microscope propre à l&#39;aide d&#39;une brosse douce de l&#39;aquarelle. Essuyez l&#39;excès d&#39;eau sans toucher la partie, et monter la section en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire. </li><li> Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C. </li></ol> 4. L&#39;induction de l&#39;EAM et Collection de coeurs <ol><li> Induire EAM comme décrit dans la référence 11. </li><li> Euthanasier les souris au jour 21 après immunisation utilisant chambre propre équipé CO 2 bouteille de gaz, et tremper les animaux dans 70% d&#39;alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces et des ciseaux exposer le cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs. Recueillir les coeurs et les placer dans des tubes contenant de froid 1x PBS. </li></ol> 5. In Situ coloration de coeur sections avec CMH de classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers <ol><li> Préparer 4% tampon PBS bas point de fusion d&#39;agarose, faire fondre par chauffage à 50 ° C et le laisser dans un 40 &#160; ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Placez le coeur dans une profonde cassette histologie de moule de base jetable conservé dans la glace, et versez fondu à 40 ° C jusqu&#39;à ce que les tissus agarose sont complètement submergés, comme décrit dans l&#39;étape 3.2. </li><li> Suivez l&#39;étape 3.3. </li><li> Enlever l&#39;excès d&#39;agarose à partir de tous les côtés du tissu enrobé et légèrement exposer la base du cœur. Enduire vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d&#39;agarose-intégré collé sur la surface en plaçant la surface exposée de l&#39;coeur sur la colle. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc. <ol><li> Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min. </li></ol></li><li> Suivez les étapes 3.5 et 3.6. </li><li> Transférer les sections de coeur avec une brosse douce d&#39;aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d&#39;une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu&#39;à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation du tissu. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir au total, huit sections paires du sommet à la base du cœur (Figure 2). Placez toutes les sections de chambres de tissu, affecter jusqu&#39;à 3 sections par chambre. Une section de chaque paire (sur un total de huit sections) est désignée pour la coloration avec dextramers spécifiques (IA k / MyHC 334-352) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de huit sections est désigné pour la coloration avec dextramers de commande (IA k / RNase 43-56) et des anti-CD4. </li><li> Transférer letrois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d&#39;un cocktail contenant des conjugués APC-MyHC 334-352 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. <ol><li> De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de commande dans trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d&#39;un cocktail contenant RNase APC conjugué 43-56 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. </li></ol></li><li> Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d&#39;aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Suivez les étapes, 3.10 à 3.11 </li><li> Répétez laver thrglace comme décrit à l&#39;étape 3.10. </li><li> Placez les coupes colorées et fixes (jusqu&#39;à trois sections / diapositives) sur une lame de microscope propre à l&#39;aide d&#39;une brosse douce de l&#39;aquarelle. Essuyez l&#39;excès d&#39;eau sans toucher les sections, et monter les sections en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire. </li><li> Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C. </li></ol> 6. Analyse des Dextramer + (dext +) cellules T CD4 + par microscopie confocale à balayage laser Microscope (LSCM) (communs à l&#39;cerveau et le cœur articles) <ol><li> Utilisez Nikon A1-Eclipse système de microscope confocal 90i pour la numérisation de routine et d&#39;acquisition d&#39;images. Pour commencer Cliquez ouvert, le logiciel NIS Elements AR (version 4.13). <ol><li> Choisissez &quot;TRITC&quot; et chaînes &quot;Cy5&quot; du panneau. Les excitation / émission des longueurs d&#39;onde respectivement pour les canaux TRITC et Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm et 640,7 nm / 663-738 nm apparaissent par défaut. </li><li> Attribuer la pseudocouleurs &quot;vert&quot; et &quot;rouge&quot; pour la TRITC (CD4-PE) et Cy5 (dextramer-APC) canaux, respectivement. </li><li> Placer la lame d&#39;être examiné sur la scène microscopique et mise au point manuellement sous un grossissement de 100X. Réglez le &quot;HV&quot; à 110 et le décalage de &quot;0&quot;. Cliquez sur &quot;Focus&quot; et régler la «tension» pour optimiser les lasers. </li><li> Cliquez sur &quot;Focus&quot;; numériser la section de haut en bas, et définir le niveau «Z» pour l&#39;acquisition de l&#39;image. Cliquez sur &quot;série CH&quot; et d&#39;acquérir l&#39;image séquentielle. Identifiez dext + cellules T CD4 + apparaissant cellules ponctuées comme jaunes sur la base de la co-localisation des signaux générés à la fois du rouge (dextramers) et vert (CD4) canaux. </li></ol></li><li> Utilisez Olympus FV500-BX60 microscope confocal pour l&#39;énumération quantitative facile des cellules T CD4 + + DEXT. Pour commencercliquez ouverte, le logiciel de FluoView (version 4.3). <ol><li> Sélectionnez le colorants &quot;Cy3» et «Cy5&quot; dans le menu déroulant, puis cliquez sur &quot;Appliquer&quot; pour charger les lasers respectifs. Remarque: les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission pour Cy3 (543 nm / pseudocolored &quot;vert&quot;; CD4-PE), les canaux et Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored &quot;rouge&quot;). </li><li> Placer la lame d&#39;être examiné sur la lame de microscope, et de se concentrer manuellement à faible grossissement (4X ou 10X). Cliquez sur &quot;Focus&quot; tandis que le laser Cy3 est sur, et de se concentrer le foyer inflammatoire. </li><li> Modifier l&#39;objectif à grossissement de 100X. Définissez la taille du fichier à &quot;512/512&quot; dans le menu déroulant. Cliquez sur &quot;Focus&quot; et ajuster les valeurs pour &quot;PMT&quot;, &quot;gain&quot; et &quot;Offset&quot; paramètres pour optimiser les lasers séparément pour Cy3 et Cy5. </li><li> Cliquez sur &quot;étape de Z&quot; puis cliquez sur &quot;Focus&quot; alors que les deux lasers sont sur. Setl&#39;épaisseur de la &quot;scène de Z&quot; en cliquant sur le &quot;haut&quot; et &quot;bas&quot; flèches. Définissez l&#39;intervalle &quot;Z&quot; à 2 pm. </li><li> Cliquez sur &quot;Stop&quot;, et choisissez &quot;Seq123&quot;. Ensuite, cliquez sur &quot;XYZ&quot; et commencer à acquérir des images de la série &quot;Z&quot; pour la zone sélectionnée dans le foyer inflammatoire. Enregistrez les images &quot;Z&quot; de série dans un fichier AVI. Pour enregistrer des fichiers image, sélectionnez l&#39;image de l &#39;«image de série Z&quot;, puis enregistrer au format &quot;tiff&quot;. </li></ol></li><li> Examiner trois sections appariées du cerveau où un ensemble de trois sections a été colorée avec / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 IA et l&#39;autre ensemble de trois sections avec / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 IA pour effectuer analyse quantitative. <ol><li> De même, analyser huit sections appariées pour le coeur, dans lequel, un ensemble de huit sections a été colorée avec IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 et un autre soit de huit sections avec RNase 43-56 dextramers/anti-CD4. </li></ol></li><li> Examiner 10 à 15 foyers inflammatoires par section cerveau, et dans chaque foyer, d&#39;acquérir un ensemble de 15 à 25 images en série séquentielle. <ol><li> Examiner un total de 20 foyers inflammatoires de toutes les huit sections de coeur et de chaque foyer acquérir 10 à 15 images en série séquentielle. Prenez les &#39;Z&#39; images série en balayant les diapositives dans un mouvement «horizontal-vertical-vous-horizontal-vertical vers le bas» de sorte que la répétition de la série «Z» dans le même foyer est évitée. </li><li> Une fois les images en série &#39;Z&#39; sont capturés, nommer les fichiers en identifiant les numéros de diapositives, le nom des sections, et le nombre de &#39;Z&#39; images prises en série. <ol><li> Utilisez le logiciel «ImageJ» pour compter les cellules T CD4 + + DEXT par rapport au nombre total de cellules T CD4 +. Sélectionnez le &#39;type de compteur »dans« ImageJ, consultez &amp;# 8216; montrer tous »et commencer à compter en cliquant sur le centre de chaque cellule et continuer à compter dans différents &#39;Z&#39; images en série à l&#39;aide de flèches latérales. Après avoir compté toutes les cellules T CD4, choisir un autre type de compteur et le nombre de CD4 + dext + cellules T. Cliquez sur l&#39;onglet des résultats pour obtenir le nombre total de cellules comptées avec les deux compteurs différents. </li><li> Obtenir le nombre total, ajouter le nombre de cellules dans l&#39;ensemble des images en série &#39;Z&#39; représentent tous les trois sections cérébraux ou toutes les sections huit cardiaques. </li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis-inducing+epitope+of+myosin+binds+constitutively+and+stably+to+I-Ak+on+antigen-presenting+cells+in+the+heart.">Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart.</a> J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).</li><li>Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alpha-myosin+heavy+chains+differ+in+their+induction+of+myocarditis.+Identification+of+pathogenic+epitopes.">Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes.</a> J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).</li><li>Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+detection+of+antigen-specific+CD4++T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state.">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li><li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts n&#39;a été déclaré.

Contrairement tétramères CMH de classe I, l&#39;utilisation de tétramères CMH de classe II pour les applications de routine continue d&#39;être difficile, surtout pour énumérer les fréquences de précurseurs de cellules T CD4 autoréactifs de faible affinité, en partie à cause de leur dépendance à l&#39;égard d&#39;activation 6,15-17. Récemment, ce problème a été contourné par la création de la prochaine génération de tétramères, appelé &quot;dextramers,&quot; ce qui nous permet de dé...

L&#39;utilisation de complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères pour la détection de cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD4 a été un défi 1-7. Pour améliorer la sensibilité de détection de tétramères CMH de classe II, l&#39;équipe de recherche a créé des tétramères de la prochaine génération, désignés &quot;dextramers&quot; 8. Dextramers contiennent des squelettes de dextrane dans lequel de multiples fragments de streptavidine fluorophore sont conjugués, tels que plusieurs monomères du CMH biotinylés, des peptides attachés peuvent être attachés à une molécule de dextran 9. Ainsi, de grands agrégats de dextramers CMH qui contiennent plusieurs complexes CMH-peptide peut interagir avec plusieurs récepteurs de cellules T (TCR). Ce groupe a récemment généré dextramers pour différents auto-antigènes et a démontré que la sensibilité de détection de dextramers était environ cinq fois plus que les tétramères 8. Les systèmes expérimentaux comprennent encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la protéine protéolipidique (PLP) 139-151 chez la souris SJL; EAE induite par la glycoprotéine de la myéline des oligodendrocytes (MOG) 35-55 dans C57BL / 6 souris; et la myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induite avec la myosine cardiaque chaîne lourde α-(MyHC) 334-352 chez des souris A / J. Cette étude démontre l&#39;utilisation de PLP 139-151 - 334-352 dextramers MyHC et pour détecter les cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD4 in situ avec une spécificité en développant un protocole de coloration directe, éliminant ainsi la nécessité pour amplifier les signaux en utilisant des anticorps à partir de fluorophores, un approcher couramment employé à l&#39;utilisation de tétramères. En outre, un procédé global de l&#39;évaluation des tissus ont également été mis au point pour énumérer de manière fiable les fréquences des cellules T CD4 spécifiques de l&#39;antigène in situ 10. La détection de cellules T spécifiques de l&#39;antigène in situ permet la délimitation des événements provoqués par des stimuli antigéniques spécifiques de ceux causés par l&#39;activation de l&#39;observateur. De même, la technique in situ également PROVIDes possibilités pour suivre la cinétique d&#39;infiltrations de cellules T spécifiques de l&#39;antigène dans les organes cibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

Dans ce rapport, la détection in situ de spécifiques de l&#39;antigène, auto-réactifs cellules T CD4 par coloration directe avec dextramers CMH de classe II en est décrite. Sections cérébrales fraîchement coupées ont été obtenues à partir de souris EAE et colorées avec des cocktails contenant PLP 139-151 (spécifique) ou TMEV 70-86 (contrôle) dextramers et anti-CD4. Les panneaux supérieurs de la figure 1 montre l&#39;analyse LSCM de sections cérébrales costained avec P...

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In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d&#39;histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l&#39;antigène in situ est également conçu.

Détection in situ de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l&#39;aide majeur d&#39;histocompatibilité Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K vues.  University of Nebraska, Lincoln.  Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d'histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène in situ est également conçu. 

Vidéo: In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accélération de diabète de type 1 chez la souris par induction transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A well-studied function of major histocompatibility complex class I (MHCI) is the presentation of cell-derived peptides to the adaptive immune system, particularly in response to infection. More recently it has been shown that the expression of MHCI molecules on neurons can modulate activity-dependent changes in the synaptic connectivity during normal development and neurologic disorders. The importance of these functions to the brain health supports the need for a sensitive assay that readily detects MHCI expression on neurons. Here we describe a method for primary culture of murine hippocampal neurons and then assessment of MHCI expression by flow cytometric analysis. Murine hippocampus is microdissected from prenatal mouse pups at the embryonic day 18. Tissue is dissociated into a single cell suspension using enzymatic and mechanical techniques, then cultured in a serum-free media that limits growth of non-neuronal cells. After 7 days in vitro, MHCI expression is stimulated by treating cultured cells pharmacologically with beta interferon. MHCI molecules are labeled in situ with a fluorescently tagged antibody, then cells are non-enzymatically dissociated into a single cell suspension. To confirm the neuronal identity, cells are fixed with paraformaldehyde, permeabilized, and labeled with a fluorescently tagged antibody that recognizes neuronal nuclear antigen NeuN. MHCI expression is then quantified on neurons by flow cytometric analysis. Neuronal cultures can easily be manipulated by either genetic modifications or pharmacologic interventions to test specific hypotheses. With slight modifications, these methods can be used to culture other neuronal populations or to assess expression of other proteins of interest.

This protocol describes a method for culturing primary hippocampal neurons from embryonic mouse brain. The expression of major histocompatibility complex class I on the extracellular surface of cultured neurons is then assessed by flow cytometric analysis.

Évaluation de l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I sur les neurones primaires de l’hippocampe murin par cytométrie en flux

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &amp;#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Stabilité et structure du complexe histocompatibilité majeur de chauve-souris classe I avec β2-Microglobuline

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cell line&#160;and three-dimensional (3D) cultures of human airway epithelium. The method allows highly specific and sensitive visualization of viral RNA by relying on HCR initiated by probe localization. Split-initiator probes help amplify the signal by fluorescently labeled amplifiers, resulting in negligible background fluorescence in confocal microscopy. Labeling amplifiers with different fluorescent dyes facilitates the simultaneous recognition of various targets. This, in turn, allows the mapping of the infection in tissues to better understand viral pathogenesis and replication at the single-cell level. Coupling this method with immunofluorescence may facilitate better understanding of host-virus interactions, including alternation of the host epigenome and immune response pathways. Owing to sensitive and specific HCR technology, this protocol can also be used as a diagnostic tool. It is also important to remember that the technique may be modified easily to enable detection of any RNA, including non-coding RNAs and RNA viruses that may emerge in the future.

Here, we describe a simple method that combines RNA fluorescence in situ&#160;hybridization (RNA-FISH) with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. This protocol may increase understanding of the molecular characteristics of SARS-CoV-2 RNA-host interactions at a single-cell level.

Visualisation du SARS-CoV-2 à l’aide de l’hybridation in situ par immuno-ARN-fluorescence

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" of a T cell needs to be assessed by function, and higher function is associated with more powerful immune protection. T cells that can simultaneously produce two or more cytokines or chemokines at the single-cell level are called polyfunctional T cells (TPFs), which mediate immune responses through a variety of molecular mechanisms to express degranulation markers (CD107a) and secrete interferon (IFN)-&#947;, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, interleukin (IL)-2, or macrophage inflammatory protein (MIP)-1&#945;. There is increasing evidence that TPFs are closely related to the maintenance of long-term immune memory and protection and that their increased proportion is an important marker of protective immunity and is important in the effective control of viral infection and reactivation. This evaluation applies not only to specific immune responses but also to the assessment of cross-reactive immune responses. Here, taking the Japanese encephalitis virus (JEV) as an example, the detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs produced by peripheral blood mononuclear cells of children vaccinated against Japanese encephalitis were tested to provide a reference for similar studies.

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

The present protocol combines ex vivo stimulation and flow cytometry to analyze polyfunctional T cell (TPF)&#160;profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) within Japanese encephalitis virus (JEV)-vaccinated children. The detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs were tested to provide a reference for similar studies.

Détection de lymphocytes T polyfonctionnels chez les enfants vaccinés avec le vaccin contre l’encéphalite japonaise par la technique de cytométrie en flux

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...