Les tiques sont des ectoparasites hématophagous, Rhipicephalus microplus, populairement connu sous le nom de tique du bétail a un impact économique négatif énorme sur le bétail dans les zones tropicales. En outre, les préoccupations croissantes au sujet des conditions environnementales dégradées et des soucis de santé publique causés par l’utilisation inappropriée d’acaricides chimiques et la résistance croissante des populations de tiques aux parasites traditionnels stimulent la recherche sur d’autres méthodes de lutte, telles que l’utilisation de champignons entomopathogènes. Ces entomopathogènes infectent activement les hôtes arthropodes, par leur cuticule et colonisent leur corps.
L’arthropode peut avoir des réponses différentes à l’infection fongique. Le système immunitaire des arthropodes est divisé en réponses humoristiques et cellulaires. La réponse humoristique implique le processus d’hémagglutination et la production de molécules antimicrobiennes, tandis que les hémocytes médient la réponse immunitaire cellulaire.
La plupart des études sur la réponse immunitaire des arthropodes sont rapportées à l’aide d’insectes, tandis que les réponses des tiques demeurent moins explorées. En outre, l’inoculation d’agent pathogène et la collecte d’hémolympe de tique sont des techniques mal répandues nécessaires pour mieux comprendre la réponse immunisée de l’arthropode. En conséquence, cette adresse vidéo techniques \used pour filmer l’inoculation, la collection d’hémolymph et le traitement.
Puisque la récolte d’hemocytes de tique font face à quelques limitations, telles que la perturbation de cellules, la valeur faible d’hémolymph obtenant, et la basse concentration des cellules récupérées. Infecter directement la configuration et l’analyse des cellules. Après la collecte des tiques, laver les femelles engorgées.
Utilisez l’eau du robinet et plongez-les dans une solution hypochlorite à 0,5 % de sodium pendant trois minutes dans un récipient à bécher en verre de 500 millilitres. Pour l’hygiène cuticule, diviser les femelles en groupes homogènes avec 20 femelles chacune. Trois répliques de chaque groupe ont été exécutées.
Metarhizium robertsii blastospores ont été utilisés dans le processus d’inoculation. Ajouter sur un liquide de cinq microlitres metarhizium blastospores suspension à la surface d’un film de paraffine en plastique. Pour accélérer le processus d’inoculation, plusieurs bulles peuvent être ajoutées à la surface du film de paraffine en plastique, chaque bulle correspondant à cinq microlitres.
Utilisez une seringue à insuline ultra-fine d’un millimètre et une aiguille de 0,3 millimètre pour mettre une suspension et l’inoculer dans la tique. N’oubliez pas de sortir tout l’air de la seringue avant de l’utiliser. Inoculer 5 microlitres de suspension champignon dans la femelle tique entre le scutum et le capitulum.
Un petit volume d’hémolympe peut être présent sur le cadrage après l’incision de l’aiguille. Veillez à ne pas inoculer l’air. Inoculer les femelles avec suspension champignon entre la cuisse de la jambe et le corps de la femelle à l’aide d’une seringue d’insuline ultra-fine d’un millilitre couplée à une aiguille de 0,3 millimètre.
Lorsque l’inoculation des blastospores de métarhizium est effectuée entre la cuisse de la jambe et le corps de la femelle tique, un petit volume d’hémolympe peut être présent sur la cuisse après l’insertion de l’aiguille. Veillez à ne pas inoculer l’air. Utilisez la partie en caoutchouc d’une infusion ailé définir un tube capillaire de 0,3 miliimeters et une pointe de filtre pour effectuer la collection de hémolympe.
Perturber la cuticule dorsale femelle à l’aide d’une aiguille de 0,3 millimètre. Après la perturbation appliquer une pression douce sur la partie antérienne du corps de la tique. Observez une mise en commun liquide presque transparente hors du site de perturbation.
Recueillir l’hémolympe en suçant le liquide à travers la pointe du filtre couplé à une partie en caoutchouc d’un ensemble d’infusion ailé et un tube capillaire de 0,3 millimètres. N’appuyez pas sur le corps de la tique à peine pendant son immobilisation, car cela peut perturber le midgut et contaminer l’hémolympe. Attendez que la pression douce puisse expulser le fluide sans contamination.
Immobiliser la tique. Coupez un morceau d’une jambe avant. Une ou plusieurs jambes peuvent être coupées ainsi que la même jambe peut être coupée plus d’une fois.
Appliquez une pression douce sur la partie postérieure du corps de la tique. Observez une bulle liquide transparente s’afficher sur le côté coupé et recueillez-la avec le tube capillaire. N’appuyez pas sur le corps de la tique à peine, pendant sa mobilisation, car cela peut perturber le midgut et contaminer l’hémolympe.
Attendez que la pression douce puisse expulser le fluide sans contamination. Après la collecte de l’hémolympe, déposez-le dans 1,5 microtube de mililiters précédemment rempli de 30 microlitres protéase cocktail et 82 microlitres tampon salin. Gardez les microtubes sur la glace tout au long de la collection d’hémolymph.
Des échantillons de centrifugeuses et la pastille molle des ourmocytes seront formés après centrifugation d’hémolympe. Pour la quantification de l’hémolympe, quantifier le volume d’hémolympe obtenu en comptant le volume total à l’intérieur du microtube et en escomptant le volume de cocktail protéase et tampon salin. Retirez soigneusement l’hémolymph sans cellules supernatant et suspendez doucement les cellules.
Quantifier les hémocytes en plaçant 10 microlitres d’hémocytes re-suspendus dans la chambre Neubauer. Pour les cellules de re-suspension d’un média de culture a été utilisé. Coupez la jambe avant de la tique, appliquez une légère pression sur la partie postérieure du corps de la tique, observez une bulle liquide transparente s’afficher sur le site de coupe.
Appliquez les gouttes d’hémolympe directement sur des lames de microscope propres. Après cela utiliser des méthodes appropriées pour tacher les cellules. L’inoculation entre la cuisse de la jambe et la tique du corps féminin peut également endommager les organes internes des tiques tels que le midgut et les tubules malpighiens.
Lorsque le midgut de tique est perturbé par l’aiguille à la collection dorsale d’hémolympe le fluide obtenu est rouge, pas transparent. Cela indique une collection incorrecte d’hémolympe. Dans ce cas, l’hémolympe doit être jeté car il est contaminé.
La contamination à l’hémolympe peut également être observée lorsque la tique est naturellement infectée par des charges élevées d’agents pathogènes, ou dans les dernières étapes après le processus de décès causé par des agents pathogènes inoculés. Le volume d’hémolympe obtenu après la collecte dorsale est plus élevé que le volume obtenu lors de la collecte par la jambe. Malgré la facilité de contamination est plus élevé dans la première méthode de collecte.
La concentration d’hémocytes était également significativement plus élevée à la collection dorsale. Lorsque la collecte correcte des hémocytes est effectuée un bon frottis peut être obtenu et il est possible de distinguer les ourmocytes différents après coloration. Cette vidéo a fourni des informations sur les méthodes d’inoculation des pathogènes, en particulier les champignons entomopathogènes, dans les tiques et de recueillir leur hémolympe.
Les techniques présentées ici nécessitent des ressources technologiques très faibles dans nos étapes classiques pour des études sur la physiologie des tiques, la pathologie des tiques et la réponse immunitaire des tiques. La récolte correcte des cellules d’arthropodes, et de l’hémolymph sans cellules est cruciale pour fournir l’information fiable pour des études suivantes. Pour cette raison, il est également important d’être conscient des erreurs les plus courantes observées dans l’exécution de ces techniques.
De plus, les propositions de cette étude détermineront le site le plus approprié pour la collecte de l’hémolympe en déformant ou en coupant les jambes, compte tenu de la différence dans le volume obtenu et de la probabilité de contamination.
