Nous remercions le Dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) pour la conception de la plaque de tête. Le travail a été soutenu par des prix du NIH pour SD (R01DA026325 et P30AI078498 et des subventions de base à KK (DANA Brain Foundation et le programme immunoimagerie, l&#39;American Heart Association et l&#39;Association 0635595T SLA [# 1112)]).

1. Préparation de l&#39;animal pour l&#39;imagerie Remarque: Nous utilisons des souris adultes C57BL. Différentes souches transgéniques peuvent être utilisés en fonction de la question de recherche. Chirurgies microvasculaires et l&#39;oxymétrie de pouls sont facilitées chez la souris avec de la fourrure blanche (par exemple FVB souche). <ol><li> Préparer le site chirurgical sur le banc. Tous les instruments chirurgicaux doivent être autoclavés ou désinfectés avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Insérez une sonde rectale, et mesurent en permanence la température du corps de l&#39;animal tout au long de la procédure </li><li> Anesthésier la souris en utilisant d&#39;abord 5% d&#39;isoflurane. En 15-30 s, lorsque l&#39;animal ne se déplace pas, placez-le sur un coussin chauffant (37 ° C), et d&#39;appliquer un masque pour l&#39;administration continue de l&#39;air contenant 1.3 à 1.5% d&#39;isoflurane). Assurez-vous que l&#39;animal ne répond pas à un stimulus douloureux (pincement de la queue, par exemple). </li><li> Utilisez artificielle gel lacrymogène pour couvrir les yeux de la souris, pour prévenir l&#39;exposition à l&#39;air sec. </li><li> Utiliser un rasoir électrique, retirez f cheveuxrom de la tête et des deux cuisses. Appliquer épilateur (par exemple Nair) à la cuisse pendant 2 min, puis essuyez-le soigneusement pour éliminer le reste des cheveux. Cette cuisse sera utilisée pour l&#39;oxymétrie. </li><li> Désinfecter le cuir chevelu avec un 10% de povidone-iode solution et l&#39;éthanol à 70%. </li></ol> 2. Préparation de la fenêtre ouverte du crâne crânienne <ol><li> À partir de 5 mm caudale du crâne, faire une incision dans le cuir chevelu avec des ciseaux, et de faire avancer d&#39;un centimètre. Déplacer la peau sur les côtés pour exposer le crâne. </li><li> Pour supprimer les membranes sur le dessus du crâne appliquer 10% de solution de chlorure ferrique vers le haut du crâne. Essuyez l&#39;excès de solution, et gratter les membranes loin avec 45 ° d&#39;angle # 5 pincettes. Il est important de préparer soigneusement le site, afin de veiller à ce que la plaque de tête peut être solidement fixé sur le crâne (étapes n ° 4 à 6). </li><li> En utilisant un microscope à dissection, identifier la zone d&#39;intérêt. Notez que les sutures crâniennes devrait être évité parce que la c crâneune rupture imprévisible le long de ces lignes. </li><li> Appliquez une fine couche de colle rapide (par exemple Locktite 454) sur les bords de la fenêtre de la plaque de la tête (figure 1). Positionner la plaque de tête de telle sorte que la zone d&#39;intérêt est exposée dans la fenêtre. Appliquez une légère pression sur la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire pour polymériser la colle rapide. Maintenez la position pendant 10 secondes pendant que la colle est de polymérisation. </li><li> Appliquer une petite quantité de colle rapide sur les bords de la fenêtre pour sceller la plaque de tête et le crâne. Vissez la plaque de tête à la porte des animaux dans le champ d&#39;application de dissection. </li><li> Aide de la perceuse Microtorque II a fixé à 6000 rpm et un peu IRF de forage 005, enlever toute trace de colle supplémentaire à partir du crâne et de la plaque de la tête. Toute la colle restant sur la plaque de tête devrait être supprimée, car elle sera autrement interférer avec la fixation de la couverture en verre. </li><li> Réglez la perceuse à 1000 rpm, et commencer à forer le crâne en faisant un cercle intérieur de la fenêtre plaque de tête, diamètre ~ 5 mm. Utilisez lissages légers, comme si vous dessinez avec un crayon très doux. Arrêter le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d&#39;os à l&#39;aide d&#39;air comprimé. Note: La forme de l&#39;ouverture dans la plaque de tête permet un accès supplémentaire pour la foret (pour le chirurgien-gauche et à droite), ce qui rend plus facile pour créer une fenêtre circulaire crânienne. En outre, les deux impairs trous en forme de fournir l&#39;espace nécessaire pour insérer une électrode de Clark-ou en verre-électrode dans le tissu cérébral sous la fenêtre crânienne pour d&#39;autres mesures polarographiques ou électrophysiologiques. </li><li> Comme le forage progresse, un terrier est formé autour du crâne intact dans le centre. Veillez à ne pas piquer à travers le crâne amincie, mais pour faire de ce terrier de même épaisseur. Soyez prudent supplémentaire autour de sang gros vaisseaux-ils ne devraient pas être compromise et, si possible, même pas touché. </li><li> Utiliser l&#39;un &quot;jambe&quot; de pincettes N ° 3 pour soulever (&quot;feuilleter OFF&quot;) de l&#39;os dans le centre de la fenêtre. Appliquez une goutte de Artificial liquide céphalo-rachidien (ACSF) sur la fenêtre. </li><li> Essuyez doucement à l&#39;aide aCSF un coin de mouchoir en papier doux (par exemple Kimwipe). Habituellement, la durée est endommagé dans un ou plusieurs endroits à travers le bord de la fenêtre. À partir de l&#39;un de ces sites, soulevez doucement, puis retirez la durée de la surface du cerveau, en utilisant des pinces angle de 45 ° N ° 5. Au moment de choisir le site à partir duquel commencer à enlever la dure-mère, éviter les zones adjacentes aux gros vaisseaux sanguins. En cas de saignement, appliquez une goutte de aCSF et attendre pendant 2-3 min pour un saignement mineur pour arrêter. </li><li> Préparer 0,07% bas point de fusion d&#39;agarose dissous dans aCSF) Amener la fondue d&#39;agarose à la température corporelle. Essuyer l&#39;excès de la surface de LCRa du cerveau. Verser l&#39;agarose dans la fenêtre, et couvrir avec une lame de verre. Appuyez doucement le verre pour faire un contact entre le verre et la plaque de tête, et attendre 10-20 secondes jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solide. </li><li> Enlever l&#39;excès d&#39;agarose de la couverture de verre en utilisant des pinces et du papier tissu mou. </li><li> Mettez une petitequantité de colle rapide autour du verre de coller le verre à la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire à solidifier la colle (Figure 1). </li></ol> 3. L&#39;injection intraveineuse et la surveillance oxygénation du sang Remarque: Nous avons régulièrement utilisé dans la veine fémorale pour l&#39;application par voie intraveineuse du Texas rouge plutôt que la veine de la queue. C&#39;est parce que les injections veine fémorale des injections en bolus sûre et reproductible de la teinture. <ol><li> Activer l&#39;animal partiellement au-dessus d&#39;exposer l&#39;intérieur de la cuisse gauche. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l&#39;animal dans cette position. </li><li> Appliquer nettoyant antiseptique, puis l&#39;éthanol à 100% à la peau. </li><li> Faire une incision le long de la cuisse médiale du genou à la symphyse pubienne. Séparez les tissus mous par dissection à l&#39;aide des pincettes n ° 5. </li><li> Remplir la seringue de 1 ml avec 130 ul de Texas Red (2,5 mg / ml). Fixez une nouvelle aiguille (calibre 30), et le plier soigneusement à 30 °, en gardant le biseau vers le haut. Remplissez le wi aiguillee Texas Red solution. </li><li> Sous un microscope à dissection, insérer l&#39;aiguille dans la veine fémorale et injecter 100 ml de Texas Red. Retirez l&#39;aiguille et appuyer légèrement sur la veine avec de la gaze pour arrêter le saignement. </li><li> Fermez la peau à l&#39;aide de suture 4-0. </li><li> Pour la surveillance continue du sang SpO 2 (pour assurer l&#39;oxygénation du sang adéquat) placer la sonde d&#39;oxymètre à la cuisse droite (à partir de laquelle les cheveux a été retiré). </li></ol> 4. Imagerie biphotonique Remarque: Nous utilisons un Olympus Fluoview1000 multiphotonique système d&#39;imagerie (debout) avec un Ti Spectra-Physics MaiTai HP femtoseconde DeepSee: Sa laser comme source d&#39;excitation. Pour l&#39;imagerie, nous utilisons × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), ou 25 × NA 1,05 (Olympus XLPlan N) de l&#39;eau d&#39;immersion objectifs. Nous prenons des images à 12 bits de profondeur à une résolution de 512 × 512 pixels avec un pixel temps de séjour de 2 ms. Le NADH et le Texas-Red-dextrane sont en même temps excité à 740 nm, et fluorescence est séparée de la lumière d&#39;excitation à l&#39;aide d&#39;un miroir dichroïque / proche-IR bloquant la combinaison de filtres (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, Etats-Unis), divisé en deux canaux en utilisant un miroir dichroïque (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, États-Unis), et filtré passe-bande (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Puissance du laser mesurée après l&#39;objectif de 10-20 mW pour l&#39;imagerie dans la couche I et 20-50 mW pour l&#39;imagerie dans la couche II. <ol><li> Transfert de la souris chirurgicalement prêt à la platine du microscope. Prenez une première image du site en utilisant la fenêtre crânienne fond clair avec un grossissement 4x pour l&#39;utiliser comme une carte de référence pour l&#39;enregistrement avec un plus fort grossissement à deux photons angiographies. </li><li> Zoom sur la zone d&#39;intérêt en utilisant un grossissement x 10. Sélectionnez une zone d&#39;intérêt dans les couches corticales I ou II (jusqu&#39;à 150 um en dessous de la surface piale). Si un plus fort grossissement est désiré, utiliser l&#39;objectif × 25 </li><li> Début de l&#39;enregistrement de la série chronologique (Figure 2). Nous vous recommandons d&#39;utiliser une moyenne de 3-5 cadres pour améliorer la qualité de l&#39;image. </li><li> Provoquer une hypoxémie en ajoutant N2 50% à l&#39;air que l&#39;animal respire. Cela portera le niveau d&#39;O2 à 10%. Vérifiez l&#39;hypoxémie par la surveillance des données d&#39;oxymètre. </li><li> Continuer pour enregistrer la série de temps grâce à une hypoxémie (par exemple, pour 30 secondes), et après niveau normal O2 est rétablie. </li><li> Recueillir des données pour le calcul de la distribution d&#39;oxygène par la détection, la mesure et la quantification de la zone de cylindres de tissus hypoxie et oxygénée autour des vaisseaux sanguins. </li></ol> 5. Informatique <ol><li> Déterminer la Krogh tissus cylindre de rayon R. Cela peut être fait manuellement (Figure 3) en mesurant la distance entre le centre du vaisseau sanguin et de la limite haute à laquelle la fluorescence du NADH est détecté. </li><li> Sinon, utilisez le calcul enquêteur indépendant semi-automatique de détermination du rayon R tissus cylindre et le blo centraler od navire qui a été décrit précédemment 1 sous forme complémentaire et résumées dans la section discussion de ce protocole. </li><li> Déterminer la zone de l&#39;hypoxie en utilisant un logiciel d&#39;accès ouvert d&#39;analyse d&#39;image, par exemple ImageJ. Pour ce faire, utiliser le signal NADH, définir un seuil qui délimite la zone de haute intensité NADH, puis de mesurer la surface avec la fluorescence des tissus élevée NADH. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La figure 2 montre une vidéo de NADH / angiographie images lors de l&#39;hypoxémie transitoire (pour la version PDF de cette figure, les images sélectionnées ont été utilisées). La concentration d&#39;oxygène inspiré a été abaissé de 21% à 10% pour une période de 3 min. Ce niveau d&#39;hypoxémie induite expérimentalement est suffisante pour induire une hypoxie sévère dans le cortex cérébral. Hypoxie conduit à une augmentation de la fluorescence du NADH, d&#39;abord dans les régions qui étaient la plus éloignée de l&#39;irrigation sanguine artérielle. Notez le tissu NADH fortefrontières, qui représentent les limites observables de tissus diffusion de l&#39;oxygène à partir de la microcirculation corticale. L&#39;image de la figure 3 montre la géométrie des limites de diffusion d&#39;oxygène entourant les vaisseaux cérébraux. Il est possible de déduire Krogh diamètres de cylindre de ces limites, comme décrit précédemment 1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> Figure 1. (A) de souris avec fenêtre crânienne préparé pour l&#39;imagerie. (B) Dimensions de la plaque de tête. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> Figure 2. Endogène NADH fluorescence verte visualisées avec l&#39;imagerie à deux photons à travers la fenêtre crânienne, environ 50 um en dessous de la surface piale. Les vaisseaux sanguins sont visualisées avec Texas Red dextran. Oxygène dans l&#39;air inhalé a été réduit à 10% pendant 3 min, puis restauré pour 21%. La barre d&#39;échelle: 50 um. &lt;img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Géométrie de NADH limites de fluorescence. Contour jaune montre la limite de l&#39;hypoxie fonctionnelle; cercles bleus montrent projetées oxygénés (Krogh) cylindres. Les lignes bleues indiquent les rayons cylindre; chiffres montrent rayons en micromètres.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Haute résolution spatiale des informations sur la diffusion d&#39;oxygène est important de comprendre comment le flux sanguin dans le cerveau est régulé pour fournir l&#39;oxygène aux cellules du cerveau, et de répondre à la demande métabolique. Traditionnelles mesures de l&#39;oxygène en utilisant des électrodes polarographiques de verre de style Clark sont très envahissantes et ont une faible résolution spatiale 2-3 et temps de réponse significative (deuxième plage). Jusqu&#39;à présent, la seule méthode non-invasive pour la mesure de la pO 2 dans le tissu cérébral est trempe phosphorescence, où le taux de décroissance de la sonde excité est proportionnelle à 4 la concentration en oxygène. Cette méthode fournit des concentrations d&#39;oxygène précis, mais nécessite un colorant et un propriétaire techniquement sophistiqué système d&#39;imagerie phosphorescence vie. Ici, nous démontrons une simple, approche plus simple qui peut être effectuée sur un système d&#39;imagerie à deux photons en standard avec deux canaux flurescence. Notre approche tire parti d&#39;un signal de tissu intrinsèque 5 ae ne nécessite que la visualisation contraste de la microcirculation corticale. En raison de la non-linéaire, augmentation essentiellement binaire de NADH fluorescence à fonctionnellement limiter les concentrations d&#39;oxygène 1, augmenté intrinsèque NADH fluorescence est observée seulement dans les zones importantes, limitant l&#39;hypoxie métabolique. Une implication importante est que les limites des tissus de diffusion de l&#39;oxygène à partir de microvaisseaux corticaux sont directement observables par les changements d&#39;intensité de forme cylindrique de NADH fluorescence endogène. Nous nous référons à ces structures que les cylindres Krogh, parce que le concept de structures de forme cylindrique qui définissent le volume oxygéné du tissu environnant un vaisseau sanguin a été introduit par Krogh Août et a été récemment observé expérimentalement à l&#39;aide de deux photons NADH imagerie 1. Cylindres Krogh images peuvent être collectées en 3D en prenant un z-stack de trames d&#39;image. Ils sont particulièrement marquée dans le voisinage des artérioles pénétrantes et elles sont l&#39;esprit congrueh capillaire appauvri périartériolaires cylindres tissus 1,4. Pour fournir une détermination objective de la R tissus Krogh rayon du cylindre (voir section 5.2), nous avons mesuré leurs valeurs d&#39;intensité de pixels radiaux dans un segment bien défini entre le centre du cylindre et la limite extérieure en utilisant la fonction Matlab &quot;improfile&quot;. La limite externe du segment doit être choisi pour étendre avec une marge de sécurité au-delà de la limite visibles. Pour améliorer le niveau de signal sur bruit on averageed de toutes les lignes radiales nécessaires pour couvrir le segment visible cylindre à pas de 1 °. Le profil moyen résultant d&#39;intensité radiale dans le segment présentait une forte augmentation qui correspond à la limite de tissu R visible. Le nous nous situons une fonction sigmoïde (par exemple Boltzmann fonction) pour le profil d&#39;intensité radiale moyenne et a utilisé son point d&#39;inflexion (aussi connu sous le nom x 0) comme une définition de la R. Le correspondante de deux pHoton microangiographie (Texas-rouge) a révélé la section transversale d&#39;un vaisseau sanguin central solitaire dans le centre du cylindre. Le diamètre du vaisseau sanguin centrale peut être appliquée directement à déterminer r. Deux photons NADH imagerie fournit la même résolution spatiale que la concurrente imagerie à haute résolution de l&#39;microangiographie corticale. Une caractéristique importante pour l&#39;application quantitative de cette méthode est que p 50 de l&#39;augmentation de la fluorescence du NADH a été mesurée à 3,4 ± 0,6 de mm Hg 1 et que l&#39;intensité de fluorescence du NADH en fonction du tissu microrégionale pO 2 peut être décrit mathématiquement avec une fonction sigmoïde. . Nous montrons que cette technique permet d&#39;identifier les zones du cerveau qui sont les plus vulnérables à l&#39;hypoxie (diminution de la teneur en oxygène de l&#39;air à 10%). Nous montrons également que la diffusion d&#39;oxygène suit un modèle géométrique simple périvasculaire. Une critiqueétape iCal pour cette méthode est la qualité de la préparation fenêtre crânienne. La chirurgie devrait produire un minimum de dommages pour ne pas perturber le flux sanguin vers la zone exposée. Une préoccupation, c&#39;est que dans une préparation chirurgicale compromise, le cortex sous la fenêtre peut être hypoxique, pour commencer, s&#39;oppose à toutes les expériences significatives. Une fenêtre bien préparé crânienne devrait avoir intacts les vaisseaux sanguins majeurs et mineurs à la circulation sanguine vive dans tous les types de navires et aucun saignement important le long des bords. Dans des conditions normoxiques (PaO2 mmHg 80-100, Sp O2 97-99%) dans le parenchyme cérébral doivent présenter uniforme, la fluorescence du NADH homogène sans taches bien visibles, des tissus lumineux avec une fluorescence NADH élevée. Une contrainte physique fondamentale de notre approche est limitée profondeur de pénétration. La fluorescence bleu-vert NADH dans le cerveau est rapidement atténué par l&#39;absorption de l&#39;hémoglobine et de diffusion tissulaire à ces longueurs d&#39;onde. Même avec une ouverture numérique élevée (par exemple 1,05) de l&#39;eaudes objectifs à immersion à deux photons NADH imagerie est actuellement limitée à corticale couches I et II. Cette limitation est scientifiquement pertinente, car le métabolisme de l&#39;énergie dans ou à proximité de la substance blanche sera probablement différente de la matière grise. Toutefois, l&#39;enquête de profondes structures corticales telles que des couches IV-VI ou des structures sous-corticales comme faisceaux de matière blanche ou le striatum exigerait l&#39;utilisation de microlentilles spécialisées telles que décrites dans le cortex de la souris in vivo 6. NADH-mesure basée sur des limites diffusion de l&#39;oxygène peut être particulièrement utile lorsqu&#39;il est combiné avec d&#39;autres mesures telles que les analyses d&#39;hyperémie fonctionnelle, et la détection de taux de flux capillaires 7. Par exemple, cette technique peut être adaptée pour visualiser l&#39;hypoxie dans la course et la maladie d&#39;Alzheimer (AD) des modèles. La géométrie simple de diffusion de l&#39;oxygène permet de prédire le gradient d&#39;oxygène dans des lits microvasculaires dans des circonstances où la densité capillaire est defroissé 8 (par exemple, AD 9) et d&#39;examiner si les régions de tissus cérébraux dont la densité capillaire réduite courent un risque accru pour les dommages en raison de l&#39;hypoxie microstrokes. La capacité de l&#39;image microregionally permet également à examiner la géométrie et les dimensions de microstrokes tissus et déterminer le volume de tissu dans laquelle l&#39;hypoxie se produit, ainsi que la relation entre l&#39;hypoxie tissulaire et postérieure mort neuronale ou remodelage capillaire 10. Enfin, puisque les augmentations de la fluorescence du NADH endogène sont la conséquence directe de la dysfonction mitochondriale aiguë, cette méthode crée la possibilité d&#39;utiliser l&#39;imagerie NADH en tant que journaliste pour le métabolisme énergétique spécifique de neurones 11 et un proxy pour un dysfonctionnement mitochondrial. En conclusion, l&#39;imagerie à deux photons de fluorescence est endogène NADH un outil simple et peu exigeante qui peut être utilisé pour comprendre l&#39;apport d&#39;oxygène et la consommation dans le cerveau sous la normale à la foiset dans les états pathologiques.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Les coussins chauffants </td><td> Au-delà de la chaleur Bodi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pommade ophtalmique (larmes artificielles) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution de polyvidone iodée à 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution de chlorure ferrique 10% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciment </td><td> Stoelting Société </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> 454 Cyanoacrylate </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II pièce à main kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Bits de la FRI de forage 007 </td><td> Outils belle science </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps # 5 </td><td> Outils belle science </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Pince n ° 5/45 </td><td> Outils belle science </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 une lamelle en verre </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tube photomultiplicateur </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Laser Ti: Saphir Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

La capacité du cerveau de fonctionner à des niveaux élevés de demande métabolique dépend de l&#39;apport d&#39;oxygène en continu par le biais du flux sanguin et la diffusion d&#39;oxygène aux tissus. Ici, nous présentons un protocole expérimental et visualisées méthodologique de visualiser directement l&#39;hypoxie tissulaire microrégionale et d&#39;en déduire les gradients d&#39;oxygène périvasculaires dans le cortex de la souris. Il est basé sur la relation non linéaire entre le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NADH) endogène intensité de fluorescence et de la pression partielle d&#39;oxygène dans le tissu, où le tissu observées NADH fluorescence augmente brusquement à la teneur en oxygène inférieure à 10 mmHg tissus 1. On utilise deux photons d&#39;excitation à 740 nm qui permet pour l&#39;excitation simultanée de la fluorescence de tissu intrinsèque NADH et le plasma sanguin en contraste avec le Texas-Red dextrane. Les avantages de cette méthode par rapport aux approches existantes sont les suivantes: il profite d&#39;un signal de tissu intrinsèque et peut être réalisée en utilisant la norme à deux photons in vivo imvieillissement des équipements, il permet une surveillance continue dans l&#39;ensemble du champ de vue avec une résolution en profondeur de ~ 50 um. Nous démontrons que les zones les plus éloignées de tissus cérébraux vaisseaux sanguins cérébraux correspondent à des zones vulnérables des bassins versants qui sont les premiers à devenir fonctionnellement hypoxique après une baisse de l&#39;apport en oxygène vasculaire. Cette méthode permet à l&#39;image de l&#39;oxygénation corticale microrégionale et est donc utile d&#39;examiner le rôle de l&#39;approvisionnement des tissus en oxygène est insuffisante ou restreinte dans les maladies neuro-vasculaires et accidents vasculaires cérébraux.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser directement l&#39;hypoxie tissulaire microrégionale dans le cortex de la souris<em&gt; In vivo</em&gt;. Il est basé sur simultanée de deux photons d&#39;imagerie du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et de la microcirculation corticale. Cette méthode est utile pour l&#39;analyse haute résolution de l&#39;approvisionnement des tissus en oxygène.

La détection de l&#39;hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

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JoVE Journal

Neuroscience

16.0K vues.  University of Rochester Medical Center. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser directement l'hypoxie tissulaire microrégionale dans le cortex de la souris In vivo. Il est basé sur simultanée de deux photons d'imagerie du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et de la microcirculation corticale. Cette méthode est utile pour l'analyse haute résolution de l'approvisionnement des tissus en oxygène.

Vidéo: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Neurosciences

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantification de l&#39;architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.