Cette procédure permet un accès optique répété à l’hippocampe dorsal des souris vivantes pour étudier les mécanismes de formation et de rappel de la mémoire pendant qu’elles effectuent des tâches d’apprentissage. Cette technique permet l’utilisation de la microscopie légère pour étudier l’hippocampe dorsal des souris vivantes au niveau du micromètre résolution spatiale longitudinal sur plusieurs semaines. La perte de mémoire est une caractéristique générale de certaines maladies du cerveau comme la maladie d’Alzheimer.
Comprendre le mécanisme de formation et de rappel de la mémoire pourrait en fin de compte aider les patients souffrant de ces maladies. Cette méthode pourrait être appliquée à d’autres systèmes animaux avec un crâne comme les petits mammifères. La surveillance des signes vitaux lors d’une chirurgie de survie peut être à la fois distrayante et stressante.
Il pourrait être utile d’effectuer d’abord la procédure sur un animal mort afin de se concentrer sur les aspects les plus cruciaux de la procédure. Pour préparer la canule d’imagerie, coupez d’abord un tube en acier inoxydable de trois millimètres de diamètre en un anneau métallique de 1,6 millimètre de long. Si les bords de l’anneau ne sont pas émoussés après la coupe, déposez les irrégularités.
Ensuite, utilisez une paire de forceps pour tremper un côté de l’anneau métallique dans un adhésif optique de séchage UV. Placez ensuite l’anneau métallique au centre d’un couvercle en verre avec le côté de l’anneau recouvert d’adhésif touchant le coverslip. Allumez l’unité de conducteur de LED de durcissement UV et brillez la lumière de longueur d’onde de 365 nanomètres sur l’adhésif pendant une minute pour guérir l’adhésif.
Assurez-vous que tous les côtés de l’anneau sont également éclairés en changeant la direction de la source lumineuse. Une fois l’adhésif durci pendant au moins deux heures, maintenez fermement la canule de l’extrémité ouverte de l’anneau métallique au moyen d’un hémstat. À l’aide d’une perceuse dentaire munie d’un dossier rotatif, déposer l’excédent de couvercle de verre jusqu’à ce qu’il soit rincé avec les côtés de l’anneau.
Préparez les instruments requis et anesthésiez la souris telle que décrite dans le protocole texte qui l’accompagne. Retirez ensuite les cheveux et désinfectez la peau sur la tête de la souris. Ensuite, utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une petite coupe dans le cuir chevelu dans la position proche de lambda.
Déplacez-vous latéralement dans la direction des oreilles, puis rostrally dans la direction des orbites oculaires pour former un triangle sur l’axe sagittal environ quatre millimètres rostral à bregma. Appliquer une seule goutte de lidocaïne sur le crâne. Après deux minutes, dégager le périostée et sécher le crâne à l’aide d’un coton-tige.
Ensuite, placez les barres d’oreille pour fixer la tête de la souris. À l’aide d’une micro foreuse avec une bavure de largeur de 0,5 millimètre, faire un petit trou dans l’os frontal en face de l’hippocampe à l’image d’environ 1,5 millimètres de la suture sagittale et deux millimètres distal de la suture coronale. Puis vissez une vis en acier inoxydable de 0,86 millimètre de largeur dans le trou du crâne.
Fixez-le en place à l’aide de ciment adhésif. Laisser sécher le ciment de 30 secondes à une minute. Ensuite, utilisez une perceuse trephine de trois millimètres de diamètre pour faire un petit trou dans l’os pariétal.
Placez le trou à environ 1,5 millimètre distal de la suture sagittale et deux millimètres distal de la suture lambdoid. Retirer délicatement le rabat d’os. Retirez ensuite les méninges à l’aide des forceps Dumont.
Ablate la matière corticale pour atteindre la capsule externe. Utilisez une aiguille contondant de calibre 19 reliée à une pompe à vide et irriguer avec de la solution saline pour éviter la déshydratation du tissu exposé et laver tout sang résiduel après la résolution du saignement. Sucer le tissu cortical lentement environ 50 à 100 microns à la fois jusqu’à ce que le cortex se détache de la capsule exposant les fibres du cingulum ou du corpus callosum.
Peler ensuite soigneusement les fibres dorsales jusqu’à ce que les fibres les plus profondes, l’alveus de l’hippocampe soient exposés. Une fois terminé, rincer le tissu avec de la solution saline. Ensuite, utilisez des forceps minces pour tremper la canule inférieure dans la solution saline et la positionner sur le trou du crâne.
Poussez ensuite la canule dans le crâne jusqu’à ce que le couvercle en verre soit en contact avec les fibres. Séchez le crâne et appliquez un ciment adhésif rapide sur le crâne pour maintenir la canule en place. Assurez-vous également d’appliquer de l’adhésif sur le bord de la canule, mais veillez à ne pas laisser l’adhésif courir dans la canule.
Une fois sec, utilisez un bras stéréotaxique pour positionner une plaque porte-tête au-dessus de la canule en contact avec le crâne. Préparer un mélange d’acrylique dentaire, puis l’appliquer sur tout le crâne. Couvrir l’ensemble du crâne exposé, la vis et la peau ouverte d’acrylique dentaire pour stabiliser la préparation.
Après 15 minutes, appliquer un film adhésif amovible sur la plaque du porte-tête pour empêcher les débris d’entrer dans la canule. Lorsqu’il est prêt à l’image du cerveau, suivez à nouveau dans le protocole texte d’accompagnement pour plus de détails sur l’anesthésie. Une fois suffisamment sous sedated, utiliser des forceps pour enlever soigneusement le film adhésif de la plaque du porte-tête.
Retirer délicatement le film pour éviter d’endommager la préparation. Ensuite, placez la souris sous le microscope sur le tapis chauffant et fixez la plaque de tête au support. Appliquez de la pommade oculaire sur les yeux de l’animal.
Nettoyez ensuite la canule d’imagerie à l’aide d’une seringue et d’une aiguille fine pour laisser tomber de l’eau déionisée dans la canule suivie d’un retrait à l’aide d’une pompe à vide. Utilisez des objectifs de longue distance de grossissement faible pour vérifier visuellement la canule pour détecter l’eau résiduelle, la saleté, l’intégrité et la présence de fluorescence. Alignez ensuite la canule sur l’axe optique en ajustant les angles des bras du porte-tête.
Passez à un objectif 25X avec une ouverture numérique de 1,0 et une distance de travail de quatre millimètres. Ajouter ensuite suffisamment d’eau déionisée à la canule pour la remplir et maintenir l’excès d’eau au-dessus de la canule. Enfin, utilisez deux images excitation et imagez les signaux de fluorescence.
Il est indiqué ici une pile d’images 2P provenant d’un cerveau de souris transgénique thy1-GFP. Les souris Thy1-GFP expriment le GFP amélioré cytoplasmique sous le contrôle du promoteur Thy1 dans une population aléatoire clairsemée de neurones pyramidaux. En général, l’axe principal des neurones pyramidaux dans le CA1 hippocampal dorsal est approximativement perpendiculaire au plan d’imagerie XY.
Ces régions sont cartographiées manuellement à une pile tridimensionnelle à faible grossissement montrant le modèle d’expression GFP dans le volume au-dessous de la canule d’imagerie. Pour le suivi longitudinal, plusieurs régions du cerveau dans le champ de vision de la canule sont définies. Chaque région correspond à une superficie d’environ 240 micromètres sur 240 et contient entre un et sept segments dendritiques.
La série image montre ici un micromètre z-step piles d’images de neurones pyramidaux CA1 et dendrites basaux acquis à différents intervalles de temps pendant 14 jours. Toutefois, des durées et des intervalles d’imagerie plus longs sont possibles. Bien que la plupart des images soient d’épines dendritiques dans la strate oriens, il est également possible d’imager les épines dendritiques dans les dendrites obliques du radiatum stratique.
Une autre extension de cette technique est d’imager la plasticité évoquée par l’activité dans les neurones pyramidaux CA1 en injectant la zone dorsale ca1 hippocampal avec un vecteur viral. Cela permet de mesurer ici la plasticité de centaines de neurones pyramidaux CA1 dans chaque animal comme une pile d’images 2P. Il est crucial de prévenir les dommages à l’hippocampe lors de l’ablation du tissu qui s’en trouve.
En outre, il faut placer la canule correctement pour assurer une préparation stable. La préparation décrite permet l’utilisation de différents types d’imagerie optique tels que des microscopes miniatures qui peuvent être implantés sur la tête de l’animal. Cela permet au chercheur de suivre l’activité neuronale chez les animaux en mouvement libre.
À l’origine, la technique a été utilisée pour étudier la plasticité structurale dans les neurones hippocampaux. Aujourd’hui, il est mis en œuvre dans l’étude de l’activité neuronale aussi dans d’autres zones du cerveau.
