Nous tenons à souligner l&#39;appui de US National Institutes of Health R01NS057476 subventions, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 et R01EB007279 et l&#39;American Heart Association octroi 0855772D.

1. Large champ de vue de l&#39;imagerie pO2 dans le système vasculaire corticale de rat <ol><li> Les rats (250 g -350 g) sont d&#39;abord anesthésiés à l&#39;isoflurane, et l&#39;artère et la veine fémorales sont cathétérisés pour surveiller le rythme cardiaque, pression artérielle, et des gaz du sang, ainsi que pour perfusion intraveineuse. La température corporelle est maintenue à 37 ± 0,1 ° C. La trachéotomie est réalisée, et les rats sont ventilés avec un mélange d&#39;air et d&#39;oxygène. </li><li> Des échantillons de sang pour mesurer les gaz du sang sont prélevés toutes les 30 à 45 min et la ventilation et l&#39;anesthésie sont ajustés pour maintenir les gaz du sang dans les limites physiologiques normales. </li><li> Une fenêtre fermée crânienne sur l&#39;os pariétal 4 mm x 4 mm est préparé pour l&#39;imagerie. L&#39;os et la durée sont supprimées et la fenêtre crânienne est rempli avec 1,5% d&#39;agarose et scellé avec une lamelle de microscope. Un montant supplémentaire de 1 mm 2 trou de trépan sur l&#39;os frontal est utilisé pour induire la CDD par microinjection intracorticale de KCl (~ 10 pl, 1 M). Un soin extrême doit être pris pour éviter tout dommage de la vascularisation corticale. L&#39;excès de chaleur, une pression mécanique, ou brève période d&#39;hypoxie peut compromettre barrière hémato-encéphalique et provoquer des fuites de la teinture de la vascularisation dans l&#39;espace interstitiel. </li><li> Un masque à partir de matériaux optiquement opaque est placé autour de la fenêtre crânienne. Le but du masque est d&#39;absorber le signal de phosphorescence qui vient de la teinture qui a fui dans le tissu sur les bords de la dure-mère. Le colorant dans l&#39;espace interstitiel est la source de la phosphorescence très lumineux qui peuvent gâcher la mesure. La luminosité accrue du colorant dans l&#39;espace interstitiel est le résultat de l&#39;accumulation de colorant dans l&#39;environnement avec une pression en oxygène est faible et le taux de trempe faible. Les dégâts de la vascularisation dans l&#39;expérience est donc facilement reconnaissable par l&#39;apparition de taches lumineuses phosphorescence, dans ce cas, les données expérimentales est rejetée. </li><li> Après achèvement de la chirurgie, l&#39;isoflurane est interrompu et l&#39;anesthésie est passé à alphachloralose (50 mg / kg en bolus intraveineux suivie par 40 mg / (kg h) de perfusion). </li><li> Animale est transféré sur un chariot avec ventilateur, la pression sanguine et de surveiller la température. Bien respirer l&#39;air ambiant, l&#39;animal est rapidement passé à l&#39;installation d&#39;imagerie et rattaché au débitmètre avec le mélange approprié d&#39;air et d&#39;oxygène. </li><li> Le cadre stéréotaxique qui détient l&#39;animal est placé sous l&#39;objectif. La fenêtre crânienne est centré dans le champ de vue sous l&#39;objectif et placé parallèlement au plan focal. </li><li> Le laser pulsé est activé et réglé à l&#39;énergie d&#39;impulsion minimale. Le faisceau optique est dirigé vers compteur d&#39;énergie d&#39;impulsion et d&#39;énergie impulsion délivrée à l&#39;échantillon est ajustée pour être pas plus de 10 mJ / cm 2. L&#39;ISS faisceau centré sur la fenêtre crânienne avec un angle d&#39;incidence oblique de ~ 60 degrés et laser de l&#39;ISS éteint. </li><li> Mesures des gaz du sang et des ajustements de la ventilation et l&#39;anesthésie sont effectués jusqu&#39;à ce que tous les paramètres physiologiques de l&#39;animal se trouvait à portée physiologique normal. </li><li> En supposant que le volume de sang est d&#39;environ 7% du poids du corps, une quantité appropriée de la R3 Oxyphor sonde phosphorescence est dissous dans 1 ml de solution saline pour atteindre 4 x 10 -5 M concentration sanguine de la sonde. La solution de sonde est injecté par la veine fémorale. </li><li> Une solution à 1 M de chlorure de potassium est préparé et ~ 1 ul est injecté à la seringue à travers le trou de trépan sur l&#39;os frontal pour induire la CDD. </li><li> Le laser est activé et l&#39;imagerie est démarré immédiatement après l&#39;injection de la solution de KCl. Imagerie de phosphorescence est effectuée pendant environ 10 minutes. </li><li> Une autre mesure des gaz du sang est effectuée pour confirmer que les paramètres physiologiques des animaux sont toujours dans la plage normale. </li><li> Phosphorescence vies sont obtenus pour tous les pixels en ajustant la décroissance exponentielle simple à l&#39;aide de montage carrés non linéaires avec pondération statistique dans MATLAB. Phosphorescence vies sont convertis à la pO2 valeurs en utilisant une approche empirique Stern Volmer-comme la relation (voir infra). </li></ol> 2. Haute résolution à deux photons pO2 imagerie vasculaire micro corticales de souris <ol><li> Les souris sont anesthésiées avec l&#39;artère fémorale est isofluorene et cathétérisés pour surveiller le rythme cardiaque, pression artérielle, et des gaz du sang, ainsi que pour l&#39;administration de la teinture. La température corporelle est maintenue à 37 ± 0,1 ° C et les animaux sont en respiration spontanée d&#39;un mélange d&#39;air et d&#39;oxygène. </li><li> Une fenêtre crânienne est préparé selon la technique développée à l&#39;origine par David Kleinfeld et Winfried Denk. Un bon soin devraient être prises pour éviter tout dommage de la vascularisation pour éviter toute fuite du colorant dans l&#39;espace interstitiel. </li><li> Un peu d&#39;échantillons de sang pour mesurer les gaz du sang sont prises lors d&#39;une procédure de préparation et de l&#39;ensemble de ventilation et d&#39;anesthésie sont ajustées pour garder le gaz du sanges dans les limites physiologiques normales. </li><li> L&#39;animal est déplacé à l&#39;installation d&#39;imagerie. Un cadre stéréotaxique modifiés qui détient l&#39;animal est placé sous l&#39;objectif. La fenêtre crânienne est centré dans le champ de vision sous l&#39;objectif de l&#39;Olympe 4X et positionné parallèlement au plan focal. </li><li> Une image de la fenêtre crânienne est pris avec l&#39;appareil photo numérique à travers les oculaires, et l&#39;objectif 4X est remplacé par l&#39;Olympus 20X objectif (NA = 0,95). </li><li> Mesures des gaz du sang et des ajustements de la ventilation et l&#39;anesthésie sont effectués jusqu&#39;à ce que tous les paramètres physiologiques de l&#39;animal sont dans une fourchette physiologique normal. </li><li> En supposant que le volume de sang est d&#39;environ 7% du poids du corps, une quantité appropriée de la phosphorescence de sonde PTP-C343 est dissoute dans 0,2 ml de solution saline pour atteindre environ 15 uM concentration sanguine de la sonde. La solution de sonde est injecté par l&#39;artère fémorale. </li><li> Commencez l&#39;expérience par la mise en intervalles de temps désiré pour l&#39;excitation de colorant et de collecte des émissions à chaque pixel. </li><li> Acquérir un scan enquête qui est un balayage de trame lente 2-dimensionnelle de variation d&#39;intensité de phosphorescence qui affiche la structure vasculaire à la profondeur actuelle. L&#39;objectif est déplacée perpendiculairement à la fenêtre crânienne (axe Z) et lent scans levé 2D de l&#39;intensité de la phosphorescence sont prises en utilisant la puissance du laser minimale à 840 nm de trouver les microvaisseaux dans le plan d&#39;imagerie. </li><li> A chaque profondeur d&#39;imagerie, basée sur l&#39;analyse enquête de phosphorescence à cette profondeur, un ensemble de points dans la vascularisation sont sélectionnés, et l&#39;enregistrement de désintégrations de phosphorescence à chaque point est répétée pour un nombre prédéfini de la moyenne. </li><li> Réglez la quantité désirée de la moyenne, l&#39;intervalle de mesure, et durée de l&#39;expérience et de commencer la mesure. pO 2 mesures sont acquises aux endroits choisis à l&#39;intervalle de mesure spécifiée pour la durée de l&#39;expérience. </li><li> Lors des mesures, le logiciel redirige le laser d&#39;excitation à l&#39;emplacement sélectionné en changeant la position des miroirs de balayage galvanomètre. Contrôle des scanners galvanomètre, électro modulateur optique, et tous les autres équipements sont effectuées par le logiciel fait sur mesure dans LabVIEW. </li><li> Phosphorescence vies sont obtenus pour tous les points sélectionnés en ajustant la décroissance exponentielle simple à l&#39;aide de montage non linéaire carrés dans Matlab. Phosphorescence vies sont convertis à la pO2 valeurs en utilisant une approche empirique Stern Volmer-comme la relation (voir infra). </li><li> Après la collecte des données à différentes profondeurs corticale, injecter dextran conjugué fluorescéine dans les vaisseaux sanguins pour l&#39;imagerie de la structure microvasculaire. </li><li> Procurez-vous une pile d&#39;images structurelles de la vascularisation en effectuant l&#39;imagerie à deux photons de fluorescence FITC utilisant un canal vert dans le détecteur à quatre canaux. </li><li> Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Sous Massachusetts General Hospital sur le soin des animaux de recherche. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Panel (a) sur le côté gauche de cette figure affiche un large champ de vue de l&#39;image pression d&#39;oxygène avant l&#39;arrivée d&#39;une vague de CDD. Panneau (b) sur le côté droit montre l&#39;évolution temporelle de la pression d&#39;oxygène en moyenne pendant la propagation CDD au sein de la région d&#39;intérêt a marqué sur le panneau (a). Figure 2 (AVI film): Ce film montre l&#39;évolution temporelle de la pression d&#39;oxygène dans toute la fenêtre crânienne pendant la propagation de l&#39;onde CDD. La barre d&#39;échelle indique la pression d&#39;oxygène en millimètres de mercure. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Projection en 3D de la pile de la vascularisation imagée. Les nuances de gris représentent un masque cuve volumétrique, créé sur la base de l&#39;image structurelle. Mesuré pO 2 valeurs sont codés par couleur. La barre d&#39;échelle est de 200 micromètres. Reproduit avec la permission de Nature Publishing Group. 7

<ol>
	<li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y., Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+occlusion+to+surface+and+deep+vessels+in+neocortex+via+linear+and+nonlinear+optical+absorption,+Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries.">Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries.</a> Contemporary Neuroscience Series. , (2007).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems.">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials &#38; Interfaces. , (2009).</li><li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence.">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li><li>Sakad&#382;i&#263;, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression.">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li><li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy.">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li><li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li></ol>

Nous avons démontré deux applications de la mesure de la pO2 dans la microvascularisation corticale à base d&#39;oxygène-dépendant trempe de phosphorescence. Alors que la première méthode basée sur l&#39;imagerie CCD fournit large champ de vue de la surveillance pO2, mesure de la pression partielle d&#39;oxygène dans microvascularisation corticale repose sur deux microscopie biphotonique offre une résolution capillaire et permet l&#39;imagerie en profondeur. Ces deux méthodes fournissent haute vitesse et haut...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycopyrrolate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Regent Inc.</td>
<td>NDC 0517-4605-25</td>
<td>Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lidocaine HCL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc.</td>
<td>NDC 0409-4277-01</td>
<td>Used as the local anesthesia during surgeries.</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Baxter Healthcare Corp.</td>
<td>NDC 10019-360-40</td>
<td>Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Chloralose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0128</td>
<td>Used as a general anesthesia during experiments with rats.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein isothio-cyanate&#x2013;dextran</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>FD2000S</td>
<td>Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cerebral blood oxygenation measurement based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence

Surveillance des caractéristiques spatio-temporelle des sanguin cérébral et l&#39;oxygénation des tissus est cruciale pour une meilleure compréhension de la relation de neuro-métaboliques-vasculaires. Développement de nouvelles modalités de mesure avec la pO2 surveillance simultanée de pO2 dans les grands champs de vue avec une meilleure résolution spatiale et / ou temporelle permettra de mieux comprendre le fonctionnement du cerveau normal et également avoir un impact significatif sur le diagnostic et le traitement des maladies neurovasculaires tels que accident vasculaire cérébral, maladie d&#39;Alzheimer, et de blessures à la tête. Modalités d&#39;imagerie optique ont montré un grand potentiel pour fournir une haute résolution spatio-temporelle et l&#39;imagerie quantitative de pO2 basé sur l&#39;absorption d&#39;hémoglobine dans la gamme visible et infrarouge proche du spectre optique. Cependant, la mesure de l&#39;oxygénation du sang multispectrales cérébrale repose sur la migration des photons à travers le tissu cérébral hautement diffusant. Estimation et modélisation des paramètres optiques des tissus, qui peuvent subir des changements dynamiques au cours de l&#39;expérience, est généralement requis pour l&#39;estimation précise de l&#39;oxygénation du sang. D&#39;autre part, l&#39;estimation de la pression partielle d&#39;oxygène (pO2) à base d&#39;oxygène-dépendant trempe de phosphorescence ne doit pas être significativement affectée par les changements dans les paramètres optiques du tissu et fournit une mesure absolue de la pO2. Systèmes expérimentaux qui utilisent l&#39;oxygène des colorants sensibles ont été démontrées dans des études in vivo des tissus perfusés ainsi que de surveillance de la teneur en oxygène dans les cultures de tissus, montrant que la phosphorescence de trempe est une technologie puissante capable d&#39;imagerie oxygène précis dans le physiologiques pO2 gamme. Ici nous démontrons avec deux différentes modalités d&#39;imagerie comment effectuer la mesure de la pO2 dans le système vasculaire corticale basée sur l&#39;imagerie à vie de phosphorescence. Dans la première démonstration, nous présentons l&#39;imagerie grand champ de vue de la pO2 à la surface corticale de rat. Cette modalité d&#39;imagerie a relativement simple dispositif expérimental basé sur une caméra CCD et un laser pulsé vert. Un exemple de suivi de la dépression corticale propagation basé sur la durée de vie de phosphorescence d&#39;un colorant R3 Oxyphor a été présenté. En deuxième démonstration, nous présentons une haute résolution à deux photons pO2 imagerie vasculaire micro corticale de souris. Le montage expérimental comprend une coutume construit deux photons microscope avec un laser femtoseconde, modulateur électro-optique, et de comptage de photons tube photomultiplicateur. Nous présentons un exemple de l&#39;imagerie de l&#39;hétérogénéité pO2 dans la microvascularisation corticale notamment capillaires, utilisant un nouveau PTP-C343 colorant avec améliorée 2-photons section transversale d&#39;excitation. Cliquez ici pour voir l&#39;article connexe <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Synthèse et d&#39;étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l&#39;imagerie oxygène dans les systèmes biologiques.</a>

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Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Nous présentons une procédure expérimentale pour mesurer la pression partielle d&#39;oxygène (pO2) dans le système vasculaire cérébrale à base d&#39;oxygène-dépendant trempe de phosphorescence. La préparation des animaux et des procédures d&#39;imagerie ont été décrites pour les deux grand champ de vue CCD à base d&#39;imagerie de pO2 chez le rat et l&#39;imagerie 2-photons d&#39;excitation basée sur pO2 chez la souris.

Mesure cérébrale oxygénation sanguine à base d&#39;oxygène-dépendant trempe de phosphorescence

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K vues.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Nous présentons une procédure expérimentale pour mesurer la pression partielle d'oxygène (pO2) dans le système vasculaire cérébrale à base d'oxygène-dépendant trempe de phosphorescence. La préparation des animaux et des procédures d'imagerie ont été décrites pour les deux grand champ de vue CCD à base d'imagerie de pO2 chez le rat et l'imagerie 2-photons d'excitation basée sur pO2 chez la souris.

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Recherche

Neurosciences

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modèle de Rat de doux Hypoperfusion intra-utérine avec sténose de le Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Effets de neurotraumatologie induite par le souffle sur les rongeurs sous pression du milieu des artères cérébrales

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Modèle d'injection de joues pour la mesure simultanée de la douleur et des comportements liés aux démangeaisons

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Cartographie du flux sanguin cérébral et des champs électriques : placement d’électrodes chez la souris

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

Pleins feux sur l’auteur : Approche basée sur la stimulation pour améliorer le flux sanguin cérébral dans le modèle de la maladie d’Alzheimer 

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

Mise en place d’électrodes de stimulation extracrânienne et mesure du débit sanguin cérébral et des champs électriques intracrâniens chez des souris anesthésiées

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...