Nous reconnaissons le soutien de la Chimie, Géosciences et Biosciences Division, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie, Bureau de la science, US Department of Energy (numéro de la subvention DE-FG02-91ER20021) et la National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Nous sommes reconnaissants à Mme Karen Bird pour l&#39;édition du manuscrit.

1. EMS traitement Graines d&#39;Arabidopsis thaliana sont mutagenèse utilisant comme agent de mutagène méthanesulfonate d&#39;éthyle (EMS) 3,4, ce qui induit dans le génome de C-à-T changements qui en résultent en C / G à T / A mutations 5-7. <ol><li> Peser 0,8 g de graines d&#39;Arabidopsis (~ 40,000 graines) portant le marqueur fluorescent organite (plus précisément, dans cette étude ssGFPHDEL (séquence signal-GFP-HDEL tétrapeptide) a été utilisée comme un marqueur ER). </li><li> Transférer les graines dans un tube de 50 ml faucon, puis ajouter 25 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Ajouter 0,2% (v / v) méthanesulfonate d&#39;éthyle. </li><li> Incuber pendant 16 heures sur nutation mélangeur à basse vitesse. </li><li> Aspirer le liquide et jetez-le dans un flacon contenant 1,0 M de NaOH pour inactiver l&#39;EMS. </li><li> Ajouter 25 ml d&#39;eau dans le tube Falcon contenant les graines, à proximité, et inverser 5 fois pour se laver les graines et attendre jusqu&#39;à ce que toutes les graines se sont installés, puis aspirer l&#39;eau et jetez dans la Na 1,0 M<html> OH ballon. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage jusqu&#39;à 10 fois. </li><li> Après le lavage final, remettre en suspension les graines dans une quantité minimale d&#39;eau. </li><li> Passez à la stérilisation des semences en ajoutant 25 ml d&#39;eau de Javel à 10%, agiter vigoureusement pendant 30 s. Laissez les graines se déposent au fond, versez l&#39;eau de Javel et rincer avec 25 mL d&#39;eau stérile. Décanter l&#39;eau stérile et ajouter 25 ml d&#39;éthanol 70%. Agiter les tubes pendant 30 s. Laissez les graines se déposent au fond. Décanter l&#39;éthanol et rincer avec 25 mL d&#39;eau stérile. Répéter deux fois le lavage à l&#39;eau stérile, puis versez les graines dans un plat de Petri en plastique contenant 3 mm de papier filtre et laisser sécher sous le capot. Conserver à 4 ° C pendant 2 jours. </li><li> Plaque des graines sur ½ MS Phytagel (concentration de la moitié de milieu de Murashige et Skoog), de 150 mm boîte de Pétri (environ 250-300 graines pour la plaque). </li><li> Cultiver des graines M1 sur la plaque pendant 2 semaines, puis transplanter dans le sol. </li><li> Ramassez les graines M2 à partir de plantes individuelles pour générer des lignes M1 M2 (1000 lignes indépendantes). </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. dépistage confocale des populations M2 et M3 Dans cette section, nous décrivons l&#39;observation des plants avec un microscope confocal ou de fluorescence, comme décrit précédemment 8. <ol><li> Soixante graines de chaque ligne M2 sont cultivés pendant 7 à 10 jours sur des boîtes de Pétri en plastique, ½ MS Phytagel; sur la même plaque sont également cultivés 5 plants EMS-non traité (témoin). </li><li> Cinq à dix cotylédons sont montés avec le côté abaxial vers l&#39;objectif (40X) sur une lame de microscope et clos, avec une lamelle. </li><li> Chaque cotylédon est observé, à partir de la corticale dans la région médiane, en vertu de la fluorescence pour toute modification de la répartition subcellulaire du marqueur organite. </li><li> Plantes positives sont transplantées dans le sol et leurs graines sont récoltées et projeté à nouveau pour confirmer le phénotype mutant dans la génération M3. </li><li> Retirez les au moins trois mutations de fond contaminantes par rétrocroisement fois à un génome de type sauvage peut containing le marqueur fluorescent organite désirée. <ol><li> De la plante mère, aide de ciseaux fins ou des pinces retirer siliques matures, et les fleurs ouvertes. </li><li> Retirez les bourgeons qui sont trop petits à partir du méristème. </li><li> Insérer la pointe d&#39;une paire de pince entre pétales et sépales d&#39;ouvrir un bourgeon de fleur et de supprimer toutes les anthères. </li><li> En utilisant une paire de pince prendre une fleur ouverte maturité de la plante père et se frotter les anthères sur le stigmate de la plante émasculée. </li></ol></li></ol> 3. Cartographie Cette section décrit essentiellement comment mapper une mutation récessive utilisant un protocole modifié de Borevitz 9 qui est plus rapide si on le compare aux méthodes traditionnelles de cartographie 10,11. Cette approche utiliser des tableaux d&#39;oligonucléotides à haute densité avec la capacité de détecter de nombreux polymorphismes métrages simples (SFP) dans un seul essai 12. Utilisation de l&#39;Arabidopsis GeneChip tableau ATH1 est possible ded&#39;analyser environ 24.000 gènes. Un pool d&#39;individus F 2 montrant la mutation est comparé à un bassin de type sauvage plantes F 2 recueillies au sein de la même population en ségrégation. Ensuite, la mutation sera mappé dans la région où la piscine mutant est enrichi pour les allèles mutants génotype et par conséquent dans la même région de la piscine de type sauvage se traduira enrichi pour les allèles des parents de type sauvage 13. <ol><li> L&#39;ADN génomique (3 ug) est extraite de la homozygote mutant Britannique (M3) en utilisant un Qiagen DNeasy Plant Mini Kit et est soumis à Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 séquençage. </li><li> Le mutant homozygote-Britannique (M3) est croisé avec Landsberg erecta pour générer une population de cartographie. </li><li> Le mappage est effectuée sur 70 jusqu&#39;à 100 individus F2 présentant le phénotype aberrante et le même nombre de plantes F2 avec un phénotype de type sauvage. </li><li> Recueillir de chaque plante un disque feuilles (0,60 mm) en utilisant une perforatrice. Ladisque de feuille doivent être collectées à partir des feuilles du même âge pour être sûr d&#39;avoir des quantités similaires de l&#39;ADN. Les échantillons peuvent être traités pour l&#39;extraction de génomique séparément ou en groupes. Dans ce cas, il est possible de prélever des échantillons 5-10 pour chaque tube Eppendorf de sorte que dans la fin, vous aurez moins de tubes eppendorf à partir de laquelle l&#39;ADN génomique doit être extraite. </li><li> MasterPure usine de purification de l&#39;ADN Feuille Kit (Epicentre) est utilisé pour extraire l&#39;ADN génomique. L&#39;ADN génomique obtenu à partir de chaque échantillon est quantifié avec un NanoDrop. </li><li> La même quantité d&#39;ADN génomique à partir de chaque échantillon est ensuite mis en place pour un total de 300 ng (~ 30 pi) d&#39;ADN de plantes; ajouter 60 ul 2.5X solution aléatoire amorces [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM de 2-mercaptoéthanol, 750 ug / ml amorces oligodé (octamères aléatoires)] (Bioprime kit) et 42 pi d&#39;eau (volume final 132 pi). </li><li> ADN dénaturer à&gt; 95 ° C pendant 5 à 10 min. </li><li> Laisser refroidir sur glace. </li><li> Pour chaque denatuADN rouge ajouter 15 pL mélange avec de la biotine 10X dNTP dCTP [1 mM biotine-14-dCTP, 1 mM de dCTP, 2 mM de dATP, 2 mM de dGTP, 2 mM de dTTP dans 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), et compléter avec 3 polymérase de Klenow ul (kit Bioprime). </li><li> Incuber une nuit à 25 ° C. </li><li> Le lendemain, ajouter 15 ul de NaOAc 3 M et 400 ul froide EtOH à 100%; mélange. </li><li> Incuber à -80 ° C pendant 1 heure, puis tourner à 20500 xg pendant 15 min, retirer le surnageant et laver avec 500 ul EtOH 75% froid. </li><li> Centrifuger à 20500 xg pendant 10 min. </li><li> Culots d&#39;ADN sec à 37 ° C pendant 10 min et remettre en suspension dans 100 pi d&#39;eau. </li><li> Utilisez 5 pi pour vérifier le rendement et la qualité sur un gel (Figure 2). </li><li> Envoyer 95 uL de l&#39;étiquetage de réaction pour le type sauvage et mutant d&#39;Arabidopsis pour GeneChip hybridation ATH1 tableau génome. </li><li> Les tableaux sont numérisées et les fichiers. CEL obtenus sont analysés en utilisant le logiciel R ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>RG /). </li><li> Installez le logiciel R, puis ouvrez le programme et coller la chaîne suivante: la source (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () Ensuite, appuyez sur la touche retour-ce va installer les paquets standards (Bioconductor <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> Dans un nouveau dossier sur votre bureau, télécharger à partir du site Web suivant ( <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) les fichiers: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip Le ColLerCEL.zip fichier doit être déballé et les fichiers résultants collé dans votre nouveau dossier. </li><li> Renommez les données obtenues à partir de votre expérience en GeneChip wildtype.CEL et mutant.CEL. </li><li> Copiez maintenant vos données GeneChip (wildtype.CEL etmutant.CEL) dans votre dossier. </li><li> Ouvert R, a) pour Mac: cliquez sur &quot;Divers&quot;, puis cliquez sur &quot;Changer le répertoire de travail.&quot; b) pour PC: cliquez sur &quot;Fichier&quot; puis &quot;Changer le répertoire&quot; </li><li> a) pour Mac: Sélectionnez le dossier contenant les fichiers. Cliquez sur &quot;Espace de travail», «espace de travail du fichier Charger&quot; et sélectionnez ath1V5.RData, b) pour PC: Sélectionnez le dossier contenant les fichiers ci-dessus, cliquez sur «Fichier», puis «espace de travail de charge&quot; et sélectionnez ath1V5.RData. </li><li> ReadCEL.R Ouvrir avec Notepad et copier l&#39;ensemble du texte à R. </li><li> SFP.R Ouvrir avec Notepad et copier l&#39;ensemble du texte à R. </li><li> Map.R Ouvrir avec Notepad et copier l&#39;ensemble du texte à R. </li><li> Dans la fenêtre de la console, vous verrez le message suivant: Chromosome X limite Mb yz Gènes de la recherche à TAIR coller dans ce lien 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; Fin = z </li><li> Copiez et collez le lien dans votre navigateur Internet. Une fenêtre apparaîtra et demander d&#39;ouvrir ou enregistrer le fichier, vous devez sélectionner sauver. Choisir un nom de fichier et joindre l&#39;extension &quot;. Xls&quot;, puis cliquez sur Enregistrer. </li><li> Ouvrez le fichier &quot;. Xls&quot; où vous pouvez trouver les coordonnées de votre mutant (le résultat est représenté graphiquement dans la figure 3). </li><li> Dans la zone cartographiée dans le Illumina assemblé lit du génome mutant identifier des transitions EMS 4 parmi les polymorphismes de nucléotides simples. Compléter le phénotype mutant par transformation avec le gène de type sauvage (s) en utilisant des procédures standard 15. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La figure 1 montre l&#39;approche utilisée pour l&#39;identification d&#39;un mutant de la voie de sécrétion en utilisant la microscopie confocale de dépistage. La figure 2 montre une préparation typique de l&#39;ADN génomique marqué pour l&#39;hybridation tableau. Dans la figure 3, un résultat typique attendue après l&#39;analyse des données obtenues à partir de la baie de GeneChip Arabidopsis Genome ATH1 est présenté. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> Figure 1. Arabidopsis plantes transgéniques exprimant ssGFPHDEL (ER marqueur) (1) ont été cultivées pour produire assez de semences pour l&#39;EMS de traitement (2). Les semences traitées avec EMS ont été ensuite semées pour générer des plantes M1 (3). Chaque plante M1 représente une ligne différente et des semences ont été recueillies séparément de chacun d&#39;eux. Graines M2 ont été étalées sur ½ MS substrat (4), puis criblée de défauts dans la morphologie ER par microscopie confocale (5). Pendant la projection, nous avons trouvé des plantes qui a conservé la morphologie de type sauvage ER (6) et les plantes qui montrent défectueux phénotypes ER (7). Ces plantes ont été cultivées pour obtenir la génération M3 et de confirmer le phénotype (8). L&#39;ADN génomique de la plante M3 a été utilisé pour le séquençage Illumina Solexa (a). La même plantea également été utilisée pour des croisements avec Ler-poids pour obtenir la population de cartographie F2 (b). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> Figure 2. Bioprime réactions de marquage aléatoire (5 pi de 100 ul) ont été chargés sur un gel d&#39;agarose 1%. Lane a est à partir d&#39;un pool de plantes de type sauvage F2, et la voie b est à partir d&#39;un pool de mutants plantes F2. (Marker est de 1 Kb d&#39;ADN en échelle N3232, à partir de l&#39;ONÉ). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> Figure 3. La figure représente un exemple de la cartographie du Col-0 mutation en utilisant Arabidopsis GeneChip ATH1 hybridation génomique Array. La mutation dans cet exemple est situé sur le chromosome 1 délimité, par des barres verticales. Les barres horizontales représentent les seuils de détection.

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	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. 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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ici, nous décrit une microscopie confocale d&#39;un dépistage pour l&#39;identification des mutants endomembranaire. Cette approche peut être facilement étendu pour d&#39;autres organites de la cellule pour laquelle des marqueurs spécifiques de protéines fluorescentes sont disponibles. L&#39;écran est basée sur l&#39;identification de mutants qui montrent une répartition aberrante du marqueur fluorescent, soit dans l&#39;organite cible ou à organites qui ne sont pas censé contenir le marqueur. Respectivement,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sulfonate éthylméthane </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog basales moyennes w Gamborg vitamines </td><td> Phyto technolog Laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1 kg </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Maître pur de feuille d&#39;usine de purification de l&#39;ADN kit </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime système d&#39;étiquetage d&#39;ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Alcool 200 Proof </td><td> Decan laboratoires inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> ATH1 Arabidopsis Gene pucetableau génome </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Tubes Falcon 50 ml </td><td> Corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Tubes Eppendorf de 1,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le papier-filtre 90mm </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Balance analytique </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> na </td></tr><tr><td> Nutation (vague) agitateur </td><td> Heidolph POLYMAX 1040 </td><td> na </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> na </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

Ce protocole décrit une microscope à fluorescence sur le dépistage des plants d&#39;Arabidopsis et décrit comment cartographier des mutations récessives qui modifient la distribution subcellulaire d&#39;un marqueur fluorescent spécifique marqué dans la voie de sécrétion. Arabidopsis est un puissant modèle biologique pour les études génétiques en raison de sa taille du génome, temps de génération, et la conservation des mécanismes moléculaires chez les royaumes. Le tableau génotypage comme une approche à la carte de la mutation en alternative à la méthode traditionnelle basée sur des marqueurs moléculaires est avantageuse car elle est relativement rapide et peut permettre à la cartographie de plusieurs mutants dans un laps de temps très court. Cette méthode permet l&#39;identification des protéines qui peuvent influer sur l&#39;intégrité de tout organite dans les plantes. Ici, comme un exemple, nous proposons un écran pour cartographier les gènes importants pour l&#39;intégrité du réticulum endoplasmique (RE). Notre approche, toutefois, peut être facilement étendu à d&#39;autres organites des cellules végétales(Voir par exemple 1,2), et représente donc une étape importante vers la compréhension de la base moléculaire qui régit d&#39;autres structures subcellulaires.

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l&#39;identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l&#39;intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

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12.2K vues.  Michigan State University. Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Recherche

Biologie

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

En utilisant l&#39;ARN médiée par la stratégie d&#39;alimentation interférences à l&#39;écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactome-Seq : Un protocole pour la Construction de la bibliothèque de Domainome, de Validation et de sélection par Phage Display et de prochaine génération séquençage

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...