Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Knut et Alice Wallenberg fondation. Les états-majors entiers des centres de l&#39;homme Atlas des protéines à Uppsala, Stockholm et l&#39;Inde sont reconnus pour leurs efforts visant à générer de l&#39;Atlas des protéines humaines. Les auteurs tiennent à remercier tout particulièrement Frank Hammar et Sofie Gustafsson de l&#39;aide pour les photos et Elene Karlberg d&#39;aide à la production TMA lors du tournage.

1. Comment préparer les tissus pour la production de puces à ADN de tissus (Animation 1) <ol><li> Sélectionnez du matériel pertinent pour le formol de paraffine fixe intégré (échantillons de tissus ou de cellules), y compris la section hématoxyline tissu correspondant teinté. </li><li> Marquez domaine pertinent sur la coupe de tissu. Il est recommandé d&#39;avoir une section teinté fraîchement coupé hématoxyline correspondant au bloc de paraffine. </li><li> Concevoir le modèle utilisé pour la production de TMA. Randomize les échantillons dans le modèle pour éviter les artefacts causés par des problèmes techniques tels que la couverture de l&#39;anticorps sur toute la section TMA et les problèmes de sectionnement. Ajouter des marqueurs d&#39;orientation supplémentaires pour le modèle de l&#39;orientation. </li><li> Organiser les tissus en fonction du modèle. </li></ol> 2. Manuel de production de puces à ADN de tissus (Essentiel pour le tournage) <ol><li> Pour être en mesure d&#39;obtenir une longueur standardisée des carottes de tissu, marquez le stylet par exemple 4,5 mm (figure 2). Guidelines pour l&#39;espacement entre les centres de l&#39;échantillon: la taille du noyau 0.6 mm - 0,8-1,0 mm de base de taille de 1,0 mm - 1,8 à 2,0 mm la taille du noyau 1,5 mm - 2,0 à 3,0 mm de base de taille 2,0 mm - 2,5-4,0 mm Il est recommandé de laisser des marges 2,5-3,0 mm de chaque côté du bloc de paraffine pour éviter la fissuration de la paraffine. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montez les poinçons sélectionnés pour être utilisés. Commencez par desserrer les vis à six pans creux qui détient le poinçon en place. Le poinçon est correctement positionné lorsque la rainure dans le moyeu de perforation est fermement placé contre la tige métallique dans la matière plastique v-bloc. Serrez les vis et assurez-vous que le bord de la pince en métal est horizontale. </li><li> Le poinçon destinataire (marquées en vert et rouge, spécifique pour le distributeur) doit être placé à la gauche. Le poinçon donneur (en vert et bleu, spécifique pour le distributeur), qui a un diamètre légèrement plus grand, doit être placé à la droite (figure 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Déplacez les poinçons sur les axes x et y les axes en utilisant les boutons de réglage XY. Le bouton de réglage de droite déplace les poinçons long de l&#39;axe x et le bouton de réglage gauche déplace le long des poinçons de l&#39;axe y. Il ya une lecture micromètre numérique sur les deux boutons de réglage. Elles sont activées lors du déplacement des boutons. </li><li> Réinitialiser → appuyez sur la touche ZERO / ABS. Basculer entre les pouces et mm → appuyez sur la touche IN / mm. L&#39;espace entre les trous doivent être de 2,0 mm (mesurée entre les centres des trous) lors de l&#39;utilisation d&#39;un poinçon 1 mm pour une matrice 9x8. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Pour vous assurer que vous ne poussez pas le punch trop bas dans le bloc, frapper et de détruire la cassette du punch, mis une cassette sans paraffine dans le support et régler la position inférieure du poinçon destinataire de 1 mm au-dessus du fond de la cassette à l&#39;aide de la vis de butée de profondeur à ladans le coin supérieur gauche de la Z-guide (Figure 3). </li><li> Mettez le bloc receveur dans le support et utiliser le plus petit tournevis pour fixer les vis. Ne serrez pas les vis pour serré ou la paraffine peut se détacher de la cassette. </li><li> Poussez le poinçon destinataire à la baisse d&#39;environ 5 mm dans le bloc receveur et utilisez la poignée dans le poinçon pour faire tourner le poinçon avant et en arrière une fois (figure 3). Le trou sera de 5 mm de profondeur lorsque l&#39;on pousse le poinçon aussi loin dans le bloc que possible. </li><li> Relâcher la pression à la baisse en la poussant lentement, de sorte que les ressorts peuvent se déplacer le poinçon vers le haut. Utilisez le stylet pour vider le poinçon et jeter le noyau de la paraffine. </li></ol></li><li> Déplacer la tourelle pour passer pour le donneur (Figure 3) coup de poing. </li><li> Placer le pont bloc donneur avec le bloc donneur sur le support de sabot de destinataire (figure 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Poussez la ponction des bailleurs de fondsh dans la zone sélectionnée du bloc donneur. Utilisez un correspondant hématoxyline et l&#39;éosine lame colorée où la région d&#39;intérêt a été marquée pour localiser le tissu qui doit être échantillonné. Manuellement tenir le bloc donneur en position avec votre main gauche et poussez le coup de poing avec votre main droite. Notez que vous ne devriez pas appuyer sur le stylet. La butée de profondeur ne bloque pas le mouvement coup de poing à la bonne position pour le bloc donneur, il est donc important que vous arrêtez de pousser quand la seconde marque est visible sur le stylet. </li><li> Tournez la poignée sur le poinçon une fois (figure 3). Relâchez doucement la pression à la baisse tout en maintenant le bloc donneur sur le pont bloc donneur. </li><li> Le tissu du donneur est de préférence perforée 0,5 mm plus courte que le noyau destinataire. Ce processus permettra d&#39;assurer un alignement réglable des cœurs sur la surface du bloc destinataire, en évitant la perte de tissu représentant précieuse. </li></ol></li><li> Retirer le pont et le bloc donneur. Faireassurer que le poinçon donneur est aligné avec le trou qui a été faite plus (point 4). Vous devez ajuster la position de perforation à l&#39;aide des vis de réglage si le poinçon des bailleurs de fonds et le trou dans le bloc receveur ne sont pas alignés. </li><li> Poussez délicatement le poinçon vers le bas jusqu&#39;à son extrémité atteint le sommet du trou dans le bloc receveur. Tout en maintenant cette position, utilisez le stylet pour vider le coeur des tissus dans le trou. La surface de base doit être en alignement avec la surface du bloc. </li><li> Déplacez le tourelle arrière à l&#39;emporte-pièce destinataire. </li><li> Déplacement à la position suivante avec les boutons de réglage XY. </li><li> Répéter de point 4c ci-dessus jusqu&#39;à ce que le tableau est complet. </li><li> Lorsque le bloc receveur tout est fini, desserrez les vis dans le support de bloc receveur. Cuire le bloc en 42 ° C pendant 40 minutes. Mettez le bloc avec la zone de coupe vers le bas sur une lame de verre. Placer la lame de verre avec le bloc au-dessus d&#39;un porte-tube à essai (ou autre construction appropriée) et le lieu de til four. Après la cuisson, retirez le support de tube à essai du four et aplatir la surface du bloc par caresser doucement la lame de verre. </li><li> Placez le bloc avec la lame de verre sur une plaque de refroidissement pendant 10 minutes. Pour assurer le tissu représentant tout au long de la TMA d&#39;un contrôle de qualité sur chaque section du 50 e est effectuée. </li></ol> 3. Comment TMA Section (Animation 2) <ol><li> Couper 4 tranches épaisses um en utilisant un microtome avec système de transfert de l&#39;article (HM 355S, Microm). Le système peut être utilisé avec tous les tomes actuelles rotatives. Le système se compose d&#39;un porte-lame avec le pont de transfert intégré, un bain d&#39;eau chauffée et une unité de commande. De la lame les sections glissent sur la surface de transfert par voie humide par l&#39;intermédiaire d&#39;un pont de transfert dans le bain d&#39;eau. </li><li> Les sections doivent être prises à partir du bain d&#39;eau immédiatement après qu&#39;ils ont tendu, pour éviter la fusion des taches des tissus sensibles (p. ex tissus lipidiques riches comme ceux du sein et du cerveau). PlaCE de la section sur une lame de verre SuperFrost. Le temps des sections peuvent être laissés dans l&#39;eau dépend du type de paraffiné utilisé et la température de l&#39;eau. Le cire de paraffine laboratoire utilisation de produits Histolab AB, qui ont un point de fusion de 56-58 ° C et il est recommandé une température de bain d&#39;eau de 37-39 ° C. </li><li> Placer les lames dans un support de diapositives pour le séchage à température ambiante (RT) pendant la nuit. </li><li> Les lames sont cuits à 50 ° C pendant 12-24 heures. L&#39;utilisation d&#39;un Microtom sans STS que vous avez à transporter la section de la lame d&#39;un bain d&#39;eau manuellement en utilisant par exemple une brosse. </li></ol> 4. Test et la méthode de titrage pour l&#39;immunohistochimie (Animation 3) Chaque anticorps est soumis à une procédure d&#39;essai normalisée en utilisant spécialement conçus TMA contenant un mélange de tissus et types cellulaires différents. L&#39;objectif est d&#39;évaluer un protocole immunomarquage individuelle et optimisée pour chaque anticorps. Initialement une dilution, sur la base de fourmisla concentration de stock iBODY de l&#39;anticorps primaire est testé. Le résultat de cette coloration test est utilisé pour guider d&#39;autres dilutions et d&#39;optimisation du protocole. <ol><li> Déparaffinage et l&#39;hydratation dans de l&#39;éthanol et le xylène graduée à l&#39;eau distillée sont effectués avant l &#39;immunomarquage. </li><li> Un gradin de blocage pour étancher peroxydase endogène est réalisée dans 0,3% de H 2 O 2 dans de l&#39;éthanol à 95% pendant 5 minutes. </li><li> La chaleur épitope (HIER) est réalisée dans un tampon pH d&#39;extraction 6, en utilisant une chaudière à pression (chambre de révèler, Biocare médical) comme source de chaleur pendant 4 minutes à 125 ° C. Après rempli d&#39;ébullition, les lames restent dans la chaudière de pression et on laisse refroidir à 90 ° C. Le temps de traitement total pour HIER est d&#39;environ 45 minutes. </li><li> Si aucun résultat concluant n&#39;a pas obtenu lors du test initial, d&#39;autres tests sont effectués sur la base du schéma de coloration observée 5 6. Une étude pilote, au sein de l&#39;HPA haut débit mis en place, a montréque la récupération d&#39;antigène très utile lorsque HIER pH 6, mais d&#39;autres méthodes de récupération tels que la pré-incubation avec la protéinase, micro-ondes et d&#39;ébullition dans un tampon avec un pH supérieur ou inférieur peuvent bien sûr être utilisé. En changeant la condition, par exemple IHC changer les temps d&#39;incubation d&#39;anticorps, les dilutions d&#39;anticorps et les temps d&#39;incubation diaminobenzidine (DAB) le schéma de coloration peut donner des résultats plus concluants. </li></ol> 5. Programme de coloration, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Toutes les incubations sont réalisées à température ambiante et ce protocole peut également être utilisé en tant que configuration manuelle avec les mêmes réactifs. <ol><li> Rincer dans un tampon de lavage. </li><li> Incubation avec V bloc Ultra pendant 5 minutes. </li><li> Rincer dans un tampon de lavage. </li><li> L&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire pendant 30 minutes. </li><li> Rincer à l&#39;un tampon de lavage (x2). </li><li> L&#39;incubation avec la peroxydase de raifort marquée-polymère pendant 30 minutes. </li><li> Rincer à l&#39;un tampon de lavage (x2). </li><li> Développer en solution DABpendant 10 minutes. </li><li> Rincer à l&#39;un tampon de lavage (x2). </li><li> Coloration de contraste dans Mayers hématoxyline pendant 5 minutes *. Lorsque vous utilisez une méthode de coloration progressive (par exemple Mayers hématoxyline) l&#39;intensité dépend du temps et pas de différenciation est nécessaire. Une coloration par exemple la méthode régressive hématoxyline de Harris nécessite la différenciation d&#39;enlever l&#39;excédent de teinture de tissus afin d&#39;accentuer une structure. </li><li> Rincer à l&#39;eau du robinet *. </li><li> Rincer à l&#39;eau du carbonate de lithium, dilué à 1:5 de la solution saturée pendant 1 minute *. </li><li> Rincer à l&#39;eau du robinet pendant 5 minutes *. </li><li> Les lames sont déshydratées dans de l&#39;éthanol gradué et les lames sont recouvertes (PERTEX, Histolab) </li></ol> Tous les réactifs sont appliqués à un volume de 300 ul par diapositive. * Les étapes 10-14 sont fait dans un instrument histostaining (Autostainer XL, Leica) et de lamelles de protection est en outre fait dans un système de lamelles (lamelles de verre automatisé CV5030, Leica). 6. Comment numériserune diapositive Procédé de lames de balayage est dépendante de la Scanner numérique étant utilisé, ce protocole définit seulement à numériser une diapositive à l&#39;aide du système de balayage automatique Aperio XT (Aperio Technologies). Dans l&#39;atlas des protéines humaines configuration 20x pour le tissu et 40x pour les cellules sont utilisées. Analyse automatisée pourrait se heurter à des problèmes de focus en raison de l&#39;hétérogénéité du tissu et le nombre de tissus différents inclus dans une TMA. <ol><li> Nettoyez la lame de verre de la saleté, de la colle et vérifiez de bulles d&#39;air entre la lamelle et la section. En cas de bulles d&#39;air remonter la diapositive. </li><li> Mettre la lame dans un rack et placez la grille dans le scanner numérique. Le temps de balayer une TMA à un grossissement de 20x est d&#39;environ 6 minutes. Un logiciel de Aperio est utilisé pour sélectionner la zone d&#39;intérêt. Sélection du collimateur de mise au point se fait automatiquement dans le logiciel. Manuellement la sélection de la zone de numérisation et des points de discussion est également possible. </li><li> Après l&#39;image de hcomme on l&#39;a produite, elle peut être utilisée pour l&#39;évaluation et l&#39;annotation de la coloration IHC. Les images restent dans un fichier résultat de l&#39;expérience et peut être distribué à ses collègues pour les discussions et en outre utilisé pour la publication des données. Les images peuvent être visualisées dans un logiciel disponible gratuitement sur Aperio. </li></ol> 7. Comment faire pour rechercher votre protéine favorite dans l&#39;Atlas des protéines humaines <ol><li> Parcourir pour <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Entrez le nom de votre protéine favorite, Ensembl id, numéro d&#39;accession ou de l&#39;insuline UniProt HGNC par exemple le nom. </li><li> Accédez à la page sommaire et défiler vers le bas pour les tissus normaux et le résumé d&#39;organes. La vue d&#39;ensemble montre l&#39;expression de protéines dans le pancréas. </li><li> Cliquez sur &quot;des données des tissus plus&quot;. Vous entrez dans les tissus normaux voir où vous pouvez voir tous les tissus inclus triés par organe. </li><li> Cliquez sur le pancréas pour afficher les résultats IHC pour 3 anticorps dirigés contre la même protéine. Pour voir un salutgh-résolution d&#39;image de clic sur l&#39;image du pancréas. </li><li> Des informations supplémentaires sur l&#39;expression des protéines dans les tissus cancéreux, les cellules et les données de validation supplémentaires au sein de l&#39;Atlas des protéines humaines peuvent être trouvées en naviguant sur le site Web de la protéine humaine de l&#39;Atlas. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Animation 1. Comment préparer les tissus pour la production de tissu microarray. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir Animation 1</a> . Animation 2. Comment TMA section. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir Animation 2</a> . Animation 3. La technique immunohistochimique est décrite. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir l&#39;animation 3</a> .<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme d&#39;ensemble du processus au sein de la protéine humaine Atlas Uppsala. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Stylet donateurs figure 2. Marquée pour la longueur normalisée de carottes de tissu, par exemple 4,5 mm. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figure 3. Microarrayer tissus Manuel. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figure 4. Exemples de qualité différente des TMA produites. (A) une. Droite et bien alignée TMA avec un espace suffisant entre les rangées et les colonnes ainsi que vers le bord de la paraffine (B) Une TMA avec quelques-uns des noyaux trop près du bord entraînant des difficultés de probables lorsque la coupe. (C) Une TMA qui ont été cuits pour too à long entraînant une effondré TMA sans le modèle correct. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figure 5. Hématoxyline et éosine TMA colorées. (A) une section de coupe avec correctement colonnes droites et alignés et de rangées. Utilisation d&#39;une lame mauvaise ou sale peut entraîner de fendage (B) ou des sections comprimées (C). <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figure 6. Titrage des anticorps. (A) la réaction des cellules dans les ganglions du centre montre un anticorps de façon optimale titré résultant en une coloration cytoplasmique spécifique (en brun), sans arrière-plan. (B) La coupe de tissu montre une faible coloration. Coloration négative ou faible est constaté lorsque la concentration de l&#39;anticorps primaire est trop faible ou si la protéine cible n&#39;est pas présente dans les tissus immunocolorées. (C) La section des tissus est due à l&#39;utilisation overstained de concentration trop élevée de l&#39;anticorps primaire. Le ddes résultats couleur arche difficultés à déterminer la localisation subcellulaire en raison de déborder, traverser la réactivité et la fausse positivité.

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

L&#39;immunohistochimie est de loin l&#39;application la plus couramment utilisée pour les TMA. La combinaison de l&#39;IHC et de TMA peut être utilisé dans plusieurs contextes différents, par exemple, criblage à haut débit des profils d&#39;expression de protéines dans les tissus et les cellules 7 8 9 10, les études de découverte de biomarqueurs basés sur des échantillons de tissus provenant de grandes cohortes de patients 11 12 et plus la biologie des tumeurs de base études, y compris différents phénotypes et génotypes, les étapes de différenciation, la progression et les métastases 13. Un avantage de l&#39;utilisation de TMA est que le matériel de grandes cohortes peuvent être analysés en même temps, les deux expériences réaliser des économies appréciables de matériel biologique et d&#39;assurer plus reproductibles. En outre, l&#39;utilisation de la technologie TMA permet d&#39;économiser sur les coûts de réactif et le temps de traitement de laboratoire. Comme une TMA ne contient qu&#39;une quantité limitée de tissu, l&#39;hétérogénéité des tissus est un problème. Selon le type de tissu et les questions à traiter, plusieurs échantillons peuvent être nécessaires de la même specimen. Pour les tissus tumoraux, l&#39;utilisation de deux à quatre cœurs de chaque spécimen est recommandé car il a été démontré que dans un degré élevé de précision dans la représentation des coupes de tissus entiers 13 14. Composition selon le tissu du diamètre des poinçons (allant de 0,6 mm à 2 mm) peut être ajustée. Les tissus sont complexes et composés de deux types différents de cellules plusieurs, des structures et de la matrice extra-cellulaire. La composition de chaque type de tissu différent contenant quantité variable de graisse, les vaisseaux sanguins, des tissus conjonctifs, des cartilages, etc, vont affecter la pression nécessaire pour le poinçonnage et la collecte des noyaux distincts. Il est donc d&#39;une importance de pratiquer toutes les étapes de la procédure sur le matériel qui n&#39;est pas de n&#39;importe quelle valeur, avant de produire un TMA avec les tissus définis pour les expériences destinées. Lorsque la coupe une variété de tissus différents dans un seul bloc TMA la composition du bloc pourrait influer sur la capacité d&#39;acquérir des articles de haute qualité. Cetissus rtains, la peau, par exemple, la moelle osseuse, les graisses, le cerveau et du sein, de rendre la coupe du bloc de TMA difficile en raison de l&#39;effet des différences de texture effectuant la façon dont les sections s&#39;étendent dans le bain d&#39;eau et comment dureté différente est coupé par la lame etc Il est donc recommandé pour les tissus de groupe avec des caractéristiques similaires, par exemple les tissus riches en lipides dans une TMA, le cas échéant. La majorité des tissus cancéreux sont en ce sens homogène, ce qui facilite la coupe de la TMA de cancer. Une autre méthode de sectionnement pour stabiliser les noyaux biopuces peuvent être utilisés lors de la manipulation d&#39;un TMA avec des types hétérogènes de tissus. L&#39;utilisation d&#39;un ruban adhésif peut être utile pour éviter la perte de noyaux et l&#39;automne-out dans la coupe TMA. L&#39;utilisation de ruban adhésif doit être utilisé avec prudence, puisque la bande peuvent influer sur l&#39;épaisseur des noyaux sectionnés et par la suite aussi le résultat de la coloration IHC 15. Dans la protéine humaine Atlas mettre en place un modèle de TMA de 9x8 (à l&#39;exception des marqueurs) des noyaux are utilisé. Il est d&#39;une importance d&#39;obtenir le nombre maximal d&#39;articles et de garder tous les tissus représentés dans le bloc. À enregistrer les réactifs et les temps de balayage, 2 articles sont placés sur une lame de verre permettant un modèle maximum de 9x8. Le référentiel majeur pour l&#39;information des protéines, source de protéines Universal 16 comprend environ 20.300 entrées commentaire protéines humaines, dont seulement environ 66% présentent des signes au niveau protéique. Aussi pour la majorité des gènes pour lesquels il existe des preuves de l&#39;existence sur le niveau de la protéine, il est rare ou pas d&#39;information sur la fonction des protéines et la distribution de l&#39;expression. Un défi important pour l&#39;avenir est d&#39;analyser le modèle de distribution et l&#39;abondance relative de ces protéines inconnues dans divers types de tissus humains. Les informations provenant de bases de données telles que Uniprot, ENSEMBL, les données publiées à partir de PubMed peut être utilisé comme un guide pour établir si les tendances coloration immunohistochimique utilisant des anticorps àpupilles protéines inconnues représentent les profils protéiques réels de la protéine cible. En outre, plusieurs stratégies de validation d&#39;autres sont nécessaires pour assurer la fonctionnalité des anticorps, des anticorps pour la fonctionnalité par exemple dans des puces à protéines, Western blot, immunofluorescence, immuno-précipitation et pull-down expériences. Peut-être l&#39;outil le plus important pour la validation de la fonctionnalité d&#39;anticorps est d&#39;utiliser des anticorps couplés, c&#39;est à dire deux anticorps différents dirigés contre distinctes, non chevauchantes épitopes sur la protéine cible même, de comparer les résultats de dosage spécifique 17. Basé sur les informations compilées, les anticorps ont été testés et adaptée en fonction de normes IHC et de l&#39;expérience de tester et de valider plus de 35.000 anticorps dans le projet de l&#39;Atlas des protéines humaines. Depuis plus de 20% de tous les gènes dont les profils protéiques, les données à partir d&#39;anticorps appariées (2 ou plusieurs anticorps envers les non-chevauchement des épitopes sur la même protéine) a été utilisée pour déterminer un best esticompagnon du patron d&#39;expression protéine correspondante. Anticorps couplés fournir une stratégie ultime pour valider spécifiques basés sur les modèles immunohistochimie l&#39;expression de protéines. Cette stratégie est utile parce que la multitude de tissus différents inclus dans le dépistage de base augmente le risque de réactivité croisée. Il convient également de noter que certains tissus sont en général plus enclins à montrer de fond coloration des macrophages par exemple, le muscle lisse, des tubules distaux du rein et des hépatocytes dans le foie. D&#39;autres questions à prendre en considération les variations dans les techniques de traitement des tissus au fil du temps pour les tissus prélevés sur des documents d&#39;archives, ce qui peut entraîner des faux négatifs ou positifs inappropriée modèles de coloration IHC. Ce phénomène se rencontre également dans l&#39;analyse grande section. Contrôles à la fois négatives et positives sont essentielles et doivent être utilisées lorsque cela est possible. Pour des études plus approfondies, y compris des analyses fonctionnelles, des lignées cellulaires avec l&#39;expression forcée et spécifique knock-down de tr correspondantsanscripts (technologie siRNA) peut être utilisé pour créer des contrôles. Pour des résultats optimaux dans IHC, il est important de tester et d&#39;utiliser les systèmes de recherche d&#39;antigènes, depuis la fixation dans le formol induit des modifications chimiques différentes, par exemple de réticulation, l&#39;hydrolyse des bases de Schiff de masquage de l&#39;antigène 18. En conclusion, à base d&#39;anticorps protéomique employant la technologie TMA et l&#39;IHC est une stratégie puissante pour générer des données d&#39;expression de protéines à grande échelle. La protéine humaine du projet Atlas a été mis en place pour créer une carte de l&#39;expression des protéines humaines dans les tissus humains normaux et cancéreux. L&#39;objectif de ce projet est de présenter un premier projet d&#39;un Atlas des protéines humaines complète d&#39;ici à 2015. En plus de fournir des profils protéiques dans les organes et tissus normaux, cet effort constitue également un point de départ pour des projets de recherche biomédicale, y compris cliniques efforts de découverte de biomarqueurs. Le but ultime est d&#39;ajouter une couche d&#39;information suivante sur le dessus de la séquence du génome humain qui wiserez crucial pour une meilleure compréhension de la biologie sous-jacente divers états pathologiques, et de fournir une base pour l&#39;élaboration de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le tampon de lavage </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampon citrate pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Diluant anticorps </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP polymère HRP </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> Système DAB substrat plus </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Bloquer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Anticorps primaire Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hématoxyline </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Manuel tissu micro arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instrument </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Cascade microtome </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Scanner d&#39;image automatisé </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Système automatisé de coloration de lames </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Système automatisé de coloration de lames pour deparafinization et la déshydratation </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Lamelles de verre automatisé </td><td> Leica Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Chambre de révèler </td><td> Biocare médicale </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Le tissu microarray (TMA) fournit les moyens pour analyse à haut débit de multiples tissus et de cellules. La technique est utilisée dans le projet de l&#39;Atlas des protéines humaines pour l&#39;analyse globale des profils d&#39;expression de protéines dans les tissus humains normaux, le cancer et les lignées cellulaires. Ici, nous présentons l&#39;ensemble des 1 mm carottes, récupéré à partir de tissus au microscope représentatifs sélectionnés, dans un bloc de TMA seul destinataire. Le nombre et la taille des noyaux dans un bloc de TMA peut être modifiée à partir d&#39;une quarantaine de deux noyaux mm à des centaines de 0,6 mm noyaux. L&#39;avantage d&#39;utiliser la technologie TMA est la quantité importante de données peuvent rapidement être obtenues en utilisant un protocole immunomarquage unique afin d&#39;éviter la variabilité expérimentale. Il est important, seul le montant limité de tissus rares est nécessaire, ce qui permet l&#39;analyse des cohortes de patients 1 2. Environ 250 sections consécutives (4 um d&#39;épaisseur) peut être coupé à partir d&#39;un bloc de TMA et utilisé pour immunohistochimique staining pour déterminer les profils d&#39;expression de protéines spécifiques de 250 anticorps différents. Dans le projet de l&#39;Atlas des protéines humaines, les anticorps sont générés vers toutes les protéines humaines et utilisé pour acquérir des profils protéiques correspondantes dans les deux tissus humains normaux de 144 individus et les tissus cancéreux de 216 patients différents, représentant les 20 formes les plus courantes de cancer chez l&#39;homme. Immunohistochimique sur coupes colorées TMA lames de verre sont numérisés pour créer des images haute résolution à partir de laquelle les pathologistes capables d&#39;interpréter et d&#39;annoter les résultats de l&#39;immunohistochimie. Images conjointement avec les données correspondantes des annotations basées sur la pathologie sont rendues publiques pour la communauté de recherche à travers le Human Protein Atlas portail ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figure 1) 3 4. L&#39;Atlas des protéines humaines fournit une carte montrant la répartition et l&#39;abondance relative des protéines dans le corps humain. Le ver de courantsion contient plus de 11 millions d&#39;images avec des données d&#39;expression de protéines pour 12.238 protéines uniques, correspondant à plus de 61% de l&#39;ensemble des protéines codées par le génome humain.

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Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Tissue microarrays permet une méthode efficace pour obtenir des informations simultanées à partir d&#39;une multitude de tissus. Pièces représentatives de tissus sont assemblés en un seul bloc de paraffine. Les articles du bloc sont utilisés pour l&#39;immunohistochimie et l&#39;analyse des profils d&#39;expression de protéines. Balayage numérique génère des images correspondantes pour la distribution des données.

La production de puces de tissus, de coloration immunohistochimique et Numérisation Dans l&#39;Atlas des protéines humaines

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

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55.7K vues.  Uppsala University. Tissue microarrays permet une méthode efficace pour obtenir des informations simultanées à partir d'une multitude de tissus. Pièces représentatives de tissus sont assemblés en un seul bloc de paraffine. Les articles du bloc sont utilisés pour l'immunohistochimie et l'analyse des profils d'expression de protéines. Balayage numérique génère des images correspondantes pour la distribution des données.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

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Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualisation de la Structure du tissu adipeux blanc 3D utilisant entier-Montez la souillure

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 enrichit le rendement des mélanocytes humains à partir de tissus cutanés adultes

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Culture de tissu du cortex ovarien bovin

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans le tissu végétal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...