Ce protocole aide à orienter la sélection des régions d’intérêt pour les technologies spatiales omiques, ce qui permet une caractérisation plus ciblée des tissus ou des populations cellulaires. Un protocole automatisé pour la sélection du retour sur investissement dans les tests protéomiques est plus robuste et reproductible que les protocoles manuels, et l’utilisation de ROI de 50 micromètres pour les tests transcriptomiques permet de profiler des populations cellulaires spécifiques. Commencez par programmer l’autocolorant pour appliquer des anticorps de visualisation fluorescente.
Dans le logiciel autostainer, cliquez sur le bouton d’accueil et choisissez Protocoles. Cliquez ensuite sur Créer / Modifier des protocoles et sélectionnez RUO Discovery Universal comme procédure. Cliquez sur Première séquence, puis sélectionnez Déparaffination, puis Deparazation v2.
Pour Température moyenne, choisissez 72 degrés Celsius, puis cliquez sur Prétraitement et sélectionnez Conditionnement cellulaire et réservoir CC1. Pour Very High Temperature, choisissez 100 degrés Celsius, puis cliquez sur CC1 huit minutes, puis continuez à cliquer jusqu’à ce que CC1 64 minutes soit sélectionné. Cliquez sur Inhibiteur, puis sélectionnez Inhibiteur DISCOVERY, et pour Temps d’incubation, choisissez huit minutes.
Cliquez ensuite sur Anticorps, suivi de Incubation d’anticorps à haute température. Pour basse température, choisissez 37 degrés Celsius. Pour Antibody, choisissez l’ANTICORPS 6 sur l’étiquette du distributeur.
Pour Plus Temps d’incubation, sélectionnez 32 minutes. Cliquez sur Multimer HRP, puis sélectionnez Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Antibody Blocking, choisissez Gt Ig Block.
Et pour le temps d’incubation, choisissez quatre minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap Anti-Rb HRP, et pour Incubation Time, choisissez 16 minutes. Cliquez ensuite sur Cy5, et pour Long Incubation Time, choisissez zéro heure, huit minutes.
Cliquez sur Dual Sequence (Séquence double) et choisissez Antibody Denaturation (Dénaturation des anticorps). Sélectionnez ensuite Antibody Denature CC2-1, et pour une température très élevée, choisissez 100 degrés Celsius. Assurez-vous que le temps d’incubation est de huit minutes.
Ensuite, cliquez sur Inhibiteur de DS et sélectionnez Neutraliser. Cliquez sur Anticorps DS, et pour une température très basse, choisissez 37 degrés Celsius. Ensuite, dans Anticorps, choisissez ANTICORPS 3 sur l’étiquette du distributeur.
Et pour Plus Incubation Time, sélectionnez 32 minutes. Cliquez sur DS Multimer HRP et choisissez DS Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Blocage des anticorps, sélectionnez Gt Ig Block, et pour Temps d’incubation, choisissez quatre minutes.
Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Ms HRP, et pour Incubation Time, choisissez 16 minutes. Cliquez ensuite sur DS Rhodamine 6G, et pour un long temps d’incubation, choisissez zéro heure, huit minutes. Cliquez sur Triple Stain et sélectionnez TS Antibody Denaturation, puis sélectionnez Antibody Denature CC2-2, et pour Very High Temperature, sélectionnez 100 degrés Celsius.
Assurez-vous que le temps d’incubation est de huit minutes. Ensuite, cliquez sur TS Inhibitor et sélectionnez TS Neutralize. Cliquez sur Anticorps TS, et pour Very Low Temperature (Température très basse), sélectionnez 37 degrés Celsius.
Ensuite, dans Anticorps, sélectionnez l’ANTICORPS 7 sur l’étiquette du distributeur, et pour Plus Incubation Time, sélectionnez 32 minutes. Cliquez sur TS Multimer HRP et choisissez TS Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Blocage des anticorps, sélectionnez Gt Ig Block, et pour Temps d’incubation, choisissez quatre minutes.
Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap Anti-Rb HRP, et pour Incubation Time, choisissez 16 minutes. Cliquez ensuite sur TS FAM, et pour Long Incubation Time, choisissez zéro heure, huit minutes. Cliquez sur Enregistrer et ajoutez un titre au protocole.
Sélectionnez un numéro de protocole, ajoutez un commentaire, puis cliquez sur Actif, puis sur Enregistrer. Cuire au four à 70 degrés Celsius des coupes de tissus humains fixées au formol fixées au formol dans un four réglé à 70 degrés Celsius pendant 20 à 60 minutes. Pendant la cuisson des diapositives, imprimez les étiquettes en cliquant sur Créer une étiquette dans le logiciel de coloration automatique.
Ensuite, cliquez sur Protocoles, sélectionnez le numéro de protocole et cliquez sur Fermer/Imprimer. Ajoutez les informations pertinentes sur l’étiquette de la diapositive et cliquez sur Imprimer. Retirez les lames du four et laissez-les refroidir à température ambiante.
Appliquez les étiquettes de protocole précédemment imprimées aux diapositives correspondantes. Charger les distributeurs d’anticorps rechargeables avec des anticorps conformément aux numéros d’étiquette des anticorps. Diluer chaque anticorps dans le diluant spécifié et amorcer les distributeurs d’anticorps rechargeables.
Rassemblez les distributeurs de réactifs préremplis de blocage, de détection et d’amplification et placez-les sur le plateau de réactifs de l’instrument. Chargez les diapositives dans les tiroirs de diapositives et cliquez sur En cours d’exécution, puis sur Oui. Confirmez le début de l’exécution en vérifiant la durée de l’exécution sur le logiciel autostainer.
Le lendemain, assurez-vous que la course est terminée en observant les voyants clignotants verts sur les fentes du tiroir à glissières. Ensuite, retirez les lames de l’instrument et rincez-les vigoureusement dans un tampon de réaction 1x jusqu’à ce que la solution de glissement de couvercle liquide soit complètement retirée. Remplacer SYTO 13 par SYTO 64 à 5 000 nanomolaires pour permettre l’intégration des fluorophores.
Diluer SYTO 64 dans 1x TBS et incuber dans une chambre d’humidité pendant 15 minutes. Utilisez FITC pour DISCOVERY Fam et réglez l’exposition sur 200 millisecondes. Utilisez Cy3 pour DISCOVERY Rhodamine 6G et réglez l’exposition à 200 millisecondes.
Utilisez Texas Red pour SYTO 64 et réglez l’exposition sur 50 millisecondes. Spécifiez SYTO 64 comme canal de focus, et enfin, utilisez Cy5 pour DISCOVERY Cy5. Réglez l’exposition sur 200 millisecondes et enregistrez les modifications.
Cuire au four des sections de granulés de cellules fixées au formol et incorporées de paraffine dans un four réglé à 70 degrés Celsius pendant 20 à 60 minutes. Numérisez les diapositives sur la plate-forme de profilage spatial et sélectionnez des tailles de 50 micromètres et 300 micromètres. Le protocole de visualisation automatisé a été développé en incluant des commandes de non-utilisation pour confirmer qu’il n’y avait pas de saignement provenant des canaux voisins.
La carte thermique logarithmique 2 de tous les marqueurs inclus dans le test de protéomique spatiale comparant le protocole manuel pancytokératine CD 45 en noir au protocole automatisé 3-plex en gris montre une valeur Spearman R de 0,88. Sur les 31 anticorps utilisés dans les essais, 23 anticorps avaient une valeur Spearman R supérieure ou égale à 0,5. La carte thermique logarithmique 2 des cibles sélectionnées incluses dans le test de transcriptomique spatiale comparant le protocole manuel pancytokératine CD 45 en noir au protocole automatisé 3-plex en gris a montré des différences dans ces valeurs.
Les données de séquençage pour le protocole de visualisation automatisé 3-plex présentaient des valeurs inférieures à celles du protocole de visualisation manuelle pan-cytokératine CD 45, ce qui est également reflété par les faibles valeurs R de Spearman de 0,15. De plus, une perte de plage dynamique a été observée lors de l’utilisation du protocole automatisé de visualisation 3-plex. La détection de petits ROI dans le protocole de transcriptomique spatiale a été réalisée par la sélection de régions circulaires d’intérêt à 50 micromètres et 300 micromètres de diamètre Les numérations d’ARN pour des cibles sélectionnées sur différentes lignées cellulaires étaient comparables entre les deux régions de tailles d’intérêt après normalisation.
Ce protocole de panels de visualisation automatisés peut être adapté par les chercheurs en échangeant des marqueurs afin de développer des panels qui définissent précisément les ROI pour répondre à leurs questions de protéomique spatiale.
