Les auteurs tiennent à remercier Marika Walters pour obtenir des conseils dans l&#39;élaboration d&#39;hybridation in situ dans les méthodes pour les tissus mous et Goltsev Yury de discussion sur les protocoles pour l&#39;hybridation in situ d&#39;embryons Anopheles gambiae, qui ont ensuite été adaptés et modifiés pour développer le protocole décrit ici pour l&#39;hybridation dans in situ des Aedes et Culex embryons. Nous reconnaissons également des recommandations utiles donnés par Adam Paré et David Kosman. Nous remercions Osvaldo Marinotti pour le débat scientifique et de l&#39;édition du texte du protocole.

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	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucune divulgation.

L&#39;hybridation in situ dans le protocole de coloration et colorimétriques présentées ici pour les tissus de moustiques toute-montage et d&#39;embryons est une technique utile pour la localisation des relevés de notes au sein des organes spécifiques et des types de cellules. Ces procédures sont une amélioration par rapport à nos méthodes précédemment signalées, tant dans la rationalisation des étapes de lavage et de fournir de vastes détails techniques supplémentaires et des sources de réactifs. Dans notre expérience, la détection colorimétrique des signaux d&#39;hybridation est supérieure à la sensibilité et la clarté de signal d&#39;hybridation par rapport à des modèles de détection basées sur la fluorescence. En outre la détection colorimétrique contourne les questions liées à la discrimination du signal dans les embryons, qui sont par nature auto-fluorescence. Limitations dans la détection des signaux d&#39;hybridation se produire, quand à faible abondance transcriptions sont ciblées et une coloration de fond est évident. L&#39;augmentation de la température d&#39;hybridation à 65 ° C a été trouvée pour réduire retoursignaux d&#39;hybridation au sol, mais n&#39;est pas un substitut pour la conception unique de suggéré spécifiques à la cible des sondes d&#39;ARN. Ce protocole a été utilisé pour effectuer l&#39;hybridation in situ de l&#39;ensemble du montage glandes salivaires d&#39;Aedes aegypti, et les ovaires et les embryons d&#39;Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti et Culex quinquefasciatus. Cette méthode est également applicable aux tissus de moustiques d&#39;autres, et probablement ceux d&#39;autres insectes. En outre, nous avons compilé pour les lignes directrices pour la première fois comparatifs pour la mise en scène du développement embryonnaire dans trois moustiques vecteurs, Ae. aegypti, un. gambiae et Cx. fatigans. Les observations ont été rapportées pour les souches spécifiques de ces trois espèces, dans des conditions d&#39;élevage discrets. Il est important de noter que le cours du temps de développement peuvent varier pour différentes souches d&#39;espèces de moustiques et sous différentes conditions d&#39;élevage. Des hybridations in situ en supplément sur ​​les efforts en cours pour analyser les transcriptomes de moustiques et autres arthropodes, et peut fournir une meilleure idée de la régulation de l&#39;expression des gènes dans ces organismes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> 0,5 M d&#39;EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml microtubes </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Moins opaque que les tubes standard; aides à visualiser des échantillons </td></tr><tr><td> Formamide déionisé </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Stockage à 4 ° C </td></tr><tr><td> De l&#39;eau DEPC </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hypochlorite de sodium à 5,25% </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marque </td></tr><tr><td> T3 ARN polymérase-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Le stockage à -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA polymérase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Le stockage à -20 ° C </td></tr><tr><td> Éthanol à 95% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand jetables pipettes de transfert en polyéthylène </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Formaldéhyde 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> Méthanol pour HPLC </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Couvercle en verre Microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-Heptane </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xylène </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque Pyrex spot 9-bien </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Des lames de microscope Superfrost / Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Rouge ruban Toupee Clear-liner </td><td> Cheveux direct </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / matériau de base avec la peau 0,75 po x 12 m rouleau de ruban </td></tr><tr><td> Kit de clonage TOPOTA pour Sequening avec One Shot Top10 chimiquement compétente E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 réactions 40 réactions </td></tr><tr><td> Soniqué l&#39;ADN de sperme de saumon </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Le stockage à -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine-AP fragments Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Stockage à 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG ARN étiquetage mélange </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Le stockage à -20 ° C </td></tr><tr><td> Solution stock NBT / BCIP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Stockage à 4 ° C </td></tr><tr><td> Western Blocking Reagent </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Stockage à 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech maille polyester (330.130) </td><td> Saati Imprimer </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 fils / cm, 34 microns de diamètre du fil, couleur orange </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% en PBT </td></tr><tr><td> Sel de sodium d&#39;héparine </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldéhyde 37% </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Aliquotes de 10 ml dans de l&#39;ambre ampoules </td></tr><tr><td> 16 oz Contenants en papier solo avec couvercles </td><td> Le Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Le verre borosilicate scintillatflacon avec bouchon à vis d&#39;ions seules </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml de 500 cas </td></tr><tr><td> Sealed Air à bulles matériau de rembourrage celluar </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 pieds / rouleau 0,188 pouces d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> De sérum de poulet </td><td></td><td></td><td> Le sang total ont été recueillies soit à partir de la veine de l&#39;aile ou par ponction cardiaque à partir d&#39;un poulet pour mineurs. Du sang a été incubées à 37 ° C pendant 1 h jusqu&#39;à ce que coagulé et ensuite placé sur la glace pendant 30 min. Le sérum a été prélevé et centrifugé à 3000 xg pendant 10 min. Le surnageant résultant (a précisé le sérum) a été collecté et conservé à -20 ° C jusqu&#39;à son utilisation. </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Table des réactifs spécifiques et des équipements pour l&#39;hybridation in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Les moustiques sont des vecteurs pour un ensemble diversifié de pathogènes, y compris les arbovirus, des parasites protozoaires et les nématodes. Enquête sur les transcriptions et les régulateurs des gènes qui sont exprimés dans les tissus où le moustique hôte et d&#39;interagir des agents pathogènes, et dans les organes impliqués dans la reproduction d&#39;un grand intérêt pour les stratégies visant à réduire la transmission de maladies transmises par les moustiques et de perturber le développement des œufs. Un certain nombre d&#39;outils ont été utilisés pour étudier et valider la régulation temporelle et tissu-spécifique de l&#39;expression génique. Ici, nous décrivons les protocoles qui ont été développés pour obtenir des informations spatiales, ce qui améliore notre compréhension de l&#39;endroit où les gènes spécifiques sont exprimés et leurs produits s&#39;accumulent. Le protocole décrit a été utilisé pour valider l&#39;expression et de déterminer des modèles d&#39;accumulation des transcrits dans les tissus liés à moustiques transmission d&#39;agents pathogènes, tels que les femmes les glandes salivaires, ainsi que des compartiments subcellulaires des ovaires et des embryons, qui a rouverttard pour la reproduction des moustiques et le développement. Les procédures suivantes représentent une méthodologie optimisée qui améliore l&#39;efficacité des différentes étapes du protocole, sans perte des signaux d&#39;hybridation spécifiques à la cible. Lignes directrices pour la préparation sonde d&#39;ARN, la dissection des tissus mous et la procédure générale pour la fixation et l&#39;hybridation sont décrites dans la partie A, tandis que des mesures spécifiques pour la collecte, la fixation, de pré-hybridation et l&#39;hybridation des embryons de moustiques sont détaillés dans la partie B.

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporelles et spatiales analyses d&#39;expression génique ont un rôle crucial dans la génomique fonctionnelle. Tout le montage d&#39;hybridation<em&gt; In situ</em&gt; Est utile pour déterminer la localisation des transcrits dans les tissus et les compartiments subcellulaires. Nous exposons ici une hybridation<em&gt; In situ</emProtocole&gt; avec des modifications pour les tissus cibles spécifiques chez les moustiques.

Hybridation<em&gt; In situ</em&gt; Des glandes salivaires, des ovaires et des embryons de moustiques vecteurs

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

16.4K vues.  University of California, Irvine. Temporelles et spatiales analyses d'expression génique ont un rôle crucial dans la génomique fonctionnelle. Tout le montage d'hybridation In situ Est utile pour déterminer la localisation des transcrits dans les tissus et les compartiments subcellulaires. Nous exposons ici une hybridation In situ avec des modifications pour les tissus cibles spécifiques chez les moustiques.