Générer des modèles cellulaires primaires ou des structures organoïdes est essentiel pour répondre à de nombreuses questions contemporaines en biologie. Par exemple, nous nous intéressons depuis un certain temps aux mécanismes utilisés par les virus humains pour faciliter la réplication de la glande salivaire car il s’agit d’un site important pour la transmission horizontale. Le développement du système basé sur la salisphère décrit dans ce protocole est une avancée cruciale dans notre quête pour répondre à ce type de questions.
Cette technique nous permet de générer des cellules primaires à partir d’une variété d’échantillons de patients différents. Les modèles cellulaires rappellent davantage la situation de type in vivo car les cellules ne sont pas modélisées ou transformées comme de nombreux types de cellules couramment utilisés pour des expériences in vitro. Nous avons utilisé ce protocole pour générer des cellules similaires à partir de la glande submandibulaire primaire de la souris et le protocole serait probablement utile pour d’autres organes avec des structures cellulaires similaires.
Dans les deux à quatre heures suivant l’enlèvement du patient, sur une plaque de culture, utilisez des ciseaux dissecteurs stérilisés autoclavés et des forceps chirurgicaux pour hacher le tissu salivaire de glande en morceaux fins de la taille d’un à deux millimètres. Ajouter six millilitres de la solution Dispase/Collagène au tissu haché. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant environ 30 minutes à une heure.
Perturber le tissu par pipetting avec une pipette sérologique de cinq millilitres 15 à 20 fois. Incuber à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes à une heure. Répétez l’étape de pipetage et d’incubation deux à trois fois de plus ou jusqu’à ce que le tissu ressemble à une boue et peut facilement passer à travers l’ouverture pipette.
Pour enrober les puits de BMM, pipette lentement 500 microlitres de BMM décongelés pendant la nuit dans chaque puits d’une plaque de six puits. Faites tourbillonner lentement la plaque pour répartir uniformément le BMM sur les puits. Ensuite, incuber les plaques enduites à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes avant l’utilisation pour permettre au BMM de se solidifier.
Tout d’abord, transférez la solution Dispase/Collagène contenant du tissu homogénéisé à un tube conique de 15 millilitres. Lavez la paroi de la plaque une fois avec six millilitres de DPBS pour transférer les cellules restantes dans le tube conique. Ensuite, à travers une passoire cellulaire en nylon de 70 micromètres, filtrez l’homogénéité dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour enlever les tissus non digérés.
Centrifugeuse cellules tendues pendant cinq minutes à 500 fois g. Aspirez le surnatant. Puis résuspendez la pastille cellulaire en 10 millilitres de tampon de lyse RBC 1X.
Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 20 à 25 millilitres de DPBS pour neutraliser le tampon de lyse RBC et minimiser la lyse des cellules salivaires. Centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g.
La pastille de globule blanc indique la lyse complète de tous les RBC. Si la pastille a la couleur rouge, répétez le traitement avec le tampon de lyse RBC. Aspirez le supernatant et resuspendez la pastille en un à deux millilitres de BEGM, puis transférez les cellules résuspendues sur les puits enduits de BMM.
Incuber à 37 degrés Celsius. Une fois plaquées BMM, les cellules se formeront en structures sphériques ou salispheres sur une période de deux à trois jours. Les cellules peuvent être maintenues sous forme de salisphère pendant environ cinq à sept jours avant que le BMM commence à se dégrader permettant aux cellules d’accéder et d’adhérer au plastique et de croître en monocouche.
Tout d’abord, aspirez les médias des puits et ajoutez un millilitre de solution Dispase/Collagène à chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes ou jusqu’à ce que le BMM se soit dissous pour la plupart. Ensuite, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et lavez les puits une fois avec un à trois millilitres de DPBS pour obtenir les cellules restantes.
Centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en deux millilitres de trypsine. Incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Ensuite, ajoutez au tube tout média complet contenant 10% sérum pour neutraliser la Trypsine. Centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g. Aspirer le supernatant pour enlever les médias résiduels, trypsine et sérum, puis resuspendre les cellules dans DPBS.
Centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g. Aspirer le surnatant et réutiliser la pastille dans BEGM. Pour maintenir la pastille sous forme de sphères, plaquez les cellules résuspendées sur des plats de culture enduits de BMM solidifiés.
La culture de toutes les cellules d’un incubateur humidifié s’est maintenue à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq à sept jours avant la subcultation. Nourrissez-le avec du BEGM frais tous les deux ou trois jours. Pour proliférer les cellules comme un monomère sur les plats de culture en plastique, aspirer le média BEGM du plat et laver une fois avec DBPS pour enlever les médias résiduels.
Ajouter deux millilitres de trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient complètement détachées. Neutraliser la trypsine à l’aide de quatre millilitres de tout média complet contenant 10% de sérum. Inclinez ensuite doucement le plat et transférez les cellules vers un tube conique de 15 millilitres.
Lavez la plaque une fois avec environ cinq millilitres de DPBS pour recueillir les cellules restantes. Centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g. Aspirez le surnatant.
Pour éliminer les supports résiduels, résuspendez les cellules en six à 10 millilitres de DPBS. Centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g. Aspirez le surnatant et resuspendez dans BEGM.
Ensuite, plaquez les cellules sur les plats traités de culture de tissu en plastique. Culture les cellules dans un incubateur humidifié maintenu à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq à sept jours avant la subcultation. Nourrissez-le avec du BEGM frais tous les deux ou trois jours.
Dans ce protocole, après placage des cellules du tissu digéré sur BMM pendant deux à trois jours, les cellules ont facilement formé de petits groupes qui ont continué à se développer dans la taille jusqu’à 15 à 20 cellules par faisceau. Les cellules de salisphère ont été plaquées sur le plastique traité de culture cellulaire et cultivées comme un monocouche où elles présentent une morphologie compatible avec les cellules d’origine épithéliale. Une technique et des soins aseptiques appropriés sont nécessaires pour éviter la contamination bactérienne ou fongique.
Aucune quantité d’antibiotiques ou d’antimycotiques ne sauvera une culture grouillante de microbes. Nous répondons à des questions sur la pathogénie virale et la transmission. Mais pour d’autres, cela fournit un moyen d’étudier les cellules salivaires humaines pour un certain nombre d’applications telles que les thérapies de régénération des tissus.
Pour nous qui étudions le cytomégalovirus humain, cette technique nous a permis de commencer à explorer les mécanismes moléculaires que le virus utilise pour infecter et finalement transmettre à de nouveaux hôtes. Rien d’utilisé dans ce protocole n’est intrinsèquement dangereux, mais la prudence doit toujours être prise lors de la manipulation des tissus humains et de toute sorte de réaccents chimiques.
