Les auteurs tiennent à remercier Hong Jiang, Ph.D. et Deepa Parathasarthy, MPH, le BDS pour l&#39;assistance technique.

1. Prélèvement de sang total <ol><li> Recueillir le sang veineux de l&#39;homme ou les animaux de laboratoire dans NEM / EDTA tubes contenant. </li><li> Immédiatement spin down sang dans une centrifugeuse de paillasse à 14300 rcf (force centrifuge relative) pendant 7 minutes pour préparer le plasma et globules rouges à granulés. </li><li> Préparer des échantillons de plasma pour la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) et détection par chimiluminescence (CLD) d&#39;analyse. HPLC: Ajouter 01h01 volume de méthanol froid au plasma, vortex et centrifuger à 13200 rpm pendant 10 minutes à précipiter les protéines plasmatiques. Recueillir le surnageant pour l&#39;analyse HPLC. CLD: aliquote d&#39;un échantillon et préincuber avec le sulfanilamide et le chlorure de mercure à nitrosothiols dosage particulier. </li><li> Préparer des globules rouges à pellets pour HPLC et analyse CLD. HPLC: Ajouter 01h04 rouge culot cellulaire à une solution de lyse hypotonique contenant 10 NEM mM, 2,5 mM EDTA et 10 mM de ferricyanure. Vortex à fond et puis ajoutez 01:01 méthanol, vortex et CENTRIFUGEuge à 13200 rpm pendant 10 minutes aux protéines de précipité. Recueillir le surnageant pour l&#39;analyse HPLC. CLD. Ajouter 01h04 rouge culot cellulaire à une solution de lyse hypotonique contenant 10 mM d&#39;EDTA, 2,5 mM EDTA et 10 mM Ferricyanure. Parties aliquotes dans des tubes contenant du chlorure de mercure et de sulfanilamide pour la détection spécifique de nitrosothiols. </li></ol> 2. Extraction de tissus et de préparation <ol><li> Pour déterminer les niveaux tissulaires de NO métabolites, il est d&#39;abord nécessaire de récolter le tissu sanguin gratuit pour la préparation des échantillons comme décrit ci-dessus. Un échange de sang complet aura lieu par infusion tampon physiologique par le sommet du ventricule gauche. Une fois que tout le sang est retiré, les tissus d&#39;intérêt peut alors être récoltés. </li><li> Homogénéiser les échantillons de tissus et de préparer des échantillons comme décrit ci-dessus pour HPLC et analyse CLD. </li></ol> 3. Aortique isolement Anneaux pour la fonction endothéliale Bain d&#39;organes de tissus <ol><li> Souris sera anesthetized avec de l&#39;éther diéthylique jusqu&#39;à ne répondent plus aux pieds de pincement, et subissent dislocation cervicale avant l&#39;intervention chirurgicale. Une thoracotomie est réalisée afin d&#39;exposer l&#39;aorte thoracique et abdominale. Seringue de calibre 25 est inséré dans l&#39;apex du ventricule gauche et perfusé libre du sang oxygéné avec Krebs Henseleit tampon. </li><li> L&#39;oreillette droite est découpée pour fournir une sortie pour le sang. Aorte abdominale sera démonté et nettoyé de l&#39;adventice. </li><li> Anneaux sera coupé en 2 mm de longs segments et monté sur un bain à quatre voies des tissus des organes (DMT 720MO, instruments AD) baignent dans une solution tampon physiologique. </li><li> Anneaux de navires sont maintenus dans des bains d&#39;organes de 10 ml avec tampon de Krebs oxygénée (95% d&#39;O 2 et 5% de CO 2) à 37 ° C. Un précontrainte gramme est placé sur chaque anneau aortique (échéant de départ pour la tension fonction vasomotrice optimale telle que déterminée dans des expériences précédentes). Un enfant de huit canaux octal pont (Powerlab) et d&#39;acquisition de données du logiciel (version graphique 5.2.2) unere utilisé pour enregistrer toutes les mesures de force. </li><li> Les anneaux sont autorisés à s&#39;équilibrer pendant 80 minutes avec le tampon dans chaque bain d&#39;organe changé toutes les 20 min. Après équilibration pendant 80 min, 1 uM phényléphrine est ajouté à chaque anneau de la contraction sous-maximale. </li><li> Après stabilisation, agoniste endothéliale tels que l&#39;acétylcholine seront additionnés pour déterminer la production de NO et le degré de relaxation des vaisseaux. Après la dose-réponse à l&#39;acétylcholine, bains seront rincés et réembauché, puis traitée avec une source exogène de l&#39;oxyde nitrique, le nitroprussiate de sodium afin de déterminer la réactivité du muscle lisse et d&#39;obtenir une valeur pour 100% détente. </li><li> NO charognards peuvent être ajoutés au bain pour illustrer clairement la libération de NO inhibition et de la relaxation des vaisseaux. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Utilisez de l&#39;ENO-20 HPLC dédiée fournit une méthode facile à utiliser à haut débit pour la détection spécifique et sensible des nitrites et nitrates dans lesmatrices biologiques. Le principe de détection et un chromatogramme d&#39;origine est représenté sur la figure 1. Cette méthode peut être utilisée pour n&#39;importe quel échantillon biologique pour déterminer les nitrites et les nitrates. CLD de détection basée sur de NO métabolites nécessite une étape de dérivatisation chimique pour déterminer la source moléculaire de la NO. Le montage expérimental pour dénitrosation oxydatif simultanée et dénitrosation réductrice pour le détecteur de chimiluminescence est illustré à la figure 2. La cuve de réaction sur la droite est rempli avec du ferricyanure 800mm dans du PBS pH 7,4 et la cuve de réaction sur la gauche est rempli de l&#39;iodure de potassium / iode mélange dans l&#39;acide acétique pour dénitrosation réduction (Figure 2A). L&#39;ensemble du montage est montré dans la figure 2B. La figure 3 illustre des essais du groupe dénitrosation spécifiques qui permettent de détecter et de quantifier les nitrites, nitrosamines nitrosothiols, ainsi que des produits hème nitrosyle. Cette méthode a déjà été descrilit et validé 4,5. Ces analyses biochimiques importantes peuvent facilement être mis en corrélation avec les études fonctionnelles sur des anneaux aortiques isolés pour déterminer la production de NO endothélial chez les animaux expérimentaux. Cette expérience classique pharmacologique peut facilement et d&#39;évaluer avec précision endothéliale fonction NO et la production. Mesure la réactivité vasculaire aux agonistes endothéliales tels que l&#39;acétylcholine peut déterminer directement la production de NO endothélial qui peuvent ensuite être corrélée avec des biomarqueurs biochimiques détectés dans le sang et les tissus des animaux de laboratoire. Une représentation typique d&#39;un dose-réponse à l&#39;acétylcholine est montré dans la figure 4. Souris témoins sains avec la fonction endothéliale normale répondre à l&#39;acétylcholine par la détente. Souris avec dysfonction endothéliale (souris hypercholestérolémiques) montrent la relaxation réduite en raison de la production de NO réduit au même stimulus. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" /> Figueure 1. Principe de la détection des nitrites et nitrates par ENO-20 et chromatogramme de l&#39;échantillon. (Haut) Schéma de ENO-20 méthode de détection pour les nitrites et les nitrates. (En bas) chromotogram standard de 10 pmol nitrite et de nitrate injecté dans ENO-20 (100 pi de solution à 100 nM des nitrites et nitrates). Sensibilité de 1 nM pour chaque anion avec un volume de 100 ul d&#39;injection. Aucune interférence avec les protéines ou les espèces colorées. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" /> Figure 2. CLD dispositif expérimental utilisant à la fois dénitrosation oxydatif par dénitrosation ferricyanure et réductrice en utilisant l&#39;iodure / iode test avec détection en phase gazeuse de gaz d&#39;oxyde nitrique purgé. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" /> Figure 3. (Groupe A) une détection par chimiluminescence du nitrite, RSNO, RNNO dans le dosage dénitrosation réductrice par préincubation échantillon avec le groupe chemic spécifiqueAl réactifs. Soustraction des aires des pics de permettre la détection de nitrite et RSNOs. (Groupe B) de détection par chimioluminescence des espèces hème nitrosyle aide d&#39;une solution de ferricyanure de dénitrosation oxydatif. Cette méthode est spécifique pour le NO-hème produits avec aucune réactivité croisée avec RSNOs (GSNO ou SNO-albumine), ou RNNO (NO-pyrrolidine et la N-nitroso-albumine). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" /> Figure 4. Bain Ex vivo organe sur des anneaux aortiques isolés fournit une mesure directe de la production de NO endothélial qui peuvent ensuite être corrélée avec des biomarqueurs biochimiques détectés par HPLC et le CLD. Cette figure illustre la relaxation réduite chez les souris présentant une dysfonction endothéliale due à une diminution la production de NO.

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	<li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown.">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).</li><li>Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligatory+role+of+endothelial+cells+in+the+relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+acetycholine.">The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine.</a> Nature. 288, 373-376 (1980).</li><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+relaxing+factor+produced+and+released+from+artery+and+vein+is+nitric+oxide.">Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.</a> Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).</li><li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+S-,+N-,+and+heme-nitrosylation+in+biological+tissues+and+fluids:+implications+for+the+fate+of+NO+in+vivo.">Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo.</a> FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitric+oxide+levels+in+the+red+cell:+validation+of+tri-iodide-based+chemiluminescence+with+acid-sulfanilamide+pretreatment.">Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment.</a> J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).</li><li>Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+S-nitrosothiol+(SNO)+synthase+function+of+hemoglobin+that+utilizes+nitrite+as+a+substrate.">An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).</li><li>Bryan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bound+NO+in+human+red+blood+cells:+fact+or+artifact.">Bound NO in human red blood cells: fact or artifact.</a> Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).</li><li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Processing+of+Nitrite+in+Hypoxia:+An+Intricate+Interplay+of+Nitric+Oxide-Generating+and+-Scavenging+Systems.">Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems.</a> J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).</li><li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples.">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+generation+from+inorganic+nitrate+and+nitrite:+Role+in+physiology,+nutrition+and+therapeutics.">NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics.</a> Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les méthodes décrites ici pour la quantification des métabolites de NO pertinentes dans de multiples compartiments biologiques permettra d&#39;empreintes digitales de NO biologie dans la santé et la maladie qui peut être corrélée avec les mesures fonctionnelles de NO par l&#39;endothélium. Ces méthodes nécessitent une préparation simple échantillon avec un potentiel d&#39;adaptation pour un débit élevé. La quantité relative de ces molécules peuvent aider à comprendre la production de NO et de son deven...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le N-éthylmaléimide </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23030 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td></tr><tr><td> Ferricyanure de potassium </td><td> Fluka </td><td> 60299 </td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Eicom Corp </td><td> ENO-20 </td></tr><tr><td> Autosampler </td><td> Alcott </td><td></td></tr><tr><td> DMT myographe </td><td> Instruments AD </td><td></td></tr><tr><td> PowerLab </td><td> Instruments AD </td><td></td></tr><tr><td> Chimioluminescence </td><td> EcoPhysics </td><td> CLD 88Y </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td></tr><tr><td> L&#39;acétylcholine </td><td> Sigma-Aldrich</td><td> A6625 </td></tr><tr><td> R-(-) de phényléphrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6126 </td></tr></tbody></table>

analytical techniques for assaying nitric oxide bioactivity

L&#39;oxyde nitrique (NO) est un diatomique des radicaux libres qui est très courte durée dans les systèmes biologiques (moins de 1 seconde dans le sang circulant) 1. NO peut être considéré comme l&#39;une des molécules les plus importants de signalisation produites dans notre corps, la régulation des fonctions essentielles, y compris mais non limité à la réglementation de la pression artérielle, la réponse immunitaire et de la communication neuronale. Par conséquent sa détection précise et la quantification dans les matrices biologiques est essentielle pour comprendre le rôle du NO dans la santé et la maladie. Avec une telle courte demi-vie physiologique de NO, des stratégies alternatives pour la détection des produits de la réaction de NO biochimie ont été développés. La quantification des métabolites de NO pertinentes dans de multiples compartiments biologiques fournit des informations précieuses en ce qui concerne la production de NO in vivo, la biodisponibilité et le métabolisme. Il suffit de l&#39;échantillonnage d&#39;un seul compartiment tels que le sang ou le plasma ne peut pas toujours fournir une évaluation précise de l&#39;ensemble body pas de statut, en particulier dans les tissus. La capacité de comparer le sang avec les tissus sélectionnés chez les animaux expérimentaux aidera combler le fossé entre la science fondamentale et la médecine clinique dans la mesure où l&#39;utilité diagnostique et pronostique de biomarqueurs dans NO santé et la maladie. Par conséquent, l&#39;extrapolation de plasma ou le sang NO statut à des tissus spécifiques d&#39;intérêt n&#39;est plus une approche valable. En conséquence, les méthodes continuent d&#39;être développés et validés qui permettent la détection et la quantification des produits de NO et NO-connexes / métabolites dans les compartiments d&#39;animaux de laboratoire in vivo. Le paradigme établi de NO biochimie de la production par NO synthases à l&#39;activation de la guanylyl cyclase soluble (GCs) à l&#39;oxydation éventuelle en nitrite (NO 2 -) et le nitrate (NO 3 -) ne peut représenter une partie de NO de effets in vivo. L&#39;interaction des métabolites de NO et de NO dérivé avec les thiols protéiques, des amines secondaires et les métaux pour former S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), et nitrosyle-hème représentent respectivement GMPc-indépendants effets de NO et sont susceptibles aussi importante que l&#39;activation de physiologiquement sGC par NO. Une véritable compréhension de NO dans la physiologie est dérivée à partir d&#39;expériences in vivo d&#39;échantillonnage compartiments multiples simultanément. D&#39;oxyde nitrique (NO) la méthodologie est une science complexe et souvent déroutant et le centre de nombreux débats et de discussion concernant la biochimie NO. L&#39;élucidation des mécanismes nouveaux et les voies de signalisation impliquant pas de charnières sur notre capacité à précisément, de manière sélective et sensible de détecter et de quantifier le NO et NO tous les produits pertinents et de leurs métabolites dans les matrices complexes biologiques. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;analyse rapide et sensible des nitrites et nitrates par CLHP ainsi que la détection de NO libre dans des échantillons biologiques en utilisant dans la couche d&#39;ozone chimioluminescence in vitro basée à derivitazation chimique pour déterminer la source de NO moléculaire ainsi que ex vivo avecmyographie bain d&#39;organe.

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Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

La production endogène d&#39;oxyde nitrique (NO) réglemente une grande variété de fonctions biologiques. Il est de plus en plus clair que la perturbation ou une dysrégulation de la signalisation du NO base est impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Méthodes de quantification pertinente NO métabolites peuvent fournir de nouveaux biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic de la maladie humaine.

Techniques d&#39;analyse permettant de doser la bioactivité d&#39;oxyde nitrique

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K vues.  University of Texas Health Science Center at Houston. La production endogène d'oxyde nitrique (NO) réglemente une grande variété de fonctions biologiques. Il est de plus en plus clair que la perturbation ou une dysrégulation de la signalisation du NO base est impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Méthodes de quantification pertinente NO métabolites peuvent fournir de nouveaux biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic de la maladie humaine.

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5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

5/6e néphrectomie en association avec High Salt Diet Nitric Oxide Synthase et inhibition pour provoquer la maladie rénale chronique chez le rat Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Recherche

Médecine

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l&#39;analyse histopathologique localisée

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Techniques expérimentales et d&#39;imagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Analyse optimisée des<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Stéatose hépatique

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was synthesized to enhance imaging sensitivity for extrapulmonary tuberculosis (ETB). An SPIO nanoprobe was synthesized and conjugated with MtbsAb. The purified SPIO-MtbsAb nanoprobe was characterized using TEM and NMR. To determine the targeting ability of the probe, SPIO-MtbsAb nanoprobes were incubated with Mtb for in vitro imaging assays and injected into Mtb-inoculated mice for in vivo investigation with magnetic resonance (MR). The contrast enhancement reduction on magnetic resonance imaging (MRI) of Mtb and THP1 cells showed proportional to the SPIO-MtbsAb nanoprobe concentration. After 30 min of intravenous SPIO-MtbsAb nanoprobe injection into Mtb-infected mice, the signal intensity of the granulomatous site was enhanced by 14-fold in the T2-weighted MR images compared with that in mice receiving PBS injection. The MtbsAb nanoprobes can be used as a novel modality for ETB detection.

To improve serological diagnostic tests for Mycobacterium tuberculosis antigens, we developed superparamagnetic iron oxide nanoprobes to detect extrapulmonary tuberculosis.

Synthèse, caractérisation et application de nanosons à oxyde de fer superparamagnetic pour la détection de la tuberculose extrapulmonaire

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Détection du monoxyde d’azote dans le sang en mesurant Phosphorylation VASP plaquettaire

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The appearance of a mass on certain magnetic resonance (MR) sequences can help differentiate a thrombus from competing diagnoses such as a tumor. T1 and T2 signal characteristics of a thrombus are related to the evolution of hemoglobin properties. A thrombus typically does not enhance following contrast administration, which also helps differentiation from a tumor. We also highlight the emerging role of T1 mapping in the evaluation of a thrombus, which can add another level of support in diagnosis. Prior to any CMR exam, patient screening and interviews are critical to ensure safety and to optimize patient comfort. Effective communication during the exam between the technologist and the patient promotes proper breath holding technique and higher quality images. Volumetric post processing and structured reporting are helpful to ensure that the radiologist answers the ordering services&#39; question and communicates these results effectively. Optimal pre-MR safety evaluation, CMR exam execution, and post exam processing and reporting allow for delivery of high quality radiological service in the evaluation of a suspected cardiac thrombus.

The goal of this article is to describe how cardiac magnetic resonance can be used for the evaluation and diagnosis of a suspected cardiac thrombus. The method presented will describe data acquisition as well as the pre-procedure and post-procedure protocol.

Résonance magnétique cardiaque pour l'évaluation du thrombus cardiaque présumé : techniques conventionnelles et émergentes

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical hurdles such as invasive cell delivery and tracking with low transplantation efficiency remain challenges in translational stem-based therapy. This article describes an emerging technique for stem cell labeling and tracking based on the labeling of the mesenchymal stem cells (MSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO)&#160;nanoparticles, as well as intranasal delivery of the labeled MSCs. These nanoparticles are fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded and safe to label the MSCs, which are subsequently delivered to the brains of TBI-induced mice by the intranasal route. They are then tracked non-invasively in vivo by real-time magnetic resonance imaging (MRI). Important advantages of this technique that combines SPIO for cell labeling and intranasal delivery include (1) non-invasive, in vivo MSC tracking after delivery for long tracking periods, (2) the possibility of multiple dosing regimens due to the non-invasive route of MSC delivery, and (3) possible applications to humans, owing to the safety of SPIO, non-invasive nature of the cell-tracking method by MRI, and route of administration.

Presented here is a protocol for non-invasive mesenchymal stem cell (MSC) delivery and tracking in a mouse model of traumatic brain injury. Superparamagnetic iron oxide&#160;nanoparticles are employed as a magnetic resonance imaging (MRI) probe for MSC labeling and non-invasive in vivo tracking following intranasal delivery using real-time MRI.

Suivi des cellules souches mésenchymales étiquetées à l'oxyde de fer superparamagnetic à l'aide de l'IRM après la livraison intranasale dans un modèle de murine traumatique de lésions cérébrales

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination model can be used for the evaluation of treatment methods for intrathoracic diseases such as lung cancer or malignant pleural mesothelioma.
Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is a recently developed cancer treatment strategy that combines the specificity of tumor-targeting antibodies with toxicity caused by a photoabsorber (IR700Dye) after exposure to NIR light. The efficacy of NIR-PIT has been reported using various antibodies; however, only a few reports have shown the therapeutic effect of this strategy in an orthotopic model. In the present study, we demonstrate an example of efficacy evaluation of the pleural disseminated lung cancer model, which was treated using NIR-PIT.

Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is an emerging cancer therapeutic strategy that utilizes an antibody-photoabsorber (IR700Dye) conjugate and NIR light to destroy cancer cells. Here, we present a method to evaluate the antitumor effect of NIR-PIT in a mouse model of pleural disseminated lung cancer and malignant pleural mesothelioma using bioluminescence imaging.

Photoimmunothérapie proche infrarouge pour des modèles murins de dissémination pleurale

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if administered at high concentration. Inhaled NO gas is routinely used to increase systemic oxygenation in different disease conditions. The administration of high concentrations of NO also exerts a virucidal effect in vitro. Owing to its favorable pharmacodynamic and safety profiles, the familiarity in its use by critical care providers, and the potential for a direct virucidal effect, NO is clinically used in patients with coronavirus disease-2019 (COVID-19). Nevertheless, no device is currently available to easily administer inhaled NO at concentrations higher than 80 parts per million (ppm) at various inspired oxygen fractions, without the need for dedicated, heavy, and costly equipment. The development of a reliable, safe, inexpensive, lightweight, and ventilator-free solution is crucial, particularly for the early treatment of non-intubated patients outside of the intensive care unit (ICU) and in a limited-resource scenario. To overcome such a barrier, a simple system for the non-invasive NO gas administration up to 250 ppm was developed using standard consumables and a scavenging chamber. The method has been proven safe and reliable in delivering a specified NO concentration while limiting nitrogen dioxide levels. This paper aims to provide clinicians and researchers with the necessary information on how to assemble or adapt such a system for research purposes or clinical use in COVID-19 or other diseases in which NO administration might be beneficial.

This simple and highly adaptable system device for the inhalation of high-concentration nitric oxide (NO) gas does not require mechanical ventilators, positive pressure, or high gas flows. Standard medical consumables and a snug-fitting mask are used to safely deliver NO gas to spontaneously breathing subjects.

Un nouveau système de masque d’inhalation pour délivrer des concentrations élevées de gaz d’oxyde nitrique chez les sujets respirant spontanément

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...