Les auteurs tiennent à remercier: Mme Alexia Saunders et Mme Michelle McPhedran d&#39;assistance expérimentale; Mme Helen Feng pour la fabrication de l&#39;électrode, le Dr Penny Allen et le Dr Jonathan Yeoh pour assistance chirurgicale; état-major de la Royal Victorian Eye and Ear Hospital de biologique Centre de recherche sur les soins des animaux, le professeur Rob Shepherd pour des conseils généraux à travers, et le Dr Bryony Nayagam et M. Ronald Leung pour les commentaires critiques sur une version préliminaire du manuscrit. Ce travail a été effectué à l&#39;Institut Bionics et l&#39;Hôpital St Vincent, Melbourne. Le financement a été assuré par la Fondation Ian Potter, les T Reid Charitable Trusts John, et le Conseil australien de la recherche par le biais de son Initiative spéciale de recherche dans Bionic Vision Science et subvention de la technologie pour Bionic Vision Australia (BVA). L&#39;Institut Bionics est reconnaissant du soutien qu&#39;il reçoit du gouvernement de Victoria à travers son Programme de soutien de l&#39;infrastructure opérationnelle.

1. Énucléation et post-fixation Ce protocole suppose que le sujet a été implanté unilatéralement avec un réseau d&#39;électrodes suprachoroïdien. <ol><li> Préparer des solutions postfix dans des bouteilles en verre Schott. <ol class="lalpha"><li> Fixateur de Davidson, 2x 100 ml <ul><li> 2 ml de formol (formaldéhyde à 37%) </li><li> 10 ml d&#39;acide acétique glacial (99,7%) </li><li> 35 ml d&#39;éthanol (98%) </li><li> 53 ml d&#39;eau distillée </li></ul></li><li> 50% d&#39;éthanol, 2 fois 100 ml </li><li> 70% d&#39;éthanol, 2x 100 ml </li></ol></li><li> Transcardiaque perfuser sujet au chaud (37 ° C) du sérum physiologique hépariné suivie par le froid (4 ° C) du formol tamponné neutre (10%). </li><li> Cravate suture au niveau du limbe supérieur (ou dans un endroit qui est éloigné de la matrice suprachoroïdienne) des deux yeux - en ligne avec un muscle grand droit, pour servir de point de repère. </li><li> yeux enucleate, le maintien de toutes les pistes externes de l&#39;œil implanté. </li><li> Placez each œil dans 100 ml de solution fixateur de Davidson et de laisser à la post-fixer à la température ambiante. </li><li> Après 18 - 36 h dans le fixateur de Davidson, transfert à l&#39;éthanol à 50% (à température ambiante) pour 6-8 heures, puis finalement à 70% d&#39;éthanol (à température ambiante). </li><li> Réfrigérer les échantillons à 4 ° C et le magasin jusqu&#39;à ce que la dissection. </li></ol> Globes oculaires intacts et sous pression ont été stockés de cette manière pendant jusqu&#39;à 3 mois sans nuire à l&#39;histologie qui en résulte. 2. L&#39;identification et la cartographie des tissus Le protocole de fixation ci-dessus (étape 1) a rendu le translucide sclérotique et le tableau est maintenant visible - y compris les sites d&#39;électrodes individuelles (Figure 3). <ol><li> Retirez le globe implanté dans de l&#39;éthanol et de l&#39;assiette soigneusement loin excès de tissus, y compris la conjonctive et la capsule de Tenon. Coupez nerf optique à un 2 - longueur de 3 mm (figure 3A). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un colorant histologique marking schéma, l&#39;étiquette des électrodes avec un code de couleur prédéfinie, en prenant soin de ne pas tacher le colorant. </li></ol><ul><li> Nous avons choisi une suite disponible dans le commerce du colorant histologique spécialisé (voir annexe). De petites quantités de colorant ont été soigneusement appliqués avec un pinceau à pointe fine (taille Roymac 00) sur le tissu et on laisse sécher à l&#39;air pour un maximum de 5 min. </li><li> Pour nos besoins, nous avons choisi: vert pour l&#39;électrode active (s) qui a (ont) stimulées au maximum, à des niveaux supraliminaires, pour la durée de l&#39;étude, le rouge pour d&#39;autres électrodes actives, le jaune pour les électrodes plus de retour de diamètre, et bleu de guides supplémentaires et / ou des marquages ​​de distance anatomiques (figures 3B et 3C). </li><li> Quelques essais et erreurs peuvent être nécessaires pour trouver un colorant qui est stable tout au long des étapes ultérieures. Par exemple, dans la figure 4, on peut voir que le colorant vert était plus résistant que le colorant rouge. La dilution du colorant dans de l&#39;éthanol à 70% permet d&#39;améliorer Penet lipidiqueration et le revêtement de tissu. </li><li> Il est utile de croquis ou photographie du globe teint pour référence future. </li></ul><ol start="3"><li> Retour à l&#39;éthanol à 70% pour déshydrater le colorant. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.1 pour le globe de contrôle non implantés. </li><li> Utilisation des fils de suture à partir de l&#39;étape 1.3, aligner l&#39;oeil de commande et l&#39;oeil implanté comme une paire en miroir. </li><li> Placer un gabarit de silicone (avec les mêmes dimensions que l&#39;ensemble d&#39;électrodes) à l&#39;emplacement mis en miroir sur l&#39;oeil de commande que l&#39;implant se trouve sur l&#39;oeil implanté (NB la sclérotique translucide et les marquages ​​de colorant de l&#39;étape 2.2 de permettre une visualisation immédiate de la position de la matrice implantée ). </li><li> Effectuer les étapes 2,2 et 2,3 pour l&#39;oeil de commande, de sorte que chaque emplacement de l&#39;électrode implantée a une paire de commande dans un emplacement anatomique comparables (par exemple un miroir adapté équivalent). </li></ol> 3. Dissection et Embedding <ol><li> Retirez l&#39;ensemble de l&#39;implant de l&#39;oeil et de supprimer l&#39;avant de l&#39;oeil(Y compris la cornée, de l&#39;iris et le cristallin). Retirez le corps vitré de l&#39;œilleton restant (chambre postérieure). </li><li> Disséquer l&#39;oeil implanté en de multiples bandes représentatifs (~ 2 mm d&#39;épaisseur) contenant chacun un sous-ensemble des régions marquées colorant (figure 3D). Notez que l&#39;orientation des bandes doit être choisi pour aider à évaluer divers aspects de la réponse tissulaire à l&#39;implant 7. </li></ol> Il est utile, pour l&#39;avenir, de faire un disque dont les régions colorants sont présents sur chaque bande et leurs positions relatives (et couleurs). <ol start="3"><li> Placer la bande sur son côté dans un bassin peu profond de l&#39;agar liquéfié (4%; 80 - 90 ° C) avec la partie à couper première face vers le bas (figure 3E). </li><li> Une fois la gélose a durci, couper autour de l&#39;échantillon et le placer dans une cassette de tissu soutenu par des inserts en mousse (figure 3F). </li><li> Répétez les étapes 3.1-3.3 pour l&#39;œil de contrôle - takING soin de disséquer miroir appariés bandes. </li><li> Traiter toutes les cassettes via la technique de traitement paraffine standard (automatisé nuit). </li><li> Intégrer tissu traité dans de la paraffine avec le côté à couper premières vers le bas. </li></ol> 4. Coupe et coloration <ol><li> Couper des blocs de paraffine en 5 sections um référant régulièrement aux notes des étapes 2 et 3. </li><li> Recueillir sections de chacune des régions teints et monter sur des lames. </li></ol> La région immédiatement adjacente à chaque spot teint de la sclérotique peut maintenant être évaluée avec certitude que c&#39;était à proximité proche de l&#39;électrode correspondante dans le tableau (figure 4). <ol start="3"><li> Tacher ou effectuer immunofluorescence comme vous le souhaitez. Exemple taches et immunohistochimie de la figure 5 sont les suivantes: H &amp; E Luxol rapide bleu (LFB); violet de crésyl; trichrome bleu de Masson; Schiff acide périodique (PAS); bleu de Prusse station de Perlsà; synthétase anti-glutamine (GS), protéine anti-neurofilaments (NF); anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li> Taches standards et spéciaux ont été réalisés comme détaillé: <ol><li> Coloration H &amp; E a été réalisée selon le protocole fourni par Leica Multistainer bain ensemble ST5020 (Leica Biosystems). </li><li> LFB violette et de crésyl (modifié par 11): <ol><li> Déparaffiner dans 3 bains de xylène (3x 2 min) et 2 changements d&#39;éthanol (100%, 100%) (2x 1 min) et rincer à l&#39;eau du robinet (45 sec). </li><li> Sections hydrate à 95% d&#39;éthanol. </li><li> Lieu en solution LFB 11 à 37 - 42 ° C (la nuit). </li><li> Rincez excès tache avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Lieu de carbonate de lithium dilué (8%) (quelques secondes). </li><li> Différencier dans l&#39;éthanol à 70% (quelques secondes). </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Répétez les étapes 4.4.2.6 à 4.4.2.8, si nécessaire, jusqu&#39;à ce que background est incolore. </li><li> Placer dans une solution d&#39;acétate de crésyl violet de travail à 37 ° C (10 min). </li><li> Ne pas laver à l&#39;eau. </li><li> Déshydrater en 3 changements d&#39;alcool absolu (1x 30 sec, 2x 20 sec) et 3 bains de xylène (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min). </li><li> Mount et lamelle avec DPX. </li></ol></li><li> Trichrome bleu de Masson (modifié par 11): <ol><li> Déparaffiner selon 4.4.2.1. </li><li> Apportez sections à l&#39;eau (2 min). </li><li> Colorer les noyaux utilisant le fer hématoxyline de Weigert (2 min). </li><li> Laver à l&#39;eau du robinet, rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Colorer dans une solution de fuchsine écarlate acide Biebrich (5 min). </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Différencier l&#39;acide phospho-phosphotungstique jusqu&#39;à collagène est rose pâle (6 min). </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Contre-dans le bleu d&#39;aniline (1 min). </li><li> Bien se laver dans de l&#39;acide acétique à 1% (1 min). </li><li> Déshydrater, montage et lamelle comme per 4.4.2.12 et 4.4.2.13. </li></ol></li><li> PAS (modifié par 11): <ol><li> Déparaffiner selon 4.4.2.1. </li><li> Oxyder à l&#39;acide périodique à 1% (15 min). </li><li> Laver à l&#39;eau de l&#39;eau distillée puis courir. </li><li> Colorer dans le réactif de Schiff (15 min). </li><li> Laver à l&#39;eau (5 min). </li><li> Contre-avec Hématoxyline de Harris (1 min). </li><li> Laver rapidement sous l&#39;eau du robinet. </li><li> Différencier dans l&#39;alcool d&#39;acide de 0,5% (1 dip). </li><li> Bien laver à l&#39;eau du robinet. </li><li> Bleu dans l&#39;eau du robinet de Scott (1 min). </li><li> Bien laver à l&#39;eau. </li><li> Déshydrater, montage et lamelle selon 4.4.2.12 et 4.4.2.13. </li></ol></li><li> Bleu de Prusse de Perls tache comme décrit dans 11. </li></ol></li><li> Immunofluorescence a été réalisée comme détaillé: <ol><li> Déparaffiner selon 4.4.2.1. </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée (2 x 5 min). </li><li> Effectuer la récupération de l&#39;antigène à l&#39;aide de tampon citrate à 0,01%, un pH de 6 à 75 à 80 ° C (20 min) uned laisser refroidir dans une solution tampon de citrate à 0,01% (20 min). </li><li> Laver les coupes dans du tampon phosphate salin (PBS) (2x 5 min). </li><li> Perméabiliser la membrane cellulaire dans une solution tampon de lavage (10 minutes). </li><li> Incuber dans une solution de sérum bloc (2 h). </li><li> Incuber sections dans un seul anticorps primaire dilué dans du diluant d&#39;anticorps (10% normal chèvre serum/0.1% Triton X-100/PBS) (une nuit dans le réfrigérateur). Le titre de chaque anticorps primaire utilisé est indiquée dans le tableau 1. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, laver les sections dans une solution tampon de lavage (5x 3 min). De ce point, gardez sections dans l&#39;obscurité. </li><li> Incuber les coupes dans l&#39;anticorps secondaire correspondant à un titre de 1:500 pour une durée déterminée (voir le tableau 1 pour plus de détails). </li><li> Laver les coupes dans une solution tampon de lavage (3x 5 min). </li><li> Incuber les coupes dans DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min). </li><li> Laver les coupes dans une solution tampon de lavage (3x 5 min). </li><li> Mount et lamelle en utilisant FluoresceMilieu de montage NT. </li></ol></li></ol> Les échantillons et les échantillons témoins sont prêts pour comparaison par paires.

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina:+effects+of+electrode+return+configuration.">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).</li><li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil.">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li><li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs.">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li><li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wolff's anatomy of the eye and orbit. , (2001).</li><li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina.">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li><li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis.">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;évaluation de la sécurité de l&#39;implant est une considération primordiale pour les études précliniques. Avant une prothèse rétinienne peut être implanté chez l&#39;homme, il est essentiel de vérifier que cela ne causera aucun préjudice. Cela nécessite une évaluation à la fois de la biocompatibilité des implants 17-23 ainsi que tout dommage potentiel qui pourrait être causé par une stimulation électrique chronique 24-26. Expérience avec des prothèses neurales similaires, tels que l&#39;implant cochléaire, donne un aperçu du large éventail de stimulation et physiques, des paramètres qui ne causent pas de dommages aux tissus 27. Cependant, la rétine a des caractéristiques différentes à d&#39;autres sites d&#39;implantation et les limites de sécurité donc précis (tels que la densité de charge maximum) ne peuvent pas être pris en charge dans des études antérieures dans d&#39;autres systèmes. densités de charge sont les plus élevés dans les sites d&#39;électrodes actives et cela correspond avec le plus grand potentiel de dommages. Par conséquent, une méthode pour localiser le tissu directement adjacentaux électrodes actives individuelles augmenterait considérablement l&#39;utilité de ces études. Le tissu adjacent à des régions spécifiques de l&#39;implant peut également être mis en évidence pour une inspection plus minutieuse. Cette approche ciblée permet moins de sections à analyser, tout en conservant la confiance que le &quot;scénario du pire&quot; a été examiné. La méthode de localisation de colorant scléral décrit ici a été testé avec du silicone en forme de main et moulé / Pt matrices d&#39;électrodes 28-30. Il a été utilisé avec couche mince polyamide tableaux 7,31 et aussi mince pellicule de silicone / Pt tableaux 32. Certaines études prothèses rétiniennes employées électrodes &quot;puce en forme&quot; avec implantations intrascléral 33. La présente technique devrait être efficace pour évaluer ce type de matrices d&#39;électrodes. Regard félin avec sclérotique mince (épaisseur au pôle postérieur 90 - 200 um) a permis la visualisation des électrodes individuelles dans un tableau. Cependant, même si electro individueldes n&#39;étaient pas visibles, leurs positions peuvent être facilement déduites en utilisant un modèle de silicone lorsque le contour du tableau peut être vu (similaire à celui utilisé dans l&#39;étape 2.6). La cartographie colorant limite la nécessité d&#39;obtenir des coupes de tissus non pertinentes car seuls les sections avec le colorant présent sont obtenus. La possibilité de déduire avec précision la position de l&#39;électrode permet non seulement l&#39;analyse histopathologique pertinentes et une plus grande puissance statistique, mais a un impact majeur sur la gestion du temps et de l&#39;argent en réduisant la quantité de lames et les lames utilisées ainsi que le coût du travail. L&#39;utilisation d&#39;un colorant qui est adhérente et peut résister à la transformation du tissu, tout en étant également visible dans les coupes de tissus non colorées est importante examen initial. La connaissance de la localisation du colorant et de l&#39;orientation du tissu au cours de la dissection et intégrant assiste le processus de coupe. Cela comprend les orienter correctement le bloc de parvenir à une section qui n&#39;est pas coupé obliquement et donne un representati pleinsur du tissu. Il est donc important que la personne qui effectue la coupe est présent au moment de l&#39;application de la teinture, la dissection et l&#39;intégration. Le protocole global est robuste aux modifications mineures, notamment avec des timings de fixation. Cependant, la dissection de l&#39;oeil et les étapes de marquage colorant sont des opérations délicates qui bénéficient d&#39;une bonne dextérité manuelle pour éviter d&#39;endommager le spécimen. Alors que le fixateur de Davidson s&#39;est avéré efficace pour réduire les artefacts détachement de la rétine à proximité d&#39;un implant, il n&#39;empêche pas les dommages mécaniques directe lors de la dissection. Le fixateur de Davidson était difficilement compatible avec certaines procédures histologiques et immunohistochimiques spéciales. Par conséquent, il était nécessaire de modifier / optimiser ces étapes comme détaillé ci-dessus. Les changements progressifs dans les temps et les concentrations coloration ont été faites jusqu&#39;à ce que le résultat optimal a été atteint - pour plus de détails, reportez-vous aux documents supplémentaires. Quantification de la rétinehistologie reste problématique. La rétine est non homogène et à la fois l&#39;épaisseur et la variation de la densité des cellules avec l&#39;augmentation de distance depuis la zone centralis 34,35. Par conséquent, les tissus voisins dans l&#39;oeil implanté ne peut pas être utilisé pour des comparaisons et un œil de contrôle est utilisé à la place. Par paires de chaque section correspondant à l&#39;œil de commande nous donne une comparaison statistique plus puissant des changements pathologiques; résultats d&#39;efficacité et de sécurité avec les prothèses rétiniennes sont mieux évaluées en comparant les yeux compagnon dans un sujet 36. Des précautions particulières doivent être prises pour minimiser coupe oblique car cela affecterait la quantification. En résumé, les méthodes décrites ci-dessus ont considérablement amélioré notre analyse histopathologique, qui à son tour a donné lieu à un flux de travail préclinique plus efficace. Les résultats des études précliniques utilisant ces méthodes conduit directement à un essai clinique dans lequel 3 patients atteints de RP ont été implantés en toute sécurité avec suprachoroidal prothèses rétiniennes. Ces méthodes sont utiles à la fois pour les stimulateurs rétiniens et autres implants oculaires où la réponse pathologique à l&#39;implantation à long terme doit être évalué. Cette méthode a donné des avantages intéressants pour le maintien de la cytoarchitecture et l&#39;enregistrement de la pathologie de régions d&#39;intérêt sur l&#39;implant. Bien que n&#39;étant pas spécifiquement testées, une modification de ces procédures peut être utilisé dans d&#39;autres espèces et d&#39;autres emplacements anatomiques, en particulier là où un tableau est implanté superficiellement.

Prothèses rétiniennes pourraient bientôt devenir interventions cliniques utiles pour le traitement de diverses formes de perte de vision sévère. Certaines conditions, telles que la rétinite pigmentaire (RP), conduisent à la dégénérescence généralisée des photorécepteurs de l&#39;œil, ce sont les cellules responsables de la transduction de la lumière en signaux neuronaux. Cependant, certaines cellules dans d&#39;autres couches de la rétine restent et sont des cibles potentielles pour la stimulation électrique avec une prothèse rétinienne 1. Les premiers résultats des essais cliniques humains ont été prometteurs pour matrices d&#39;électrodes implantées dans le epiretinal 2,3, 4,5, sous-rétinien et intrascléral 6 emplacements. Ces dispositifs sont constitués de matériaux différents ayant des formes différentes, mais ils utilisent tous des impulsions électriques pour activer les neurones viables restantes de la rétine en vue de créer des percepts visuels. Notre groupe plus large (Bionic Vision Australia) a développé un implant rétinien qui a progressed pour une étude clinique pilote avec 3 patients atteints de RP implantés avec des réseaux d&#39;électrodes suprachoroïdien (Clinical numéro d&#39;essai: NCT01603576). figure 1A montre ce prototype suprachoroïdien prothèse rétinienne. La sécurité des patients est primordiale dans les études cliniques et, par conséquent, avant de commencer les essais humains, nous avons effectué des essais de toxicité aiguë et chronique extensive dans des modèles précliniques (figure 1B). Évaluations histopathologiques étaient indispensables pour affiner les procédures chirurgicales, parcourir la conception de l&#39;électrode, et, finalement, d&#39;établir l&#39;innocuité de l&#39;implant. Afin de maintenir un flux de travail efficace en queue d&#39;aronde avec les pratiques de pathologie clinique standard, une technique d&#39;enrobage de paraffine a été employée. Il était également souhaitable d&#39;utiliser des méthodes de coloration comparables aux normes cliniques, tels que l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E), qui sont facilement interprété par les pathologistes. Nous voulions aussi une technique qui pourrait être adapté pour des analyses immunohistochimiques, enafin de faciliter une évaluation plus poussée cellulaire des tissus. La biocompatibilité des matériaux d&#39;implants, et la sécurité de la stimulation électrique chronique, doit être évaluée avec soin. Il est important d&#39;être en mesure d&#39;examiner l&#39;histopathologie du tissu oculaire à proximité des électrodes de stimulation individuels au sein de la matrice. Cependant, les tableaux devaient être enlevés avant le traitement des échantillons afin qu&#39;ils puissent être testés, et parce que leurs composants métalliques ne pouvaient pas être facilement sectionné. En conséquence, notre préparation des tissus établie ne permet pas la localisation et la cartographie des tissus par rapport aux électrodes implantées 7. En plus de l&#39;absence d&#39;une méthode de localisation des tissus, la fixation à base de formaldéhyde standard et les techniques de transformation ont donné lieu à des artefacts répandues et décollement de la rétine due à la contraction différentielle des différentes couches de l&#39;œil (Figure 2). En raison de la non-homogénéité de til rétine, il était difficile d&#39;établir des comparaisons valables avec le tissu de contrôle, en particulier pour des mesures quantitatives. Ces limitations combinées compliquées évaluations précises des dommages potentiels causés par nos réseaux implantés. Ici, nous présentons de nouvelles techniques pour surmonter ces limitations. Nous avons modifié les techniques de fixation et le traitement des yeux spécialisées 8-10 pour maintenir la compatibilité avec l&#39;histologie à base de paraffine. Nous avons modifié les taches histologiques et immunohistochimiques standard pour donner des résultats comparables, basée sur les commentaires des pathologistes cliniques. Après avoir rendu le translucide de tissu scléral, un code de couleur à base de colorant a été utilisé pour marquer le tissu oculaire adjacente à chaque électrode individuelle, avant de retirer la matrice de l&#39;espace suprachoroïdien. Par le marquage du réseau d&#39;électrodes et les sites d&#39;électrodes individuelles, les échantillons peuvent être prélevés avec précision à partir des régions adjacentes d&#39;électrodes. Échantillons appariés pourraient être recueillies auprès èmee oeil de commande, afin de faciliter les comparaisons par paires.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

Avec le développement récent de prothèses rétiniennes, il est important de développer des techniques fiables pour évaluer la sécurité de ces dispositifs dans les études précliniques. Toutefois, la fixation standard, la préparation et les procédures d&#39;histologie automatisés ne sont pas idéales. Nous décrivons ici les nouvelles procédures d&#39;évaluation de la santé de la rétine directement adjacent à un implant. Prothèses rétiniennes disposent matrices d&#39;électrodes en contact avec les tissus oculaires. Les méthodes précédentes n&#39;ont pas été en mesure de localiser spatialement le tissu oculaire adjacent aux électrodes individuelles au sein de la matrice. En outre, le traitement histologique standard se traduit souvent par détachement artifactual brut des couches de la rétine lors de l&#39;évaluation yeux implantés. Par conséquent, il a été difficile d&#39;évaluer les dégâts localisés, s&#39;il est présent, causée par l&#39;implantation et la stimulation d&#39;un réseau d&#39;électrodes implanté. Par conséquent, nous avons développé une méthode pour identifier et localiser le tissu oculaire à côté implanté electrodes en utilisant une (code couleur) système de marquage colorant, et nous avons modifié une technique de fixation d&#39;oeil à minimiser décollement de la rétine artefact. Cette méthode a également rendu la sclère translucide, ce qui permet la localisation des électrodes individuelles et des pièces spécifiques d&#39;un implant. Enfin, nous avons utilisé un témoin apparié pour augmenter la puissance des évaluations histopathologiques. En résumé, cette méthode permet de discrimination et d&#39;évaluation fiable et efficace de la cytoarchitecture rétinienne dans un œil implanté.

La figure 4 montre une section représentative résultant de la coupe de l&#39;échantillon représenté dans la figure 3. La section a été coupé à 5 um d&#39;épaisseur et colorées avec H &amp; E selon les protocoles décrits ci-dessus. La forme brute de la bande d&#39;échantillon est conservé avec des artefacts de tissus différentielles minimales (figure 4A). Les deux marques de teinture étaient visibles sur la sclérotique, bien que le colorant vert a mieux résisté que le rouge (figure 4B). Les couches de la rétine n&#39;ont pas été artifactually détachés et la morphologie rétinienne est préservée (figure 4C). Le tissu rétinien à côté des marques de colorant, ce qui correspond à l&#39;emplacement des électrodes dans le réseau, peut être aisément identifié. La figure 5 montre une coloration représentant spécial et immunohistochimie de coupes de tissus préparées selon le protocole en vigueur. Reportez-vous à la figure 5 caption et complémentaire Matériaux pour plus de détails sur les taches spécifiques et les modifications apportées à leur usage. Post-modification, ces taches et immunohistochimie étaient équivalentes aux normes établies - comme vérifié par les pathologistes. <table border="1"><tbody><tr><td> Type d&#39;anticorps primaire et titre (entre parenthèses) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> Type d&#39;anticorps secondaire et titre (entre parenthèses) </td><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Alexa Fluor 488 </td></tr><tr><td> Durée de l&#39;incubation de l&#39;anticorps secondaire </td><td> 1 heure </td><td> 2 heures </td><td> 45 min </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Type d&#39;anticorps, Titre et durée de l&#39;étiquetage. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> Figure 1. SuprachoroIDAL Prototype réseau d&#39;électrodes. A) Macro photographie d&#39;un tableau moulé de qualité clinique. B) Photomicrographie d&#39;un tableau préclinique à la main. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> Figure 2. Ancien histologie rétine. Des méthodes histologiques standard ont été utilisés pour préparer ceux-ci, H &amp; E taché, sections d&#39;un oeil implanté avec un réseau d&#39;électrodes suprachoroïdien. A) Une section orthogonale à travers la cavité de la matrice d&#39;électrodes (représenté par une étoile). La rétine est détaché du tissu oculaire externe. Cela est particulièrement évident en dessous de la région implantée (flèche). Il est impossible de déterminer quelle partie de la rétine était à côté de chaque électrode de la matrice. Scalebar = 1 mm. B) A plus fort grossissement de la région encadrée dans le Panneau A. Il existe plusieurs, régulièrement espacés, des artefacts dans la rétine layers (flèches), ainsi que les principaux détachement de la couche tapetum (la couche réfléchissante en regard félin). Scalebar = 100 um. C) A plus fort grossissement de la région encadrée dans le panneau B. Sous-indiqué les segments externes des photorécepteurs, ainsi que l&#39;épithélium pigmentaire, qui restent intacts, ce qui suggère que le détachement était un effet secondaire artefact du traitement, plutôt que d&#39;être causée par un traumatisme ou in vivo pathologie. SCALEBAR = 20 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> Figure 3. La localisation et la dissection de l&#39;électrode-Adjacent tissus. J.-C.) High Dynamic Range photographies macro d&#39;un œil énucléé, avec un réseau d&#39;électrodes suprachoroïdien in situ. A) poste fixe avec fixateur de Davidson, et avant l&#39;enlèvement de tableau, la sclérotique translucide permet de visualiserles électrodes individuelles dans le tableau (exemple unique indiquée par la flèche). B) Les électrodes sont marqués avec une couleur de teinture prédéfini. C) Marquage Dye espacement régulier de points de repère anatomiques sont utilisés pour maintenir la cohérence entre les expériences. D) Après le retrait de l&#39; tableau, l&#39;œil est découpé par main dans les bandes de l&#39;échantillon. Les flèches colorées indiquent deux des sites adjacents d&#39;électrodes sur la sclérotique. Pointillé jaune indique plan de coupe. E) Macro-photo de bande d&#39;échantillon intégré dans un bloc de gélose. F) Macro photographie de la bande d&#39;échantillon agar-embed partir du panneau E, découpé et placé dans une cassette d&#39;intégration soutenu par des coussinets biopsie mousse pour minimiser le mouvement de la section en cours de traitement. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> Figure 4. New histologie rétine. </s<html> trong&gt; La bande de l&#39;échantillon ci-dessus (à partir de la figure 3D), contenant la poche d&#39;électrode, a été inclus en paraffine, sectionnés à 5 um et colorées avec H &amp; E. A) vert et régions teints rouges (indiqués par des flèches, identique à la figure 3D) sont visibles dans une section prise au niveau de la ligne en pointillés dans la figure 3D jaune. Barre d&#39;échelle = 1.000 um. La rétine n&#39;est pas détaché, ni au-dessous de la poche de tableau ni de loin. B) La région encadrée de Panel A avec un colorant rouge et vert visible indiqué par les flèches, et la rétine intacte tout au long. Barre d&#39;échelle = 500 C) La région encadrée de Groupe B, montrant l&#39;intact, ci-joint, la rétine à côté du colorant vert um.. Barre d&#39;échelle = 50 um. Sachant que la localisation du colorant indique la position d&#39;une électrode, on peut évaluer en toute confiance le tissu rétinien adjacent de dommages, le cas échéant, provoqué par une stimulation électrique. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> Figure 5. Des exemples de cytohistochemistry rétinienne modifié en utilisant des colorations spéciales et immunofluorescence. L&#39;utilisation de fixateur de Davidson, par opposition à des techniques standard de formol de fixation, les modifications requises pour les protocoles de coloration habituelles, telles que décrites dans le texte du protocole principal. Les pathologistes ont confirmé que ces modifications ont entraîné une coloration équivalente. A) H &amp; E haematoxylin taches noyaux de cellules violettes, tandis que éosine cytoplasme de la cellule, collagène et de soutien des tissus de diverses nuances de rose. B) LFB taches bleues myéline alors que la contre-coloration de violet de crésyl peut être utilisé pour . identifier les cellules ganglionnaires par coloration des corps de Nissl dans le bleu perikaryon et mettant en évidence les cellules satellites qui entourent les cellules C) trichrome bleu de Masson; l&#39;écarlate de Biebrich-fuchsine acide solution taches muscle fibres rouge, tandis que les taches bleues aniline le collagène, dans ce cas, la sclérotique, bleu D) PAS;. composants de la glycoprotéine de membrane basale et les composants du tissu conjonctif sont colorées violet, tandis que le haematoxylin contre-colorants noyaux de cellules pourpre E) bleu de Prusse de Perls.; au niveau du site de l&#39;hémorragie, la formation d&#39;hémosidérine de globules rouges dégradées et la libération des complexes de fer produit une couleur pourpre tandis que l&#39;addition de teintures rouge neutre lysosomes rouge F) GS;. ce neurotransmetteur enzyme dégradant trouvé dans les cellules de Müller 13 (vert ), peut être vu s&#39;étendant dans les deux sens avec les corps cellulaires Müller dans la couche nucléaire interne et endfeet cellulaire Müller formant la membrane limitante interne G) NF-200;. cette chaîne lourde de protéine du cytosquelette (vert) trouvée dans le soma et les processus cellulaire , liaisons transversales avec d&#39;autres neurofilaments pour maintenir la structure des neurones 14,15. Ganglioncellules et leurs axones peuvent être vus dans la couche de cellules ganglionnaires et la couche de fibres nerveuses, tandis que les axones des cellules horizontales situées à la frontière extérieure de la couche nucléaire interne de la rétine félin, sont également mises en évidence. Contre-coloration au DAPI (bleu) permet la visualisation des couches de la rétine H) GFAP;. Cette protéine du cytosquelette (rouge) ont proliféré dans les cellules de Müller et les astrocytes pendant gliosis 16, peut être vu en alignant la couche de fibres nerveuses avec les cellules de Müller formant des extensions minces par l&#39;intérieur vers couches de la rétine externe. Contre-coloration au DAPI (bleu) permet de visualiser les couches de la rétine. Barre d&#39;échelle = 50 um dans tous les panneaux. La rétine interne est affiché en haut de chaque image; la rétine externe est indiqué au bas de chaque image, à l&#39;exclusion Groupe E, ce qui montre réaction subscleral.

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Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Techniques de visualisation cytoarchitecture rétine directement adjacent aux électrodes individuelles au sein d&#39;un stimulateur rétinien.

Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l&#39;analyse histopathologique localisée

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K vues.  Bionics Institute. Techniques de visualisation cytoarchitecture rétine directement adjacent aux électrodes individuelles au sein d'un stimulateur rétinien.

Vidéo: Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Comment mesurer pliant corticale à partir d&#39;images IRM: un tutoriel pas-à-pas à calculer l&#39;indice gyrification locale

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Recherche

Médecine

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Les techniques de traitement des yeux implantés avec une prothèse rétinienne pour localisée histopathologique Analyse: Partie 2 épirétinienne implants avec des bords de la rétine

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A l&#39;étape par le protocole de l&#39;étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modèle aigu rétinienne pour l&#39;évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Méthodologie pour l’Induction de l’expectoration et traitement en laboratoire

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Customizing a Cryolite Glass Prosthetic Eye

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present manuscript demonstrates this long-forgotten technique in detail. This manuscript shows some major advantages of manufacturing prosthetic eyes using cryolite glass in comparison to poly(methyl methacrylate) (PMMA). These advantages include a lighter weight of the prosthesis, higher levels of patient satisfaction, and only one appointment necessary for the customized manufacturing. Potential risk of breakage seems not to be a critical disadvantage for glass prosthetic eye wearers. However, in some patients, manufacturing a well-fitting prosthetic eye is not possible or reasonable due to anophthalmic socket complications such as post nucleation socket syndrome, scarred fornices, or an orbital implant exposure. This article gives ophthalmologists a better insight into ocularistic care in order to improve the essential interprofessional collaboration between ocularists and ophthalmologists.

This manuscript shows each step of customizing a cryolite glass prosthetic eye including some major advantages of the use of cryolite glass for manufacturing an eye prosthesis compared to poly(methyl methacrylate). In addition, this manuscript gives ophthalmologists better insight into the ocularistic care that could improve interprofessional collaboration.

Personnalisation d'un œil prothétique en verre cryolite

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Une méthode d’optimisation du processus de Zanba-Stir-Fried Tiebangchui

Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in northwest China. However, many cases of poisoning have occurred because of TBC's intense toxicity and because its therapeutic and toxic doses are similar. Therefore, finding a safe and effective method to reduce its toxicity is an urgent task. A search through the Tibetan medicine classics shows that the processing method of TBC stir-fried with Zanba was recorded in the "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". However, the specific processing parameters are not yet clear. Thus, this study aims to optimize and standardize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC.
First, a single-factor experiment was conducted on four factors: the slice thickness of TBC, amount of Zanba, processing temperature, and time. With monoester and diester alkaloid contents in Zanba-stir-fried TBC as indexes, CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method was used to optimize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC. The optimized processing conditions of Zanba-stir-fried TBC were a TBC slice thickness of 2 cm, three times more Zanba than TBC, a processing temperature of 125 &#176;C, and 60 min of stir-frying. This study determined the optimized and standard processing conditions for the usage of Zanba-stir-fried TBC, thus providing an experimental basis for the safe clinical use and industrial production of Zanba-stir-fried TBC.

Pleins feux sur l’auteur : Optimisation de la technologie de traitement pour Tiebangchui avec Zanba sur la base de CRITIC combiné à la méthode de surface de réponse de Box-Behnken  

The present protocol describes an efficient and standard detoxification processing method for Zanba-stir-fried Tiebangchui using CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method.

Optimisation de la technologie de traitement pour Tiebangchui avec Zanba basée sur CRITIC combinée à la méthode de surface de réponse de Box-Behnken

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in ...