Nous tenons à remercier Brandon Hassett et Carlos Ortiz pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par la NSF subventions IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS et-0925561 au Dr Michael Kolomiets, et par l&#39;Institut national de l&#39;USDA pour l&#39;alimentation et l&#39;agriculture (NIFA), l&#39;amélioration des plantes et de l&#39;éducation AFRI Grant # 2010-85117 -20539 à MM. Seth Murray, Thomas Isakeit, et Kolomiets Michael.

1. Essais biologiques grain de maïs <ol><li> Deux semaines avant, la culture des champignons pathogènes sur Potato Dextrose Agar (PDA) à 28 ° C. </li><li> Sélectionnez les noyaux avec la taille et de forme semblables, de préférence aplatie afin qu&#39;ils jeter au niveau du fond des flacons de dosage biologique, et les placer dans des tubes de 50 ml de faucon. Noyaux sélectionnés doivent avoir été produites simultanément dans un même environnement pour assurer l&#39;âge de semences ou de composition analogue métabolite. </li><li> Surface stériliser les noyaux en secouant tubes à température ambiante pendant 5 minutes avec de l&#39;éthanol 70%, 1 minute à l&#39;eau stérile, et à 10 minutes avec de l&#39;hypochlorite de sodium à 6%. Rincez, trois fois, pendant 5 minutes à chaque fois, avec de l&#39;eau stérile tout en secouant continue. Séchez noyaux sur des serviettes en autoclave. </li><li> Pour faciliter l&#39;infection par Aspergillus flavus, créer une petite plaie sur l&#39;embryon à côte avec une aiguille G 18 à la profondeur de 0,5 cm. Cependant, dans notre expérience une grande blessure est nécessaire pour Fusarium verticillioides infection. Therefore, utilisez une lame de rasoir pour couper dans l&#39;embryon à côte à une profondeur de 0,5 mm. </li><li> Préparer suspension de l&#39;inoculum en grattant les plaques de culture dans environ 5 ml de autoclavé 0,01% de Tween-20 une solution pour libérer des spores et mycélium retirer par la gravité de filtrage à travers au moins 4 couches de gaze stérilisé à l&#39;autoclave. Calculer la concentration de spores avec hémocytomètre et ajuster à 10 6 spores / ml pour A. flavus ou F. verticillioides. Si vous utilisez d&#39;autres espèces de pathogènes ou de l&#39;hôte, il est important d&#39;évaluer les concentrations d&#39;inoculum pour l&#39;infection appropriées. </li><li> Créer une chambre d&#39;humidité dans un récipient en plastique (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) bordée de cinq feuilles de papier essuie-tout et 100 ml d&#39;eau stérile. Chambre n&#39;est pas à l&#39;eau ou à l&#39;air et l&#39;eau supplémentaire devrait être ajoutée tout au long de l&#39;expérience pour garder des serviettes en papier humide. </li><li> Placer les quatre noyaux dans une fiole de 20 ml autoclavé à scintillation en verre et d&#39;enregistrer leur masse. Inoculer avec 200 ul suspension de spores,bouchon, et le vortex de noyaux enrober avec la suspension. Desserrer les écrous de permettre un échange librement l&#39;air et le lieu dans la chambre de l&#39;humidité. </li></ol> Remarque: Pour les graines ou les champignons autres que ceux décrits dans ces méthodes, la quantité d&#39;inoculum requis peut être différente et doit être déduit empiriquement. <ol start="8"><li> Incuber les noyaux sous une photopériode 12-h-light/12-h-dark à 28 ° C pendant 7 jours ou jusqu&#39;à ce que désiré. </li></ol> 2. Énumération conidies <ol><li> Après la période d&#39;infection, ajoutez 5 ml d&#39;autoclave 0,01% de Tween-20 dans des flacons à scintillation contenant des grains infectés et vortex à fond pendant 1 minute. </li><li> En utilisant une pointe de gros calibre pipette, diluer immédiatement en transférant deux séparés 200 aliquotes de suspension de spores dans des tubes Eppendorf 2,0 ml contenant 1,8 ml de 0,01% de Tween-20 (ou diluer au besoin en fonction de l&#39;infection). </li><li> Dénombrer chaque partie aliquote de 200 ul à deux reprises avec un hémocytomètre 4et comparer les niveaux de conidies entre les traitements. </li></ol> 3. Quantification par l&#39;aflatoxine <ol><li> Ajouter les grains de 1 échantillon à 50 ml tasse de mélangeur avec 20 ml de méthanol à 80% et de 0,05 g de NaCl, la couverture et de mélange à haute vitesse pendant 1 min. </li><li> Placer un papier filtre plissé sur un navire de collecte propre et verser dans le filtre extrait. </li><li> Transférer 10 ml du filtrat dans un récipient propre, ajouter 20 ml d&#39;eau distillée H 2 O, et bien mélanger. </li><li> Échantillon de filtre à travers un filtre 1,5 um en microfibres de verre dans une tasse propre. </li><li> Appliquer une ml d&#39;extrait filtré pour colonne d&#39;essai AFLA et, à l&#39;aide d&#39;air comprimé, forcer l&#39;extrait filtré à travers la colonne à une vitesse de 1-2 gouttes par seconde jusqu&#39;à ce vidés. </li><li> Laver la colonne deux fois avec 1 ml d&#39;eau distillée H 2 O et de passer à travers la colonne à 1-2 goutte / seconde jusqu&#39;à ce que l&#39;air qui en sort. </li><li> Colonne Eluer avec 1ml de 100% méthanol de qualité HPLC à un 1-2 goutte / seconde vitesse collectées dans une cuve en verre. </li><li> Ajouter1 ml de Developer test AFLA à éluat et bien mélanger. Cuvette en place fluorimètre calibré et lire à 60 sec. </li></ol> Remarque: Lorsque vous utilisez le protocole Aflatest FGIS, la mesure de la fluorimètre est calculée sur la base environ 50 grammes d&#39;échantillon initiales extraites dans 100 ml. Si vous considérez la dilution de l&#39;échantillon avec de l&#39;eau, le ml 1 appliqué à une colonne représente 0,166 grammes d&#39;échantillon. Ainsi, lors de la modification du protocole, vous devez prendre en compte les différences de taille de l&#39;échantillon et la solution d&#39;extraction initiale. Par exemple, 2 grammes de grains sont extraits dans 20 ml de méthanol à 80%. C&#39;est 0,1 grammes par ml. Lorsque 1 ml de l&#39;échantillon est mélangé avec 2 ml d&#39;eau, la proportion de l&#39;échantillon dans le liquide est 0,033 grammes par ml. Si cet échantillon donne une lecture fluoromètre de 100 ppb, la concentration réelle est basée sur la proportion de l&#39;échantillon à 0,166, c&#39;est-à-ppb = (0,166 gramme X 100 ppb) / 0,1 gramme), ou 166 ppb. Pour l&#39;aflatoxine autre quantificationcation des méthodes, voir la référence 7. 4. Fumonisine B1 (FB1) Analyse <ol><li> Lorsque champignon est cultivé sur des grains de maïs, d&#39;extraire des échantillons de nuit avec 10 ml d&#39;acétonitrile / eau (50/50, v / v) à température ambiante sans agitation. Par la suite, mélanger l&#39;extrait (2 ml) avec de l&#39;eau déminéralisée (6 ml), et appliquer ce mélange (8 ml) directement à l&#39;extraction en phase solide C-18. </li><li> Avant de charger l&#39;échantillon, condition sine qua non de la colonne en phase C-18 solide d&#39;extraction par rinçage avec 2 ml d&#39;acétonitrile suivie par 2 ml d&#39;eau. </li><li> Après chargement de l&#39;échantillon, la colonne est lavée avec 2 ml d&#39;eau suivi par 2 ml d&#39;acétonitrile / eau (15/85, v / v). Exemple de l&#39;analyse HPLC (contenant FB1) est élue avec 2 ml d&#39;acétonitrile / eau (70/30, v / v). </li><li> Dérivatiser FB1 avec o-phtaldéhyde (OPA) par le transfert de 0,1 ml de la éluat de la colonne à un flacon contenant 0,1 ml de tampon borate (0,05 M borique acid/0.05 de sodium M borate [50/50, v / v], pH 8,5) et 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml dans l&#39;acétoneitrile avec 0,5% - mercaptoéthanol). </li><li> Arrêter la réaction après 10 minutes en ajoutant 0,5 ml d&#39;acide acetonitrile/0.01 M borique (40/60, v / v). </li><li> Analyser FB1 sur un Shimadzu HPLC LC-20AT système équipé d&#39;une colonne analytique Zorbax ODS (4,6 à 150 mm) et une longueur d&#39;onde variable Shimatzu RF-10Axl détecteur de fluorescence (excitation 335 nm / émission 440 nm). </li><li> Un gradient linéaire est utilisé (solvant A: acetonitrile/0.1 M phosphate de sodium (40/60), pH 3,3; solvant B: acétonitrile / phosphate de sodium 0,1 M (60/40), pH 3,3) et le programme de gradient est la suivante: Un 100%. à 100% de B en 10 min, B 100% pendant 5 minutes </li><li> Analyser FB1 normes par HPLC, et les mesures de surface de pic sont utilisées pour générer la courbe standard. Par la suite, de quantifier le niveau FB1 dans un échantillon en comparant les zones de pointe avec FB1 courbe standard. </li></ol> 5. L&#39;ergostérol Analyse <ol><li> Culture du champignon sur les grains de maïs pendant 7-14 jours. </li><li> Après la période d&#39;incubation, ajouter 10 ml de chloroforme: methAÑOL (2:1, v / v) dans chaque flacon. Une fois ajouté, secouez bien et échantillons puis incuber les flacons dans l&#39;obscurité, à température ambiante pendant 24 heures. </li><li> Après 24 heures, centrifuger les échantillons, et de recueillir le surnageant et le filtrer à travers une membrane de nylon 0,45 um. </li><li> Injecter l&#39;échantillon directement dans un Shimadzu HPLC LC-20AT système équipé d&#39;un 4,6 U ODS C18 (200 A, 250 ± 4,6 mm) et un Shimadzu SPD-20A UV / VIS détecteur réglé pour surveiller à 282 nm. </li><li> Utilisation du méthanol (100%) à un débit de 1,5 ml / min, tel que la phase mobile. Déterminer la quantification de l&#39;ergostérol dans les échantillons en comparant les zones de pointe d&#39;échantillons à une courbe standard générée à partir de HPLC ergostérol. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Après ensemencement et l&#39;incubation dans une chambre humide pendant deux à trois jours, l&#39;apparition de champignons commencent à apparaître sur les grains. Sept jours après le traitement, la croissance végétative des plantes traitées devraient être clairement visibles, tout en recueillantcontrôles électroniques des simulacres devrait être infectés (figure 1B, en haut). Les périodes de plus d&#39;incubation sont propices à la croissance végétative plus abondante (figure 1B, en bas). Dans les conditions décrites dans les présentes (figure 2G), A. flavus de type sauvage NRRL 3357 affichaient des valeurs maximales de la colonisation, l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, et la production des conidies à 8, 6, et 8 jours, respectivement (figure 2, AC). Toutefois, lorsque la contamination par les mycotoxines et conidiation ont été comparés par unité de l&#39;ergostérol, les plus grands niveaux ont été observés à 4 et 6 jours, respectivement (figure 2, DE). Figure 2F résume ces fongiques biomasse dépendant de valeur maximale observations. Fait intéressant, entre 4-6 jours après l&#39;inoculation, les noyaux subissent une dégradation acide nucléique, comme on le voit par l&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons sur l&#39;évolution temporelle (Figure 2H, en bas). Plusieurs études, y compris la nôtre, ont examined F. verticilliodies infection sur les grains de maïs 2,8,9,10,11,12 et utilisé avec succès 7-13 jours que le temps des points d&#39;observations. En utilisant les méthodes décrites ici, les fumonisines niveaux allant de 3,500-8,000 ng / g gamme noyau 4,13 et niveaux d&#39;ergostérol de 5.000-10.000 ng / g de noyau 14,13. Figure 3 montre des pics représentatifs pour les fumonisines (en haut) et l&#39;ergostérol (en bas ) à partir de chromatogrammes HPLC. Mesure de l&#39;ergostérol peut également être réalisée via 15 des spectres d&#39;absorption. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme pour la quantification de la biomasse fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines et des résultats représentatifs pour la croissance végétative à partir de bio-essais du noyau. Diagramme A) décrivant la méthode décrite pour la quantification des paramètres fondamentaux biologiques utilisés pour évaluer la pathogénie des champignons sur les grains de maïs. B) Représentantrésultats pour bioessais noyau. Haut, A. flavus (NRRL3357) sur la croissance végétative des grains de maïs dans l&#39;arrière-plan B73 génétique. Les graines ont été inoculés avec 200 ul de 10 6 spores / mL et photos ont été prises 7 jours après l&#39;inoculation. Bas, F. verticillioides inoculés dans les noyaux B73 fond après l&#39;infection de 13 jours. Noyaux ont été inoculés avec 200 pi de 10 6 spores / mL. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Figure 2. Bioessai Aspergillus flavus noyau temps-cours. B73 noyaux ont été inoculés avec 200 pi de 10 6 spores / ml Aspergillus flavus suspension de conidies et incubées pendant 2-8 jours (G). Toutes les valeurs ont été déterminées à partir de la moyenne du poids sec de 4 noyaux (n = 3-4; moyenne ± SE). A) La colonisation (basé sur l&#39;ergostérol), (B) l&#39;aflatoxine, et (C) ont été quantifiées à l&#39;aide conidiation méthodes décrites ci-dessus. E) l&#39;aflatoxine et (F) conidiation sont affichésen fonction de la biomasse fongique, telle que mesurée à h ergostérol. F) Les valeurs maximales pour l&#39;ergostérol, l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, et conidiation en fonction de la biomasse fongique - les valeurs maximales pour chaque quantité observée a été fixé à 100%. (H) 1 mg par voie d&#39;ARN total de temps bien sûr. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Figure 3. Représentant chromatographie liquide haute performance (HPLC) chromatogrammes pour les fumonisines B1 (en haut) et l&#39;ergostérol (en bas) isolée à partir de grains infectés par Fusarium verticillioides (M3125).

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	<li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals.">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li><li>Gao, X., Shim, W. -. B., G&#246;bel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin.">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. 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Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Je n&#39;ai rien à communiquer.</p

<p class="jove_content"&gt; Les méthodes décrites ici ont été largement testées et éprouvées pour être robuste dans la génération des résultats quantifiables pour la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines. En outre, ces méthodes devraient être applicables aux semences des espèces végétales autres qui sont sensibles à la contamination par des champignons (par exemple les arachides mycotoxigéniques, blé, coton, pistaches, etc.) Pour compétentes analyses d&#39;interaction plante-pathogène, il est...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> Potato Dextrose Agar </td><td> Fisher Scientifique </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientifique </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Récipient d &#39;incubation en plastique </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Mixer </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm Filtres plissés </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 microfibres de verre pm </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Colonne de test afla </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla test pour un développeur </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acétonitrile </td><td> Fisher Scientifique </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> Colonne C-18 extraction en phase solide (SPE Prep septembre colonne C18) </td><td> Fisher Scientifique </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-phtalaldéhyde (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79760-5g </td></tr><tr><td> L&#39;acide borique </td><td> Fisher Scientifique </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Le borate de sodium </td><td> Fisher Scientifique </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoéthanol </td><td> Fisher Scientifique </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (pompe) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> CL-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS colonne (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl détecteur de fluorescence </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientifique </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 normes </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> Filtre 13 mm seringue à 0,45 um membrane de nylon (HPLC) </td><td> Pall Life Science </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> L&#39;ergostérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45 480-50G-F </td></tr><tr><td> Flacons à scintillation </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays

Le pourrissement des grains par moisissures infectant les semences constitue l&#39;un des plus grands défis économiques dans le monde entier à la production de céréales, sans parler des risques graves pour la santé humaine et animale. Parmi la production céréalière, le maïs est sans doute la culture la plus touchée, en raison de pertes dues à des agents pathogènes dans l&#39;intégrité du grain et de la contamination des semences par les mycotoxines. Les deux mycotoxines les plus répandues et problématiques pour les producteurs de maïs et de la nourriture et les transformateurs d&#39;alimentation sont les aflatoxines et les fumonisines, produite par Aspergillus flavus et Fusarium verticillioides, respectivement. Des études récentes dans moléculaires des interactions plante-pathogène ont montré prometteur dans la compréhension des mécanismes spécifiques associés à des réponses de plantes à l&#39;infection fongique et 1,2,3,4,5,6 contamination par les mycotoxines. Parce que de nombreux laboratoires sont en utilisant des tests du noyau pour étudier les interactions plante-pathogène, il existe un besoin pour une méthode normalisée pour quantifier différents paramètres biologiques, de sorterésultats des différents laboratoires peuvent être contre-interprété. Pour un moyen fiable et reproductible pour des analyses quantitatives sur les semences, nous avons développé des essais du noyau en laboratoire et des méthodes suivantes pour quantifier la croissance fongique, la biomasse, et la contamination par les mycotoxines. Quatre grains de maïs stérilisés sont inoculés dans des flacons en verre avec une suspension fongique (10 6) et incubé pendant une période prédéterminée. Flacons à échantillon sont ensuite sélectionnés pour le dénombrement des conidies par l&#39;analyse de la biomasse hémocytomètre, basée sur l&#39;ergostérol par chromatographie liquide haute performance (HPLC), la quantification aflatoxine en utilisant une méthode AflaTest fluorimètre, et la quantification des fumonisines par HPLC.

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Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.

Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K vues.  Texas A&M University. La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.

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Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonisation de Euprymna scolopes Squid par Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Recherche

Immunologie et infection

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caractérisation des réponses inflammatoires au cours de la colonisation intranasale avec Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolement, la purification et l&#39;étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Histologique Quantification pour déterminer la charge fongiques dans les poumons dans l’aspergillose expérimentale

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...