LPE est un écossais Senior Fellow clinique et reconnaît le soutien de l&#39;Office scientifique en chef (SCD/03). Ce travail a été financé par le Wellcome Trust subvention de projet de LPE (089 930). NARG a été financé par une subvention du Wellcome Trust programme (080 088) et une subvention d&#39;équipement (075 470) (pour DeltaVision), et par une subvention du 7e PC-2007-2013 (SANTÉ-F2-2010-260338-Allfun). Nous tenons à remercier l&#39;Université d&#39;Aberdeen imagerie installation, en particulier Kevin MacKenzie, pour l&#39;appui et des conseils utiles.

1. C. Croissance albicans et Conditions <ol><li> Préparer des plaques de gélose SC-Ura en ajoutant 6,9 g de base azotée de levure sans acides aminés, 1 ml de NaOH 1 M, 10 ml à 1% (p / v) du sel hémisulfate adénine et 20 g d&#39;agar technique (précédemment décrites en détail dans 11). Make up le volume à 900 ml d&#39;eau distillée H 2 O. Autoclave, laisser refroidir la gélose, mais pas assez pour se solidifier, puis ajouter 50 ml stérile 40% de D-glucose et de 50 ml stérile 4% SC-Ura abandon dans des conditions aseptiques. Mélanger, verser dans des boîtes de Pétri et laisser des boîtes de gélose refroidir et se solidifier. Plaques de gélose Boutique à 5 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li><li> Série C. albicans sérotype A, souche CAI4 + CIP10 des stocks glycérol conservés à -80 ° C sur gélose SC-Ura. </li><li> Incuber la plaque à 30 ° C jusqu&#39;à la formation de colonies et la conserver à 5 ° C. </li><li> Culture d&#39;un seul C. albicans colonie dans 5 ml SC-Ura support (recette comme en 1.1, mais sans gélose technique) et incuber une nuit à 30° C, 200 rpm afin de générer phase stationnaire C. albicans. </li></ol> 2. C Coloration albicans Utilisation isothiocyanate de fluorescéine (FITC) <ol><li> Ajouter 10 ul C. albicans culture d&#39;une nuit à 990 ul de PBS (pH 7,4) et d&#39;effectuer un comptage des cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Pour faciliter la visualisation de C. albicans lors de tests de phagocytose, tache 1 × 10 8 C. albicans en utilisant 1 mg / ml dans 0,05 M FITC tampon carbonate-bicarbonate (pH 9,6) pendant 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Pour supprimer FITC non consolidées, se laver C. albicans dans 1 ml de PBS 1 x, centrifugeuse à 3000 xg pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS 1 x. Répétez 3 fois. </li><li> Resuspendre le culot à 1 × 10 6 cellules / ul dans 1 x PBS. </li></ol> 3. Préparation de la Ligne J774.1 macrophages de souris de cellules <ol><li> Maintenir J774.1 macrophages dans le tissu de 75 cm 2des flacons de culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau fœtal (SVF), 200 U / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine à 37 ° C avec 5% de CO 2. La préparation des macrophages primaires est décrit ailleurs en détail 12, 13. </li><li> Grattez J774.1 cellules du flacon de culture tissulaire et transférer dans un tube Falcon de 50 ml. Centrifuger à 600 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml préchauffé milieu DMEM supplémenté. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque 1 × 10 6 J774.1 macrophages dans 2 ml du milieu DMEM additionné dans une boîte d&#39;imagerie à base de verre de 35 mm. Incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Avant d&#39;imagerie, remplacez milieu DMEM supplémenté avec 2 ml de pré-chauffé complété CO 2-indépendant moyenne (avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal (SVF), 200 U / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) contenant 1 uM Lysotracker Rouge MDN-99.</li></ol> 4. Live Video cellulaire phagocytose Microscopie Assay <ol><li> Le choix d&#39;un microscope dépend de ce qui est disponible localement, mais la configuration de microscope devra inclure une phase inversée, une chambre environnementale chauffé à 37 ° C et d&#39;excitation / émission des filtres pour les taches choisies (FITC et TRITC). </li><li> Allumez le chauffe-microscope avant l&#39;expérience et de laisser suffisamment de temps pour la chambre de contrôle de l&#39;environnement se réchauffer à 37 ° C. Le temps nécessaire pour température de la chambre de stabiliser varie en fonction des réglages différents microscope. </li><li> Allumez le microscope et l&#39;ordinateur et charger le logiciel d&#39;imagerie. Montez l&#39;antenne d&#39;imagerie sur la platine du microscope et la mise au point de trouver les J774.1 macrophages. Optimiser l&#39;apparence des images TRITC et DIC en ajustant le pourcentage de lumière transmise et les temps d&#39;exposition. </li><li> Retirer le plat d&#39;imagerie et ajouter 3 × 10 6 FITC teinté C. albicans à til plat. Noter le temps que C. albicans est ajouté à la cuvette. Remettez le plat de la scène et d&#39;optimiser l&#39;affichage des images FITC si nécessaire. Mettre en place une liste de points si nécessaire. </li><li> Commencer lorsque tous les points d&#39;imagerie sont nets et les canaux sont optimisés. Capturez FITC, TRITC images et DIC chaque minute pendant 6 heures. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler. NG est un bénéficiaire de la pension subvention sans restriction de la recherche fondamentale par Gilead Sciences. LE travaille comme consultant pour GSK dans le développement précoce de médicaments.

Voici la méthode pour l&#39;utilisation de la vidéo-microscopie des cellules vivantes pour étudier la phagocytose des macrophages est décrite. Vidéomicroscopie offre de multiples couches d&#39;informations supplémentaires pour l&#39;analyse. Un avantage essentiel est que les données d&#39;absorption peut être générée (à partir d&#39;une seule expérience) pour tout point dans le temps tout au long de la période de 6 heures d&#39;observation. Plus important encore, la méthode décrite permet une analyse différentielle des différentes étapes de la phagocytose. Nous avons, par exemple, montré que les changements dans l&#39;absorption globale de C. glycosylation albicans et des mutants de la morphogenèse par des lignées cellulaires de macrophages et les macrophages primaires peut être une conséquence de l&#39;évolution de la migration des macrophages vers les cellules cibles ou le taux d&#39;immersion fois contact cellule-cellule est établi 7. Il ya un certain nombre d&#39;écueils à éviter lors de la conduite de ces expériences. Tout d&#39;abord, il est très important de s&#39;assurer des conditions environnementales stables tout au long de la procédure expérimentaleDure. Le meilleur moyen est dans une chambre climatique qui est réglé pour les conditions expérimentales plusieurs heures avant de commencer l&#39;expérience. La qualité vidéo est très dépendante des modules sophistiqués qui utilisent des lasers infrarouges pour maintenir automatiquement l&#39;échantillon position z, indépendamment des changements mécaniques ou thermiques, éliminant ainsi la nécessité pour les corrections mise au point manuelle. Compte tenu de la nature étendue de ces expériences, il est important de limiter l&#39;exposition de lumière laser et effets associés photoblanchiment et photoconversion, qui peut être minimisé en utilisant des marqueurs fluorescents hautement, ce qui facilite les temps d&#39;exposition faible. Le protocole de coloration FITC décrit ici est rapide et fiable. Comme FITC est un très lumineuses et stable tache, temps d&#39;exposition faibles sont nécessaires, ce qui le rend idéal pour les longues FITC time-lapse films. Cependant, nous avons l&#39;habitude d&#39;utiliser une variété de taches cibles différentes, y compris calcofluor blanc et colorants PKH ainsi que les organismes marqués. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La plupart de notre travail publié est réalisé en utilisant un microscope à champ large, mais l&#39;exposition peut être diminuée en utilisant un microscope confocal à disque rotatif et dans nos mains ce qui est essentiel pour la microscopie time-lapse vidéo 3D. Au cours de cette étude, les images ont été capturées à des intervalles de 1 min sur un essai de phagocytose 6 heures. L&#39;intervalle entre les images peut être ajustée en fonction du procédé objet de l&#39;enquête. Par exemple, l&#39;intervalle peut être diminué lorsque l&#39;étude des processus rapides tels que le trafic vésiculaire. L&#39;intervalle de temps minimum sera limitée par les spécifications du microscope et de la caméra. Il ya quelques considérations à prendre en compte lors de l&#39;ajustement des synchronisations. Tout d&#39;abord, diminuer l&#39;intervalle entre les clichés se traduira par moins de points peuvent être visualisés et la taille du fichier sera considérablement augmentée. Au contraire, l&#39;augmentation de l&#39;intervalle image trop se faire le film perd la continuité. Cette approche peut être appliquéeen principe, d&#39;étudier d&#39;autres agents pathogènes et l&#39;absorption de la mort des cellules hôtes. Par exemple, nous avons récemment montré que les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris déficientes en sialoadhésine présentent grandement réduit la liaison et la phagocytose des sialylé Campylobacter jejuni 8. Cependant, la taille de la cible est un déterminant important de la faisabilité, comme l&#39;analyse d&#39;images devient de plus en plus difficile avec une réduction de la taille de la cellule cible. Un logiciel sophistiqué d&#39;analyse d&#39;image est essentielle pour l&#39;analyse vidéo microscopie rapide, ce qui devrait aller de pair avec un soutien approprié bioinformatique pour faciliter la génération d&#39;algorithmes pour étudier la migration des cellules individuelles et des populations de cellules entières 7. Vidéo-microscopie des cellules vivantes en combinaison avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image sophistiqué pour l&#39;analyse minute par minute de la migration des macrophages et individuels-C.albicans interactions, offre une perspective unique sur la complexité de C. phagocytose albicans par macrophages. Il ya un énorme potentiel pour élargir ces méthodes pour étudier d&#39;autres agents pathogènes et les phagocytes (cellules dendritiques, les neutrophiles) et de développer la vidéo-microscopie 3D pour l&#39;imagerie interactions cellule-cellule avec plus de détails ou sur des surfaces plus physiologiques tels que des couches de cellules épithéliales et endothéliales. Cette technique fait partie de la prochaine génération d&#39;outils pour l&#39;étude des interactions hôte-pathogène et permettra de générer des informations détaillées spatiale et temporelle sur un large éventail de processus dynamiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Base azotée de levure sans acides aminés </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Sel hémisulfate adénine </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar technique (n ° 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura abandon </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Carbonate de sodium </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> Lysotracker Rouge MDN-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm de verre plats </td><td> AAP </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

Jeu phagocytaire des champignons pathogènes et les microorganismes, plus généralement, peut être considéré comme constitué de quatre étapes distinctes: (i) la migration des phagocytes au site où se trouvent des agents pathogènes, (ii) la reconnaissance du pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) par modèle récepteurs de reconnaissance (PRR), (iii) l&#39;engloutissement de micro-organismes liés à la membrane cellulaire des phagocytes, et (iv) le traitement des cellules englouti dans les phagosomes maturation et la digestion de la particule ingérée. Des études qui évaluent la phagocytose dans son intégralité sont informatifs 1, 2, 3, 4, 5, mais sont limitées en ce sens qu&#39;elles ne sont normalement pas rompre le processus en migration, l&#39;engloutissement et de la maturation du phagosome, qui peut être affectée différemment. En outre, ces études évaluer l&#39;absorption comme un événement unique, plutôt que comme un processus continu et dynamique. Nous avons récemment mis au point des technologies d&#39;imagerie cellules vivantes, et ont combiné ces derniers avec l&#39;analyse génétique fonctionnelle des deuxcellules pathogènes et hôte de créer une plate-forme interdisciplinaire pour l&#39;analyse de la fonction des cellules immunitaire inné et pathogénie des champignons. Ces études ont révélé de nouveaux aspects de la phagocytose qui ne peuvent être observés en utilisant systématiquement l&#39;analyse temporelle des interactions moléculaires et cellulaires entre les phagocytes humains et des champignons pathogènes et les microorganismes infectieux en général. Par exemple, nous avons commencé à définir les éléments suivants: (a) les composants de la surface cellulaire nécessaire à chaque étape du processus de reconnaissance, l&#39;engloutissement et de destruction des cellules fongiques 1, 6, 7, 8, (b) la façon dont la géométrie de surface influe sur l&#39;efficacité de l&#39;absorption des macrophages et le meurtre de la levure et des cellules des hyphes 7, et (c) la façon dont l&#39;engloutissement entraîne une modification du cycle cellulaire et le comportement des macrophages 9, 10. Contrairement aux simples clichés de points de temps, la vidéo-microscopie des cellules vivantes permet une grande variété de cellules hôtes et des agents pathogènes à étudier en tant que continuous séquences plus longues périodes de temps, fournissant des informations spatiales et temporelles sur un large éventail de processus dynamiques, y compris la migration cellulaire, la réplication et le trafic vésiculaire. Ici, nous décrivons en détail la façon de préparer hôte et les cellules fongiques, et de mener des expériences de microscopie vidéo. Ces méthodes peuvent fournir un guide utilisateur pour les études futures avec d&#39;autres phagocytes et les microorganismes.

Ici, nous montrons des résultats représentatifs pour C. absorption albicans par une lignée cellulaire de macrophages murins J774.1 pendant 6 heures une cellule vivante expérience vidéo-microscopie. Figure 1 est un représentant des cellules vivantes film vidéo microscopie, montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Vidéo-microscopie des cellules vivantes permet l&#39;internalisation de C. albicans à être visualisées sans avoir besoin de colorer Candida externe. Cependant, au cours de ces expériences, C. albicans a été coloré avec le colorant sensible au pH FITC (vert), qui est désactivé au cours de l&#39;acidification du phagosome des macrophages, et facilite la confirmation que Candida a été internalisé (figure 1). Pour visualiser l&#39;aide supplémentaire de ingéré C. albicans, les macrophages ont été colorées en utilisant la fluorescence rouge Lysotracker colorant rouge MDN-99, quels compartiments taches acides et sert de marqueur non spécifique de la maturation du phagosome.La figure 2 est une image fixe à partir d&#39;une expérience de cellules vivantes vidéo microscopie et illustre la variation du nombre de C. albicans ingérés par les macrophages J774.1 individuels. Dans cette expérience, 82% des macrophages J774.1 englouti au moins un C. albicans cellule à la fin de l&#39;essai 6 h phagocytose. Dans la figure 3, le nombre de intériorisée C. cellules albicans par des macrophages est signalée. Le nombre moyen de C. albicans repris par des macrophages est de 3,4, mais il est intéressant macrophages peuvent ingérer jusqu&#39;à 16 cellules fongiques. Figure 4 est une séquence d&#39;images fixes à partir d&#39;un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage phagocytant C. cellules albicans, la croissance hyphe avec le macrophage et la lyse des macrophages en fin de compte. Figure 4 illustre le fait que la vidéo-microscopie permet l&#39;analyse des événements qui ont suivi l&#39;embrasement de cellules cibles, à savoir les données peuvent être générés pour le kiLLING des macrophages par C. albicans hyphes en ce qui concerne le nombre et la morphogenèse des cellules cibles ingérés, et le meurtre des macrophages se rapporte à la façon dont la maturation du phagosome qui peuvent être étudiés en temps réel. Figure 1. Cellules vivantes film microscopie vidéo montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Les macrophages sont colorées par le rouge fluorescent Lysotracker colorant rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Les macrophages et C. albicans ont été co-cultivées pendant une période de 6 heures à 37 ° C dans le CO 2-complet indépendant milieu. Les images ont été capturées à des intervalles de 1 min pour 6 heures. Les macrophages peuvent être vus établir contact cellule-cellule avec C. albicans, qui est ensuite suivie par l&#39;absorption de C. albicans dans les phagosomes des macrophages. Les flèches indiquent C. albicans avant l&#39;engloutissement par J774.1 macrophages. Cette vidéo montre également que la fluorescence FITC est QuEnched engloutissement suivante de C. albicans. La barre d&#39;échelle, 10 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figure 2. Variation microscopie vidéo représentative de cellule vivante image fixe représentant le nombre de C.albicans englouties par les macrophages individuels. Macrophages (teinté à l&#39;aide Lysotracker rouge MDN-99) ont été co-cultivées avec FITC teinté C. albicans (vert). Il ya des variations dans le nombre de C. albicans englouti (un nombre à côté d&#39;une flèche indique le nombre de C. albicans englouti), et C. morphologie albicans (levure soit versets hyphes). La barre d&#39;échelle, 20 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figure 3. Graphique montrant le nombre de C. albicans ingérée par J774.1 macrophage murin à la fin de 6 tests de phagocytose h. Les données représentent les 2 expériences indépendantes. Un total de 100 macrophages ont été comptés à partir de 3 champs de chaque expérience, ce qui donne un total de 600 macrophages individuels. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figure 4. Une série d&#39;images à partir d&#39;un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage (M) et C. albicans (C) avant et pendant la reconnaissance (A, B), et pendant et après l&#39;absorption (C, D). C. albicans hyphes continuer à croître dans le macrophage (E, F), ce qui peut entraîner la lyse des macrophages (G). D&#39;autres macrophages sont recrutés au site de rupture et de tentative d&#39;ingérer le libéré C. albicans (H). Les macrophages sont colorées par le rouge colorant fluorescent LysoTracker rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Noter que la coloration FITC est éteint après C. absorption albicans par J774.1 macrophages (C). La barre d&#39;échelle, 10 pm.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes de<em&gt; Candida albicans</emPhagocytose&gt; par les macrophages. Ces méthodes permettent spécifiques au stade de l&#39;analyse de la migration des macrophages, la reconnaissance, l&#39;engloutissement et de la maturation du phagosome et de révéler de nouveaux aspects de la phagocytose.

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K vues.  University of Aberdeen. Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes de Candida albicans par les macrophages. Ces méthodes permettent spécifiques au stade de l'analyse de la migration des macrophages, la reconnaissance, l'engloutissement et de la maturation du phagosome et de révéler de nouveaux aspects de la phagocytose.

Vidéo: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolement, la purification et l&#39;étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

amplification isotherme (LAMP) Essais de boucle médiation pour la détection des espèces spécifiques de<em&gt; Eimeria</em&gt; Qui infectent les poulets

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformation biolistique d&#39;un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique