Nous tenons à remercier les grandes souches cellulaires FACS Centre de Recherche et surtout remercier Jessica Scholes et Felicia Codrea pour leur aide dans le tri cellulaire. Le travail a été financé par le CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, l&#39;American Thoracic Society / MPOC Fondation ATS-06-065, La Fondation Concern, UCLA Jonsson Le Comprehensive Cancer Center SPORE thoracique Cancer Oncology Program / poumon, le cancer de l&#39;Université de Californie coordination de la recherche et du Comité Gwynne Hazen cerise Memorial Laboratories (BG).

Aperçu des étapes 1. Dissection de la trachée 2. Nettoyage de la trachée et le couper 3. Digestion enzymatique et la transformation en suspension cellulaire unique 4. Coloration pour FACS et le tri 5. Le traitement de cellules triées in vivo et in vitro sur des modèles 1. Dissection de la trachée <ol><li> Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de 0,1 mg/0.2 cc de pentobarbital. </li><li> Couper la paroi abdominale, et déplacer l&#39;intestin vers le côté pour exposer l&#39;aorte abdominale et ensuite le disséquer. </li><li> Ouvrez le coffre en coupant à travers la membrane et la paroi thoracique antérieure des deux côtés pour exposer le cœur et les poumons. Continuer la découpe dans le col enlever les glandes salivaires gras et d&#39;exposer la trachée. </li><li> Retirer le thymus et couper le poumon de ses liens ci-dessous et derrière. Separmangé la trachée de l&#39;oesophage par l&#39;insertion d&#39;une pince entre eux puis couper la trachée, à sa partie supérieure la plus au-dessus de sa liaison avec le larynx. Ensuite, maintenez la trachée avec une pince et le disséquer de son attachement et de continuer vers le bas pour l&#39;enlever du cœur et des poumons en bloc. Découpez le coeur et les poumons à proximité du hile pour inclure la plupart des bronches droite et gauche principale. </li><li> Placez la trachée dans une petite boîte de Petri contenant la collecte moyenne sur la glace. </li></ol> 2. Nettoyage de la trachée et Cutting It <ol><li> Sous le microscope de dissection, utiliser une pince pointe très fine (n ° 5) et Vannas ciseaux Tübingen (FST 15003-08 finescience.com) pour nettoyer la trachée à partir de tous les autres tissus qui s&#39;y rattachent. Cela comprend: les ganglions lymphatiques, du nerf laryngé récurrent, la graisse, la glande thyroïde et des autres vaisseaux pulmonaires. La partie supérieure de la trachée nécessite une attention particulière, pour enlever les cartilages du larynx grands sans pour autant compromettre le plus grand groupe de SMGqui est logé entre le cartilage cricoïde et le premier anneau de la trachée cartilagineux (C1) 4. </li><li> Couper la trachée dans la partie supérieure et la partie inférieure entre C4 et C5, puis découpé les deux parties à travers la lumière de la trachée. </li></ol> 3. Digestion enzymatique et Transformation en suspension cellulaire unique (SCS) <ol><li> Incuber la partie inférieure de la trachée dans 1 ml de 16 dispase U dans un tube Eppendorf à température ambiante (RT) pendant 30 min, tel que décrit précédemment 5. Ajoutez ensuite 0,5 mg / ml de DNase I dans du DMEM pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. </li><li> Retirez les trachées digérés dans le milieu de la collecte de frais dans une boîte de Pétri stérile, et de retirer l&#39;épithélium de surface sous la loupe binoculaire. Utiliser une pipette pour transférer le milieu contenant l&#39;épithélium dépouillés dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Isoler l&#39;épithélium dénudé à 1000 xg à 4 ° C. Enlever le surnageant et ajouter 0,1% de trypsine / EDTA et incuber en agitant eTube électronique à un 37 ° C Incubateur agitateur (200 rpm) pendant 30 min. Après l&#39;incubation, avec une pointe de 1000 pi, pipeter de haut en bas pour briser les mottes et forment une suspension cellulaire unique. </li><li> Placer la trachée supérieure dans un tube conique contenant 1 ml de pronase 0,15%. Puis incuber à 4 ° C pendant 4 heures. </li><li> Vortexer doucement le tube, puis placer la trachée dans le milieu de collecte frais et confirmer sous le microscope de dissection qu&#39;il ya un complet détachement de l&#39;épithélium de surface (SE). </li><li> Hachez la trachée avec une paire de ciseaux fins d&#39;ouvrir les compartiments SMG puis incuber pendant une heure de plus dans la pronase à température ambiante sous agitation lente. </li><li> Isoler le tissu trachéal, retirez la pronase, ajouter 0,1% de trypsine / EDTA et incuber à 37 ° C pendant 30 min en agitant comme ci-dessus. </li><li> Passage des cellules digérées, des bouquets et des morceaux restants de glandes à travers des aiguilles 20G, 23G 26G et en utilisant une seringue de 10 ml. Répéter les passages fois plusieurs les uns avec les aiguilles avantdémissionner. Maintenant, la plupart des cellules doit être dans un SCS. </li><li> Filtrer la suspension à travers un filtre 40 uM puis laver le filtre et centrifuger les cellules. Puis reconstituer les cellules dans le volume approprié de milieu, compter les cellules et passer immédiatement à coloration FACS et le tri. Ne laissez pas les cellules à 4 ° C ou sur de la glace pendant plusieurs heures, car nous avons trouvé que cela affecte la viabilité et réduit considérablement la sphère constituant efficacité. </li></ol> 4. Coloration pour FACS et tri <ol><li> Prenez suffisamment de cellules pour préparer les tubes non colorées et unique compensation teinté puis colorer le reste des cellules avec des anticorps primaires, TROP2 chèvre et le rat ITGA6, pendant 15 min à température ambiante. Ensuite laver avec du PBS ou de collecte moyen, dissolvant le surnageant avec beaucoup de soin et de briser le culot cellulaire. </li><li> Colorer avec l&#39;anticorps secondaire approprié, incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 10 minutes, laver et enlever le surnageant et le culot puis casser. </li><li> Sur le FACSARIA, après avoir réglé votre tension et de compensation, porte sur les débris, les cellules très petites, doublets cellulaires et les cellules mortes. Ensuite, la plupart des cellules en provenance du SE devrait être TROP2 positif, tandis que 20-50% des cellules SMG sera TROP2 + 6. </li><li> Réglez votre porte de tri pour TROP2 + + ITGA6 cellules du SE (cellules basales) et pour TROP2 + cellules (+ /-ITGA6 cellules positives) de SMG (cellules des canaux). </li></ol> 5. Traitement cellules triées pour: culture in vitro et in vivo dans le modèle de la 5.1 Dans la sphère vitro formant 5-9 culture <ol><li> Mélanger 100 ul de &quot;Facteur de croissance réduite Matrigel&quot; avec 100 ul de milieu complet 10,11 (voir tableau 1) contenant jusqu&#39;à 50.000 cellules triées puis mettre ce mélange dans la chambre supérieure de 24 et trans-même. Ensuite, mettre 400 ul de milieu complet dans la chambre inférieure et incuber à 37 ° C. Changer le milieu de la chambre basse tous les jours et ajouter supplément de 100 ul de Matrigelchaque semaine ou plus tôt si elle devient mince. </li></ol> 5.2 Dans le modèle in vivo <ol><li> Reconstituer la cellule triée culot dans du milieu complet mélange 1:1 avec matrigel à une concentration de 5.000-10.000 cellules par 50 pl. </li><li> Anesthésier les bénéficiaires C57/BL6 souris. Administrer carprofène (5 mg / kg) subcutaenously comme analgésique. Stériliser et raser le dos, puis faire une incision cutanée longitudinale centrale dans le haut du dos. L&#39;incision doit être assez grand pour identifier le site du coussinet adipeux par injection ainsi que la bulle qui se forme après l&#39;injection. Utilisez le côté non tranchant des ciseaux pour élargir poches entre la peau et l&#39;arrière de la paroi thoracique, des deux côtés afin de maximiser l&#39;accès et la visualisation. </li><li> Identifier le bord interne de l&#39;omoplate en appuyant sur la patte avant de la souris et en arrière pour voir le mouvement omoplate. Prenez 50 ul de la suspension cellulaire dans un 300 seringue d&#39;insuline BD ul et l&#39;injecter dans le coussinet adipeux juste en dedans de l&#39;omoplate et latéraleles vertèbres. Vous devriez être capable de voir une bulle, sinon vous êtes trop profonde. Répétez la même chose de l&#39;autre côté puis clip ou point de l&#39;incision cutanée. Vérifiez souris et donner carprofène (5 mg / kg, SC) une fois par jour pendant 48 h. </li><li> Après 3 semaines, euthanasier les souris avec pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), ouvrez la peau comme ci-dessus et de disséquer le pavé toute la graisse des deux côtés avec une marge de sécurité pour éviter de manquer une structure de tissu qui pourrait avoir été formé et étendu autour. Fixer en PFA et embed dans la paraffine 12. Un soin extrême doit être employée pendant le parage et le découpage du bloc de ne pas contourner ou d&#39;ignorer une structure. La meilleure pratique consiste à couper 40 pm une fois puis couper une tranche 4 pm, placez-le sur une lame de verre et l&#39;examiner au microscope afin de confirmer s&#39;il ya des «structures épithéliales» dans cette partie du bloc ou non. S&#39;il n&#39;y a rien vu, puis coupez une fois de plus et répétez cette étape. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Stripping des trachées de souris se traduira par une trachée dénudée qui est visible par microscopie optique comme indiqué sur la figure 1A. figure 1B montre la vue en fond clair d&#39;une trachée après épithéliale stripping avec glandes sous-muqueuses étant libérés par les tissus et les grappes qui ressemblent à des raisins. Pronase supprime l&#39;épitope ITGA6 et c&#39;est pourquoi les TROP2 cellules des canaux ne peuvent pas être séparés en ITGA6 + et - des populations. Cependant, la dispase, qui préserve l&#39;épitope ITGA6, digère tout l&#39;épithélium de surface et les cellules des canaux même avec des temps d&#39;incubation très courte, et ne peut donc pas être utilisé pour séparer conduit à partir des cellules basales 3. La cytométrie en flux des suspensions de cellules isolées doivent montrer en avant des diagrammes de dispersion dispersion et le côté qui sont représentés dans la figure 2A. Une bonne séparation des cellules du canal du reste, si les cellules trachéales doivent être considérés avec l&#39;anticorps TROP2 en cytométrie en flux pour cellules activées par fluorescence Sorting (FACS) comme on le voit sur ​​la figure 2B. Sphères doit être visible dans le matrigel après environ 1 semaine de culture et sont denses en apparence comme le montre la figure 3. L&#39;efficacité de ce processus est de l&#39;ordre de 1-2% et des cellules individuelles seront toujours présents dans le matrigel et représentent probablement les cellules des canaux des glandes sous-muqueuses qui ne possèdent pas la capacité d&#39;auto-renouvellement. L&#39;injection de cellules souches conduit à des résultats du coussinet adipeux de souris dans la formation de sous-muqueuse glandulaire comme des structures qui sont présentés Figure 4. Ceux-ci sont visibles dans les blocs de même sans coloration H &amp; E. Ceux-ci sont sphériques et possèdent une lumière centrale. Beaucoup de sections doivent être faits par l&#39;intermédiaire du coussinet adipeux afin de ne pas manquer ces structures épithéliales. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Figure 1. Digestion enzymatique de l&#39;épithélium trachéal. Extraction des cellules épithéliales de surface est représenté avec blacflèches k, la suppression des cellules dans les conduits des glandes sous-muqueuses est indiqué par des flèches vertes. Trachées dénudées qui sont visibles au microscope optique sont présentés après 30 min de la digestion dispase et après 4 heures de digestion pronase. <img alt="Figure 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> La figure 2A. I. La cytométrie en flux des suspensions cellulaires simples montrant représentant diffusion vers l&#39;avant et des diagrammes de dispersion secondaires de trachées de souris après décapage surface épithéliale. ii. Représentatifs des parcelles FACS pour TROP2 expression dans les cellules des canaux de trachées de souris. <img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> La figure 2B. I. La cytométrie en flux des suspensions de cellules isolées à partir de l&#39;épithélium de surface dénudée des deux tiers inférieurs de la trachée de souris montrant dispersion représentant l&#39;avant et des diagrammes de dispersion secondaires. ii. Typique parcelle FACS de l&#39;expression dans ITGA6 surface épithélium. iii. Un autre tracé représentatif FACS de l&#39;avant et la diffusion latérale de l&#39;épithélium de surface montrant retour déclenchement de la population cellulaire basale en vert. iv. ITGA6 typique et TROP2 population de cellules exprimant en vert. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Figure 3. Évolution dans le temps de développement des sphères. A. sphères conduits. Sphères doit être visible dans le matrigel après environ 1 semaine dans la culture et la quasi-totalité sont denses en apparence. Les cellules individuelles qui ne font pas sphères sont également observées. (Échelle = 50 pm). B. sphères basales sont plus grandes et luminale en apparence. Les cellules individuelles qui ne font pas sphères sont également observées. (Échelle = 50 pm). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;injection de cellules souches conduit à des résultats du coussinet adipeux de souris dans la formation de sous-muqueux glande structures semblables. Structures représentativessont présentés dans le coussinet adipeux et certains sont présentés production de mucine (bleu clair) avec le bleu Alcian acide périodique Schiff tache.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette technique conduit à isoler des cellules basales et des voies respiratoires est importante pour améliorer notre compréhension de la réparation des voies respiratoires et de la régénération et de maladies des voies respiratoires. Les techniques décrites ici sont quelques critiques. La première est la période de digestion enzymatique optimisé. Le second est la création d&#39;une suspension cellulaire unique à travers passage en série avec des aiguilles de jauge progressivement plus élevés pour éviter...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Milieu complet 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090 CV- </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium (3,6 mm ou 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamine (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 Cl- </td></tr><tr><td> Pénicilline (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomycine (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B (0,25 pg / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> EnSulin (10 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrine (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> La toxine du choléra (0,1 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Le facteur de croissance épidermique (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Extrait pituitaire bovin (30 pg / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (5%) </td><td> Pêcheur </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> L&#39;acide rétinoïque (0,05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Facteur de croissance réduit Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Remplissez composantes médias. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td&gt; <td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Utilisé à 0,15%: -O / n à 4 ° C pour isoler la digestion nombre total de cellules trachéales (pour la culture ALI) -4 Digestion h 4 ° C pour isoler SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Utilisé à 16 unités: 30 min à température ambiante </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Utilisé à raison de 0,5 mg / ml: 20-30 min à température ambiante </td></tr></tbody></table> Les enzymes du tableau 2. Utilisée pour la digestion enzymatique de la trachée.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

Les grandes voies aériennes sont directement en contact avec l&#39;environnement et donc vulnérables aux blessures des toxines et des agents infectieux qui nous souffle dans 1. Les grandes voies aériennes exigent donc un mécanisme de réparation efficace pour protéger nos corps. Ce processus de réparation se produit à partir de cellules souches dans les voies respiratoires et d&#39;isoler ces cellules souches à partir des voies respiratoires est importante pour comprendre les mécanismes de réparation et de régénération. Il est également important pour la compréhension de réparation anormale qui peut conduire à des maladies des voies respiratoires 2. Le but de cette méthode est d&#39;isoler une population de cellules souches roman de la souris conduits des glandes sous-muqueuses trachéales et de placer ces cellules in vitro et dans des modèles in vivo pour identifier les mécanismes de réparation et de régénération des glandes sous-muqueuses 3. Cette production présente des méthodes qui peuvent être utilisées pour isoler et doser les cellules souches conduit et de la base de la grande voies respiratoires 3. Cela nous permettrapour étudier les maladies des voies respiratoires, comme la fibrose kystique, l&#39;asthme et la bronchopneumopathie chronique obstructive. À l&#39;heure actuelle, il n&#39;existe pas de méthodes d&#39;isolement des cellules des glandes sous-muqueuses conduit et il n&#39;y a pas de modèles in vivo pour étudier la régénération des glandes sous-muqueuses.

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Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Ici, nous démontrons notre protocole pour l&#39;isolement de cellules basales et sous-muqueuse du canal de la glande trachées de souris. Nous démontrons également la méthode de l&#39;injection de cellules souches dans le coussinet adipeux de souris dorsale de créer un<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de régénération glande sous-muqueuse.

Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K vues.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Ici, nous démontrons notre protocole pour l'isolement de cellules basales et sous-muqueuse du canal de la glande trachées de souris. Nous démontrons également la méthode de l'injection de cellules souches dans le coussinet adipeux de souris dorsale de créer un In vivo Modèle de régénération glande sous-muqueuse.

Vidéo: Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Recherche

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

L&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d&#39;embryon de souris

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolement des cellules immunitaires des tumeurs primitives

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...