Nous remercions Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa et Markus Manz pour obtenir des conseils précieux. Ce travail a été financé par la National Science Foundation suisse, la Ligue suisse contre le cancer et la Fondazione per la Ricerca tessinois sul Cancro.

1. Préparation de la suspension cellulaire de la moelle osseuse <ol><li> Euthanasier la souris et placer l&#39;animal dans une casserole inox et de l&#39;éthanol de pulvérisation de 70% sur son abdomen et le dos. Recueillir fémur et le tibia de pattes de derrière, et la colonne vertébrale. </li><li> Précision enlever tous les résidus des tissus mous de la colonne vertébrale avec des ciseaux pointu et à partir d&#39;os des jambes avec une gaze. Os magasin dans un tube Falcon de 50 ml avec 30 ml de milieu RPMI contenant 10% inactivé par la chaleur de sérum bovin foetal (FBS), supplémenté avec 50 β-mercaptoéthanol uM, 100 uM MEM non-acides aminés essentiels, 1 mM pyruvate de sodium MEM, 2 mM de L-glutamine, 100 pg / ml de streptomycine et 100 U / ml de pénicilline. </li><li> Couvrir le fond d&#39;un mortier préalablement stérilisé avec des filtres stériles. </li><li> Transfert des os dans le mortier et les couvrir d&#39;une couche de filtres afin d&#39;assembler une surface de frottement. </li><li> Préparer un tube de 50 ml Falcon équipé d&#39;un filtre Falcon. </li><li> Brisez les osà l&#39;aide d&#39;un pilon jusqu&#39;à obtention d&#39;une suspension cellulaire homogène. </li><li> Transférer la suspension dans le tube. </li><li> Ajouter au mortier 5 ml de milieu RPMI complet frais à laver et à récolter les cellules restantes. </li><li> Répétez les deux derniers points jusqu&#39;à ce que les os homogénéisés semblent claires. </li><li> Transférer et filtrer dans un nouveau tube de la suspension cellulaire en vue d&#39;éliminer les débris de tissu restant. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 rpm pendant 5 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot cellulaire. </li></ol> 2. Analyse phénotypique <ol><li> Remettre en suspension et laver les cellules de souris individuelles dans 15 ml de PBS et 2% FBS. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 rpm pendant 5 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot. </li><li> Suspendre le culot dans 5 ml de PBS et 2% de FBS et les cellules de comptage. </li><li> Transfert 1 × 10 6 cellules / puits dans un fond de 96 puits rondPlaque. </li><li> Centrifuger la plaque à 1500 rpm pendant 5 min. </li><li> Préparer un mélange d&#39;anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface suivantes. Diluez-les comme indiqué dans le PBS et 2% de FBS pour colorer les cellules. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugués à PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit conjugué à APC 1:100 </li><li> SCA1 conjugué à la biotine 1:50 </li><li> CD34 conjugué à 1:50 FITC </li><li> FcγR conjugué à PE 1:100 </li><li> IL-7R conjugué à PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li> Jeter le surnageant et ajouter 50 ul de mélange anticorps monoclonaux à chaque puits. Dissocier dans des cellules individuelles par pipetage. </li><li> Incuber les cellules pendant 20 min dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 150 ul de PBS et 2% de FBS. </li><li> Centrifuger la plaque à 1500 rpm pendant 5 min et éliminer le surnageant par retournement de la plaque. </li><li> Diluer la streptavidine dans du PBS et 2% de FBS, comme indiqué à colorer les cellules. <ul type="disc"><li> Streptavidin conjuguégated à APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Ajouter 50 ul de la solution dans chaque puits. Dissocient en suspension cellulaire unique par pipetage. </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 150 ul de PBS et 2% de FBS. </li><li> Centrifuger la plaque à 1500 rpm pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS et 2% FBS. </li><li> Acquérir des échantillons à FACS. </li></ol> 3. Enrichissement magnétique de c-Kit + Cellules <ol><li> Préparer une solution tampon contenant du PBS, pH 7,2, 0,5% d&#39;albumine sérique bovine (BSA), et 2 mM d&#39;EDTA. </li><li> Remettre en suspension le culot de cellules de moelle osseuse de dérivé d&#39;au moins 10 souris dans 1 ml de solution tampon contenant c-kit conjugué à APC Acm diluée 1:50. </li><li> Incuber les cellules pendant 20 min dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Laver deux fois les cellules avec 40 ml de solution tampon. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 rpm pendant 5 min et retirez soigneusement til surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot. </li><li> Resuspendre culot cellulaire et ajouter 50 ul d&#39;anticorps anti-APC Microbilles pour chaque souris euthanasiés directement à la pastille. </li><li> Bien mélanger et incuber pendant 20 min dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 40 ml de solution tampon et centrifuger à 1500 rpm pendant 5 min. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Resuspendre culot cellulaire dans multiple de 4 ml de solution tampon tous les trois souris euthanasié. </li><li> Placer les colonnes LS MACS dans le champ magnétique d&#39;un séparateur approprié MACS. Utilisez la colonne 1 tous les trois souris euthanasié. </li><li> Préparer les colonnes d&#39;un rinçage avec 4 ml de solution tampon. </li><li> Appliquer suspension cellulaire sur les colonnes. </li><li> Recueillir cellules non marquées qui traversent et laver la colonne avec 4 ml de solution tampon. Effectuer les étapes de lavage en ajoutant 4 ml de solution tampon à trois reprises. Ajouter un nouveau tampon lorsque le réservoir de la colonne est vidée. </li><li> Supprimer les colonnes du séparateur et place chacun au-dessus de 15 tubes de faucon mL. </li><li> Introduire à la pipette 4 ml de solution tampon sur chaque colonne. Rincer immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant le piston dans la colonne. </li><li> Centrifuger les tubes à 1500 rpm pendant 5 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. </li><li> Remettre en suspension chaque culot avec 1 ml de solution tampon et de boulettes de groupe dans un seul tube Falcon de 15 ml. </li></ol> 4. Le tri des cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs engagés Lineage <ol><li> Préparer un mélange d&#39;anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface suivantes. Diluez-les comme indiqué dans 500 ul de PBS et de 2% FBS pour colorer les cellules. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugués à PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit conjugué à APC 1:100 </li><li> Sca-1 conjugué à la biotine 1:50 </li><li> CD34 conjugué à 1:50 FITC </li><li> FcγR conjugué à PE 1:100 </li></ul></li><li> Centrifuger le tube de la previoula section s à 1500 rpm pendant 5 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. </li><li> Ajouter le mélange anticorps monoclonaux dirigés contre le culot. Dissocient en suspension cellulaire unique par pipetage. </li><li> Incuber les cellules pendant 20 min dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Laver deux fois les cellules avec 14 ml de PBS et 2% FBS. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 rpm pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li><li> Diluer la streptavidine comme indiqué dans 500 ul de PBS et 2% de FBS pour colorer les cellules. <ul type="disc"><li> Streptavidine conjuguée à APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Ajouter la solution au tube. Dissocient en suspension cellulaire unique par pipetage. </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Laver deux fois les cellules avec 14 ml de PBS et 2% de FBS. </li><li> Centrifuger le tube à 1500 rpm pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 500 ul de PBS et 2% FBS. </li><li> Transfert et de filtrer la suspension de cellules dans un tube de 5 ml nouvelle pour EliMINATE agrégats cellulaires qui peuvent interférer avec la procédure de tri. </li><li> Ajouter 5 pi de 7-AAD (l&#39;utiliser dilué 1:100) à la suspension cellulaire afin d&#39;exclure 7-AAD + cellules mortes des populations triées. </li><li> Trier les cellules avec un FACSAria BD selon les phénotypes suivants: <ul type="disc"><li> Cellules LKS: LIN - c-Kit + Sca-1 + </li><li> LT-HSC: LKS CD34 - </li><li> ST-HSC: LKS CD34 + </li><li> BPF: lin - c-Kit + Sca-1 faible FcγR haute CD34 + </li><li> Les députés: lin - c-Kit + Sca-1 faible FcγR faible CD34 - </li><li> CMP: lin - c-Kit + Sca-1 faible FcγR faible CD34 + </li></ul></li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 1 montre et l&#39;exemple de la procédure de déclenchement électronique àmarquer communes progéniteurs lymphoïdes (CLP) que Lin - / c-Kit lo / interleukine (IL)-7R + de cellules; Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) et Lin - / c-Kit + / Sca -1 lo (c-kit +) des cellules; de la c-Kit + porte, progéniteurs myéloïdes communs (CMP) sont identifiés comme FcγR lo cellules CD34 +, les progéniteurs des granulocytes / monocytes (BPF) FcγR hi cellules CD34 + et mégacaryocytes / progéniteurs érythrocytaires (députés) que FcγR lo CD34 - cellules; de la porte LKS, LT-HSC et ST-HSC sont identifiés comme CD34 - et CD34 + cellules, respectivement. Cette suspension cellulaire de la moelle osseuse peut être enrichi pour le c-Kit + cellules avec des billes magnétiques (Fig. 2); LT-HSC et ST-HSC peuvent ensuite être triés en fonction de CD34 expression, ainsi que d&#39;autres progéniteurs selon le phénotype décrit ci-dessus. CSH peuvent être analysées<html> lysées dans la microscopie confocale imagerie en temps réel comme le montre la figure 4, où CD34 - cellules ont été colorées avec le composé de fixation des nucléotides quinacrine 11 ainsi que l&#39;énergie nucléaire rouge (DRAQ5). Dans les CSH, mais pas les BPF, la quinacrine-positifs vésicules sont visibles dans les 12 cytoplasme. En outre, les CSH triés peuvent être utilisés dans des expériences fonctionnelles comme le montre la figure 5, qui montre l&#39;augmentation de la Ca 2 + cytosolique dans LT-HSC par l&#39;activation des récepteurs purinergiques P2 lors de l&#39;exposition à l&#39;adénosine-triphosphate (ATP) et de l&#39;ionomycine 12. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> Figure 1. Analyse Représentant dot plot de Lin-BM cellules. Procédure de déclenchement électronique au cytomètre de flux pour identifier et marquer des progéniteurs hématopoïétiques et cellules souches hématopoïétiques à partir de suspension cellulaire de la moelle osseuse colorées comme décrit dans le texte du protocole. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Un schéma pour l&#39;enrichissement sélectif de c-Kit + cellules de la moelle osseuse. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> Figure 3: Analyse du cycle cellulaire de la voie électronique LKS gated CD34 -. CSH dans les contrôles sains et les souris atteintes d&#39;une MII colorées avec Ki-67 anticorps et DAPI. Les cellules ont été fixées et perméabilisées avec Lyse / Fix et Perm tampons suivie d&#39;une coloration avec les verbes conjugués au FITC Ki-67 et DAPI à 1 ug / ml. Cyclisme cellules sont à peine voire pas du tout détectable dans le LKS CD34 - compartiment CSH des contrôles sains âgés de 12. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . Figure 4 Live microscopie imagerie confocale de la FACS triés CD34 - CSH et les BPF colorées avec la quinacrine composé de fixation des nucléotides et le nucléaire rouge (DRAQ5). Les quadrants petits montrent pos quinacrinevésicules itive détecté dans le cytoplasme des cellules souches hématopoïétiques, mais pas les BPF. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> Figure 5. Ca 2 + cytosolique des élévations de CSH triés chargés de Fura-2 et stimulées par l&#39;ATP et de l&#39;ionomycine. Traces partir de cellules uniques sont présentés. Toutes les cellules étaient sensibles à l&#39;ATP extracellulaire montrant augmentation importante dans Ca 2 + cytosolique après addition de l&#39;ATP.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode décrite ici permet une analyse rapide et précise de l&#39;hématopoïèse chez la souris individuels (Figure 1). Cette analyse dans divers contextes expérimentaux, y compris des modèles murins de l&#39;inflammation, l&#39;auto-immunité, l&#39;immunodéficience, les maladies dégénératives, les troubles métaboliques et du cancer, permet l&#39;adressage de l&#39;impact des conditions pathologiques sur l&#39;hématopoïèse. La figure 3 montre l&#39;analyse de l&#39;act...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Crépine portable 40 pm </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Solution de coloration 7-AAD </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix tampon </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Perm tampon III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53 à 6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBioscirence </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC Microbilles </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> Colonnes LS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

La moelle osseuse est le site principal où les CSH et progéniteurs plus matures du sang lignée de cellules résident et de se différencier dans un organisme adulte. CSH constituent une population de cellules minute de cellules pluripotentes, capables de générer toutes les lignées de cellules sanguines pour une durée de vie 1. La dissection moléculaire de l&#39;homéostasie CSH dans la moelle osseuse a des implications importantes dans l&#39;hématopoïèse, l&#39;oncologie et la médecine régénérative. On décrit le protocole de marquage avec des anticorps fluorescents et la procédure de déclenchement électronique de cytométrie de flux à marquer sous-ensembles progénitrices hématopoïétiques et de distribution CSH chez la souris individuels (fig. 1). En outre, nous décrivons une méthode pour enrichir largement progéniteurs hématopoïétiques ainsi que à long terme (LT) et à court terme (ST) de reconstituer les CSH à partir de suspensions de cellules de moelle osseuse regroupées par enrichissement magnétique des cellules exprimant c-Kit. Préparation cellulaire obtenu peut être utilisé pour trier des sous-ensembles sélectionnés pour in vitro etin vivo des études fonctionnelles (Fig. 2). Les deux ostéoblastes trabéculaires 2,3 et 4 endothélium sinusoïdal constituent des niches fonctionnelles de soutien CSH dans la moelle osseuse. Plusieurs mécanismes de la niche ostéoblastique, y compris un sous-ensemble de N-cadhérine + de 3 ostéoblastes et l&#39;interaction de l&#39;Tie2 récepteur tyrosine kinase exprimée en CSH avec son angiopoïétine-1 ligand 5 accord pour déterminer la quiescence CSH. &quot;Hibernation&quot; dans la moelle osseuse est cruciale pour protéger les CSH de la réplication et l&#39;épuisement éventuel sur l&#39;activité vélo excessive 6. Stimuli exogènes agissant sur ​​les cellules du système immunitaire inné comme ligands du récepteur Toll-like 7 et l&#39;interféron-alpha 6 peut également induire la prolifération et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques dans la lignée progéniteurs engagés. Récemment, une population de cellules souches hématopoïétiques de souris dormants dans le lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - la population a été décrite 8. Le tri des cellules CD34 sur la base de l&#39;expression de la suspension cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques enrichi tel que décrit ici permet l&#39;isolement de deux repos d&#39;auto-renouvellement LT-HSC et ST-HSC 9. Une procédure similaire basée sur l&#39;épuisement des lignées de cellules positives et de tri de LT-HSC avec CD48 et FLK2 anticorps a été décrit précédemment 10. Dans le présent rapport, nous fournir un protocole pour la caractérisation phénotypique et ex vivo du cycle cellulaire analyse des progéniteurs hématopoïétiques, qui peuvent être utiles pour surveiller l&#39;hématopoïèse dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. En outre, nous décrivons un tri par FACS procédure de CSH, qui peuvent être utilisés pour définir les facteurs et les mécanismes régissant leur auto-renouvellement, l&#39;expansion et la différenciation en biologie cellulaire et des dosages de transduction du signal, ainsi que pour la transplantation.

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d&#39;isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d&#39;isolement est essentiellement basée sur l&#39;enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

phenotypic-analysis-isolation-murine-hematopoietic-stem-cells-lineage

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18.5K vues.  Bellinzona (Switzerland). Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Vidéo: Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

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Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

L&#39;isolement des premiers cellules souches hématopoïétiques de murin sac vitellin et AGA

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

L&#39;isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...